CURSO 2021/2022

TEMA 3 TÉCNICAS DE RADIOFAR

RADIOFARMACIA

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 1

Otilia Orihuela Elejabeitia

 APLICACIÓN
ACIÓN DE TÉCNICAS DE
RADIOINMUNOANÁLISIS
1. APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE RADIOINMUNOANÁLISIS
Gran parte del progreso alcanzado por la biología y la medicina actuales se debe al
perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los
procedimientos basados en las reacciones inmuno inmunológicas ha representado un
importante avance en el análisis de las sustancias de interés biológico, difíciles de medir
empleando los métodos bioquímicos habituales. Dentro de los procedimientos
inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la
unión antígeno-anticuerpo
anticuerpo (Ag
(Ag-Ac).. Existen diversos métodos basados en
procedimientos distintos para visualizar la unión AgAg-Ac. El RIA es uno de los principales y
permite el análisis cuantitativo de sustancias biológicas (proteínas séricas, hormonas y
otras de índole variada, como ácido fólico, vitamina B12, eritropoyetina, interferones,
endorfinas, etc.) que se encuentran en muy baja concentración (del orden de los ng/ml o
pg/ml) en diversos fluidos biológicos (sangre, o orina, saliva, etc.).

Combina la especificidad de las reacciones inmunes (reacción entre antígeno Ag y

anticuerpo Ac) y la sensibilidad de los métodos radioisotópicos.

PRINCIPALES MÉTODOS ANALÍTICOS BASADOS EN LA UNION Ag Ag-Ac

Método de detección Denominación
- Técnicas
cnicas de precipitación propiamente dicha
- Técnica de difusión radial de Ouchterlony
Técnicas de precipitación - Técnica de inmunoelectroforesis
- Técnica de difusión radial simple de Mancini
Técnicas de aglutinación - Técnicas de inmunoaglutimación (hemaglutinación
directa e indirecta y otras técnicas con látex, etc.)
Técnica de inmunofluorescencia - Técnicas inmunoflorimétricas y citometría de flujo
Cromatografía de afinidad
Inmunoprecipitación e inmunoblotting
- Técnicas nefelométricas

2. CONCEPTO Y FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LOS INMUNOANÁLISIS

El radioinmunoanálisis (RIA) fue desarrollado de forma simultánea por Yalow y Berson en
Estados Unidos y Ekins en Inglaterra a finales de los años 50 del pasado siglo xx.

Previamente, Ekins había desarrollado el concepto de

análisis de saturación en el que la cantidad de una
sustancia problema se hace reaccionar con una cantidad
limitada de un reactivo con el que se combina de forma
específica, de tal forma que el reactivo es saturado por la
sustancia problema quedando una parte sin reaccionar.
De esta forma, tras la reacción, la sustancia problema
queda en parte en una forma combinada y otra no
TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 2
 combinada o libre que se encuentran en una determinada proporción, dependiendo de la
cantidad inicial de sustancia problema.

La proporción en que se encuentran ambas fracciones no se determina directamente, sino

que se hace utilizando una pequeña cantidad de sustancia marcada que reacciona de forma
similar con el reactivo y cuya dis
distribución
tribución en forma combinada o libre permite calcular la
proporción en que estas se encuentran.

Como reactivo de unión específica se pueden utilizar distintas sustancias (proteínas,

anticuerpos, receptores citoplasmáticos, receptores de membrana celular, etc.) que
permiten desarrollar, utilizando además una sustancia marcada, diversos tipos de pruebas
analíticas denominadas respectivamente análisis proteico competitivo,
radioinmunoanálisis, análisis de radioligadura y análisis de radiorreceptores
radiorreceptores.

Posteriormente, en 1968 y ante la posibilidad de marcar el anticuerpo sin alterarlo, Miles

desarrolló una modalidad de RIA, denominado análisis inmunorradiométrico (IRMA), en
el que la proteína de enlace es un anticuerpo, está marcado (Ac*) y se añade en eexceso. De
tal forma que, tras la reacción con la sustancia problema, la fracción que no ha reaccionado
es separada y se determina la actividad de la fracción restante.

A partir del desarrollo del RIA original hubo una verdadera revolución en el desarrollo de
inmunoanálisis sensibles y ultrasensibles, empleando isótopos o sin utilizarlos, que en la
actualidad han devenido en una amplia variedad de sistemas de inmunoanális
inmunoanálisis, cuya base
común está en la utilización de anticuerpos como reactivo analítico específico
específico.

Los inmunoanálisis pueden subdividirse en dos clases principales:

 Tipo I:: se emplea un exceso de anticuerpo sobre el elemento analizado y se marca el
anticuerpo reactivo.

 Tipo II:: la cantidad de anticuerpo es menor que la del elemento analizado

ana y se
marca la sustancia analizada
analizada.

Los inmunoensayos pueden ser:

 Homogéneos, si el compuesto marcado se comporta de forma diferente según esté
libre o ligado y, por tanto,
anto, no es necesaria la separación física de las dos fracciones.
 Heterogéneos, si es necesaria la separación de fracciones, al no comportarse de
forma diferente.

Métodos inmunoanalíticos análogos al RI

RIA,
A, pero utilizando marcadores enzimáticos (o
sus sustratos), compuestos fluorescentes, compuestos luminiscentes o
quimioluminiscentes sobre el analizado o el anticuerpo han dado lugar a una amplia
variedad de inmunoensayos denominados enzimoinmunoanálisis (ElA) o análisis
inmunoenzimático (IEMA), fluoroinmunoanálisis (FIA), luminoinmunoanálisis (LIA) o
quimioluminoinmunoanálisis ((QIA), respectivamente.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 3

 En el RIA existen dos
categorías:
radioinmunoanálisis
(RIA) competitivo y
ensayo
inmunorradiométrico o
IRMA.

El primero es un
inmunoensayotipo II que
sigue la ley de acción de
masas que especifica las
relaciones entre la
sustancia problema y el
anticuerpo. Los análisis
inmunorradiométricos
(IRMA) son
inmunoensayos de tipo I.

3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LOS RADIOINMUNOANÁLISIS

El principio en el que se basa el RIA competitivo, directo, clásico o en equilibrio es el
siguiente: una cantidad desconocida de sustancia, denominada ligando nativo (L),(L) que en
RIA se corresponde con la sustancia antigénica presente en la muestra que hay que
determinar, y una cantidad conocida de la misma sustancia antigénica pero marcada con el
radioisótopo, denominada ligando marcado (L*) o trazador,, compiten por una limitada
l
cantidad de anticuerpos específicos (Ac) contra los antígenos.

Después de una incubación, y de acuerdo con la ley de acción de masas, se establece el

equilibrio entre las distintas fracciones de ligando nativo no marcado (L), ligando marcado
(L*),, ligandos nativos unidos a anticuerpos (L
(L-Ac)
Ac) y ligandos marcados unidos a
anticuerpos (L*-Ac)
Ac) y anticuerposlibres (Ac) según muestra la reacción siguiente:
siguiente

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 4

 Después de separar los ligandos unidos (L (L-Ac + L*-Ac) (bound,, B) de los ligandos libres (L +
L*) (free,, F), se determina la relación existente entre ellos (B/F). Con cantidades constantes
de ligandos marcados (L*) y de anticuerpos (Ac), la fracción de ligandos marcados unidos a
anticuerpos (L*-Ac) Ac) es tanto más pequeña cuan
cuanto
to más elevada sea la concentración
co de
ligando nativo (L) que exista en la muestra. Por comparación con diferentes estándares
(curva de calibración) puede determinarse la cantidad desconocida de la sustancia
problema.

Como variantes del RIA competitivo encontramos los RIA de no equilibrio: RIA secuencial
y RIA de desplazamiento.. El primero se realiza en dos pasos: primero se incuba el ligando
nativo (L) con el anticuerpo (Ac) en exceso, y después el ligando marcado (L*) para
completar la saturación del Ac. En el segundo método, se incuba el ligando marcado (L*)
con el anticuerpo (Ac) y posteriormente se añade el ligando nativo (L) que desplaza al
ligandoo marcado del complejo.

En el RIA
A clásico, la radiactividad presente en el complejo Ag
Ag-Ac*
Ac* (B) es inversamente
proporcional a la cantidad de ligando nativo (L) o Ag de la muestra.

En el caso del IRMA, el ligando nativo (L) reacciona con dos anticuerpos (Ac1 y Ac2) que se
fijan a distintas
tas partes (epítopos) del antígeno. Uno de los Ac generalmente está fijado a un
soporte sólido (tubo, bolita) (Ac1) para facilitar la posterior separación de la fase unida o
ligada, y el otro es el que está marcado (Ac2*). Después de una incubación se prod
produce la
reacción siguiente:

Como variantes del IRMA tenemos el IRMA MA competitivo o de inhibición y el IRMA no

competitivo tipo sándwich
sándwich.. En el primero, el Ag está unido al tubo de reacción, y al añadir
tanto la muestra como el Ac*, se produce la competición entre los Ag por el Ac*, formándose
dos tipos de complejos, el Ac*
Ac*-Ag del tubo y el Ac*- Ag de la muestra. De tal forma que, tras
el lavado, la actividad del complejo en fase sólida (B) es inversamente proporcional a la
cantidad de ligando nativovo (L) de la muestra. En el segundo método, se dispone de un Ac
unido en fase sólida (Ac1), y al añadir el Ag de la muestra y un segundo anticuerpo marcado
(Ac2*), se formaran tantos complejos Ac1Ac1-Ag-Ac2*
Ac2* como sean posibles, y la actividad
presente en el tubo
ubo tras el lavado (B) será directamente proporcional a la cantidad de
ligando nativo (L) existente en la muestra.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 5

 4. RECEPCIÓN, CONSERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS
BIOLÓGICAS
Todo proceso analítico se compone, en principio, de tres fases:: (1) toma de muestra, (2)
proceso analítico propiamente dicho y (3) comprobación de los resultados analíticos.

La primera fase sirve para obtener una muestra aleatoria (cantidad parcial) que puede
aceptarse como representativa del espécimen, que es el material
aterial liquido, sólido o gaseoso
que se envía al laboratorio para su análisis. Por otro lado, se entiende por muestra la parte
del espécimen que se utiliza para el análisis.

Cada técnica analítica necesita que la muestra reúna una serie de condiciones.
condiciones Por ello, se
debe conocer qué tipo de muestra (sangre completa, plasma, suero) es necesaria para una
determinación dada, la cantidad y las condiciones de extracción y conservación.

En los análisis de RIA la toma de muestra será, habitualmente, la extracción de sangre,

sangre
que se hará mediante venopunción y, en algunas ocasiones, la recogida de orina;
orina y la
muestra, la mayor parte de las veces, debe ser de suero o plasma y, algunas veces, de orina.

Podemos decir que el plasma es la “sangre” a la que le hemos quitado las células
sanguíneas, mientras que el suero es la “sangre” a la que se le han quitado las células
sanguíneas y el fibrinógeno, ya que se ha dejado coagular. Por tanto, para obtener el plasma
hace falta que, al extraer la sangre, se añada u
un anticoagulante (oxalato,
oxalato, citrato o
heparina) al tubo de recogida y, posteriormente, separar los dos componentes mediante
centrifugación.. Para obtener el suero hay que dejar que la sangre extraída se coagule en el
tubo de recogida y, posteriormente, proce
proceder
der a separar los dos componentes mediante
centrifugación. Una vez separado el suero o el plasma, debemos extraerlo mediante
aspiración para colocarlo en tubos de ensayo identificados para su análisis o conservación.

La conservación del material de exameexamen n es un problema difícil para un laboratorio. El

suero y el plasma pueden conservarse hasta 24 horas,, sin que se presenten modificaciones
significativas, si se hace a 4°C
C y con el recipiente cerrado. En caso de que las muestras de
suero o plasma pretendan conservarse durante más de 24 horas se deben congelar, ya que
en caso contrario, hay que contar con el desarrollo bacteriano y la propia degradación de la
muestra.

Una vez que las muestras han sido preparadas y almacenadas quedarán congeladas hasta
que se vaya realizar el proceso analítico. Para realizar este habrá que descongelar las
muestras para que estén en estado líquido y a temperatura ambiente en el momento de su
utilización. Hay que recordar que todo material de examen que llega al laboratorio es
está
potencialmente infectado y constituye un foco de riesgo para el personal. Por ello, como
principal medida preventiva solo puede recomendarse la máxima limpieza, el uso de
guantes y la prohibición de comer y beber en el laboratorio.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 6

 5. REACTIVOS PRINCIPALES: ANTICUERPOS, TRAZADORES,
CALIBRADORES Y MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE LAS FRACCIONES
UNIDA Y LIBRE
De lo expuesto hasta ahora es fácilmente deducible que eenn la ejecución práctica de un RIA
RI
necesitamos una serie de reactivos o componentes básicos que, aparte de la muestra, son el
trazador, el anticuerpo,, los estándares que constituyen la curva de calibración y los
reactivos para efectuar la separación de la fracción libre de la unida, una vez desarrollada
la reacción.

5.1. EL LIGANDO NATIVO (L (L)

Hasta ahora, cuando nos hemos referido al ligando nativo lo hemos hecho en referencia a
la sustancia a determinar. A partir de ahora, al utilizar esta denominación nos referiremos,
por un lado, a la sustancia que queremos determinar en la muestra (Lm) y, por otro, a los
patrones o estándares (Lp) que nos van a permitir construir la curva de calibración del
ensayo y, por tanto, conocer la cantidad de sustancia analizada presente en la muestra.

En relación con el ligando nativo (Lm) presente en la muestra, no vamos a repetir lo

indicado previamente en relación con la muestra, aunque sí conviene añadir ahora que, en
ocasiones, las muestras (suero, plasma, orina) no pueden ser utilizadas directamente en el
ensayo y deben ser sometidas a unos procesos previos
previos,, como extracción del ligando
deseado (por ejemplo, en la determinación de la 11-25-hidroxi-vitamina
vitamina D) o hidrolización
de la orina (por ejemplo, en la determinación de aldosterona en orina). Los patrones o
estándares (Lp) son soluciones de concentraciones conocidas frente a las que se van a
comparar las muestras y a las que se va a some
someter al mismo proceso que a las muestras.

5.2. EL LIGANDO MARCADO (L*)

Como hemos visto previamente, en el RIA clásico el L* es una sustancia similar a la que se
quiere determinar, salvo que está marcada con un radioisótopo, mientras que en el IRMA es
el anticuerpo
uerpo frente a la sustancia a determinar la que está marcada con el radioisótopo. En
ambos casos, en la rutina diaria lo denominamos trazador o marcada.
marcada

El radioisótopo a utilizar para marcar este ligando se elige en función de diversos factores
como la disponibilidad del antígeno en forma pura, fácil reproducibilidad del marcaje,
estabilidad
stabilidad del marcaje, etc. Por ello, los marcadores radioisotópicos más utilizados son
el 125I (para antígenos proteicos) y el 3H (para antígenos no proteicos y sobre todo
hormonas
monas esteroideas), aunque para ensayos concretos pueden utilizarse otros como el
57Co para la determinación
nación de la vitamina B12. El 125I es el radionúclido de elección por ser
un emisor gamma, tener buena eficiencia de contaje y tener un largo periodo de
semidesintegración (60 días).

El ligando marcado (ya sea el Ag o el Ac marcados) debe ser de gran pureza y tener una
alta actividad específica (B
(Bq/g).

Una vez marcado el antígeno con el radionúclido es preciso conocer la cantidad de

ligando marcado que es necesaria para el ensayo de alta sensibilidad, debido a que la
cantidad debe ser reducida al mínimo. Esto se hace mediante las denomin
denominadas curvas de
titulación que veremos más adelante.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 7

 Por otro lado, se debe valorar la inmunorreactividad del ligando marcado ya que su
disminución indicaría que ha sufrido algún tipo de degradación durante el marcaje. En la
práctica rutinaria, la degradac
degradación de los ligandos marcados se hace perceptible porque en
el ensayo aumenta la unión inespecífica, que es determinada en cada serie por la inclusión
en el ensayo de un tubo sin adición de anticuerpos y equivale a la fracción de trazador que,
en ausencia dee anticuerpo en el sistema, se comporta de la misma manera que si estuviese
unido o ligado al anticuerpo.

5.3. EL ANTICUERPO (Ac (Ac)

El anticuerpo empleado en RIA (que en la práctica cotidiana del RIA clásico se suele
denominar antisuero)) debe ser altamente esp específico
ecífico y, pese a ello, ser incapaz de
discriminar entre el ligando nativo y el ligando marcado, además de tener alta afinidad de
combinación, ya que la sensibilidad del ensayo depende de esta.

Para conseguir anticuerpos con alta especificidad y afinidad, la producción de los mismos
debe ser muy cuidadosa. Estos ant anticuerpos pueden ser producidos inn vivo (inmunizando a
un animal de experimentación y obteniendo los anticuerpos generados por el sistema
inmune del animal) o in vitro
vitro,, siendo actualmente esta última la más empleada, ya que
utiliza la técnica del hibridoma
hibridoma,, desarrollada por Kohler y Milstein en 1975. Esta técnica
permite obtener gran cantidad de anticuerpos monoclonales y de gran especificidad a
partir de células híbridas obtenidas por fusión de células linfocíticas B, obtenidas del bazo
de ratón con células de mieloma de ratón.

Los antisueros deben reunir unas características:

 Título de anticuerpo:: es aquella dilución del anticuerpo que liga el 50 % del antígeno
marcado (L*) bajo unas condiciones determinadas.

Para calcularlo se hacen diluciones seriadas del anticuerpo y se incuba con una cantidad
fija de antígeno marcado; después de la incubación, se separan las fases libre (F) y
unidas o ligadas (B) y se realiza el contaje para conocer aquella dilución que ligue entre
el 30-50
50 % o bien presente un cociente B/F de 0,7
0,7-1,5. )

 Afinidad del anticuerpo

anticuerpo: es la fuerza con la que el anticuerpo liga al antígeno y
normalmente se expresa como constante de afinidad,, que se define como la inversa de
la concentración molar de antígeno que liga o satura el 50 % del anticuerpo. La afinidad
del anticuerpo
o puede medirse mediante la gráfica de Scatchard o mediante la h hipérbola
de Michaelis-Menten.

 Especificidad del anticuerpo

anticuerpo:: es la capacidad de un anticuerpo de distinguir entre
varios antígenos de estructuras
ructuras similares. La especifi
especificidad
cidad del anticuerpo se prueba
mediante estudios de reacción cruzada con otros antígenos de estructura química muy
similar o parecida.

5.4. LOS MÉTODOS DE PARTICIÓN

Una vez que se ha establecido la reacción entre el ligando nativo (L), el ligando marcado
(L*) y el anticuerpo (Ac) formando complejos, las fases libres (F) y ligadas (B) deben ser

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 8

 separadas para contar su radiactividad. Esta separación es una parte esencial de los RIA
RI y
se realiza mediante el proceso denominado partición.

Se dispone de múltiples métodos para lograr llaa partición y su elección, que influye
poderosamente sobre la ejecución práctica del ensayo. Se debe basar en una serie de
requisitos.. El método ideal debe: (1) conseguir una completa separación de la fracción
ligada (B) y libre (F), (2) que no se vea infl
influenciado
uenciado por las diversas sustancias presentes
en la reacción, (3) que sea reproducible, sencillo, barato y técnicamente rápido y (4) que no
interfiera en la reacción Ag-Ac.
Ac.

Los numerosos métodos que consiguen estos objetivos se basan en las diferentes
propiedades
ropiedades fisicoquímicas existentes entre el antígeno y el complejo antígeno
antígeno-anticuerpo
y los más empleados son descritos a continuación
continuación:

 Métodos de adsorción del antígeno libre: consiste en la adsorción del antígeno libre
en la superficie porosa de dive
diversas
rsas sustancias como el carbón activo, carbón revestido
de dextrano, silicatos (talco,
lco, fluo
fluorisil)
risil) y resinas de intercambio iónico. La separación de
ambas fases se produce mediante una posterior centrifugación y decantación del
sobrenadante.

 Métodos de precipitación inespecífica del complejo Ag Ag-Ac: concentraciones

elevadas
evadas de sales inorgánicas (SO4NH4, S4Na2), polietilenglicol (PEG), etanol, etc. atrapan
las moléculas de agua de la solución, insolubilizando el complejo Ag
Ag-Ac y precipitando.
Como en el método anterior, la separación de ambas fases se produce mediante una
posterior centrifugación y decantación del sobrenadante.

 Métodos de precipitación específica del complejo Ag Ag-AcAc (método del doble

anticuerpo y método de la proteína A): el método del segundo anticuerpo es la
técnica de separación con mayor éxito en RIA. Consiste en la adición de un segundo
anticuerpo (Ac2) dirigido contra el anticuerpo del antisuero (Ac1) de tal forma que se
produce un complejo Ag*Ag*-Ac1-Ac2 que es insoluble y precipita.
ecipita. La separación de ambas
fases se produce mediante una posterior centrifugación y decantación del sobrenadante.
El método de la proteína A es muy similar pero utiliza una proteína adosada a la pared
celular de la bacteria Estafilococus aureus que se une a la región Fc de la IgG humana
formando complejos que hacen que este precipite y se pueda separar mediante
centrifugación y decantación.

 Métodos de separación en fase sólida

sólida: En estos métodos el anticuerpo está adsorbido
o ligado químicamente a una matriz sólida insoluble. Los sistemas más empleados son
los tubos revestidos de anticuerpo (tubos coated)) y los anticuerpos adsorbidos a esferas
o discos de plástico. La separación física de las fracciones libre (F) y ligada (B) se hace
mediante el lavado de los tu
tubos, las bolitas o los discos.

 Otros métodos:: aunque actualmente menos usados, la separación de la fracción unida

libre puede hacerse mediante filtración en gel, electroforesis, gel de poliacrilamida,
cromatografía, etc.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 9

 En definitiva, en la partición se separarán la fracción libre (F) de la unida (B) con objeto
de poder “contar” una de ellas de forma individualizada.

6. EL PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
Aunque en los primeros
imeros años de existencia del RI
RIAA todos los reactivos debían ser creados ex
profeso,, en la actualidad utilizamos kit comerciales que nos aportan todos los reactivos y
que permiten realizar los ensayos de forma cómoda, e inc incluso
luso semiautomatizar el proceso.

Los distintos pasos para la realización del ensayo, incluyen la preparación de la curva de
calibración, la dispensación de cada una de las muestras problema y reactivos, y el cálculo
de los resultados.

Todo el proceso de la realización de los ensayos RIA e IRMA puede ser realizado mediante
un simulador de RIA:

6.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y DE LOS REACTIVOS

Antes de la realización del ensayo la muestra debe ser descongelada,
descongelada si así estaba
conservada y almacenada, y puesta a temperatura ambiente (¡ojo! hay ensayos en los que
las muestras deben estar en otras condiciones), los reactivos deben ser reconstituidos,
reconstituidos
ya que suelen venir liofilizados para una mejor conservación hast
hastaa su uso y se deben
identificar los tubos de ensayo.

6.2. DISPENSACIÓN DE LOS VOLÚMENES DE MUESTRAS Y REACTIVOS

En los tubos de ensayo
sayo en los que se ejecuta el RI
RIAA se dispensarán (pipetearán) los
diferentes componentes del ensayo: dispensación de un volumen determinado de la
alícuota de la muestra problema (Lm) o de la curva patrón (Lp), de un volumen constante
del antígeno marcado (L*) y de un volumen del antisuero (Ac).

Como en cualquier método analítico, hay una variabilidad experimental debida a

numerosos
sos factores (reactivos, aparatos, operador, etc.), por lo que todas las
determinaciones se harán por duplicado y, además, es imprescindible disponer de un
“blanco” (enn un análisis cuantitativo se llama ““blanco”” a una preparación con la que se
pretende evaluar lo que de inespecífico tenga el ensayo.
ensayo.)) en el que se valore la unión no
específica del antígeno marcado. Se consigue incubando el ligando marcado (L*) con suero
que no contiene anticuerpo (Ac).

La curva patrón se prepara al mismo tiempo que el an análisis

lisis de la muestras
mues problema,
aplicando la técnica a una serie de tubos que contienen cantidades conocidas de la
sustancia a determinar (antígeno no marcado patrón Lp) y las mismas cantidades de L* y
de Ac que se usan en el análi
análisis: en el primer tubo no hay antígeno no marcado (L), por lo
que todos los centros de unión del anticuerpo serán ocupados por el antígeno marcado (L*).
A este punto de máxima unión del antígeno marcado se llama B0 o Bmáx,Bmáx que representa la
radiactividad máxima que se puede unir. Los siguientes tubos tienen concentraciones
conocidas cada vez mayores de sustancia a determinar: a mayor concentración de antígeno
no marcado (Lp), menor formación de complejos L* L*-Ac, ya que ambos antígenos compiten
por unirse al anticuerpo.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 10

 6.3. INCUBACIÓN
Las condiciones en que se realiza la incubación son muy variadas y dependen del ensayo en
concreto. La temperatura a la que se produce la reacción entre el antígeno y el anticuerpo
es muy variable y depende de cada ensayo, aunque en general la unión aumenta conforme
la temperatura aumenta. Pero como la velocidad de disociación de los complejos aumenta
más rápidamente con la temperatura que la velocidad de asociación, hay que elegir la más
adecuada para cada situación.

Cada ensayo concreto requerirá unas condiciones de incubación específicas.

En general, a temperatura ambiente se incuba cuando se requiere obtener una

sensibilidad no muy importante, mientras que si se quiere obtener una alta precisión y
reproducibilidad, la incubación suele hacerse a temperatura baja y durante largo tiempo.

6.4. SEPARACIÓN DE LAS FRACCIONES LIBRE Y UNIDA

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las fracciones libre (F) y ligada (B) han de ser
separadas, como hemos visto previamente, mediante el proceso de partición. Con ello se
consigue separar físicamente la fracción libre (F) de la unida (B) para po
poder “contarlas” de
forma individualizada.

6.5. CONTAJE DE LA RADIACTIVIDAD DE LAS MUESTRAS

Una vez separadas las fases, en la mayor parte de los ensayos RIA la fracción que se cuenta
es la unida (B) y el resultado se expresa en cuentas por minuto (cpm) o en múltiples
variantes de este. Para leer la radiactividad de la fase ligada se utiliza un contador gamma si
el isótopo utilizado es 125I o un contador beta en el caso de que se utilice tritio 3H.

6.6. CÁLCULO DE LA CURVA PATRÓN

Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la concentración de
sustancia analizada hay con construir una curva patrón que relacione estos parámetros.
Para ello, los resultados de las medidas obtenidas con los diferentes patrones o estándares
se relacionan con las concentraciones
centraciones conocidas y reales de dichos patrones, con objeto de
obtener una gráfica que no es más que la representación de la relación matemática
existente entre la variable dependiente (concentración) y la independiente
(radiactividad).

El cálculo de la curva patrón se puede hacer de forma manual o utilizando un ordenador,

siendo esta última la más utilizada ya que, en la actualidad, tanto los contadores gamma
como los beta disponen de programas informáticos para hacer todos los cálculos de forma
automática, representar la curva patrón y leer en ella las muestras problema, mostrando
directamente los resultados finales del análisis.

De todas maneras, vamos a ver cómo se hace el cálculo de forma manual para el RIA clásico
o competitivo. Parara el ajuste manual de la curva se representan los resultados obtenidos
con la curva estándar o patrón (radiactividad) frente a las concentraciones reales de
dichos patrones. De esta forma, obtendremos una curva de distinta morfología en función
del tipo dee escala (lineal o logarítmica) que utilicemos en la representación. Se pueden
utilizar tres tipos de representación: gráfica directa, gráfica semilogarítmica y gráfica
logarítmica.
TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 11
  En la representación gráfica
directa se representa la
radiactividad obtenida
nida en el
complejo unido (B) (L*-Ac)Ac)
(expresada como Ag*-Ac Ac o B, Ag*
o F, Ag*-Ac/Ag** o B/F, %Ag*
%Ag*-Ac
o %B, %Ag* o %F, F, etc.) frente a
la concentración de L. En esta
representación see obtiene una curva hiperbólica.

 En la representación semilogarítmica se representa

epresenta cualquiera de los parámetros ya
citados frente al logaritmo de la concentración de antígeno empleada. En esta
representación se obtienen curvas sigmoideas cconon una zona lineal en su centro.

 En la representación logarítmica se representan los logaritmos

ritmos de los parámetros
antes descritos y proporc
proporciona gráficos en líneas rectas.

Tanto los métodos manuales como los automáticos ajustan la curva de calibración mediante
diversas aproximaciones matemáticas
matemáticas,, obteniéndose curvas hiperbólicas, sigmoidales,
recíprocas, linearización logit
logit-log (que es el método de ajuste más utilizado), ajuste spline o
modelo de cuatro parámetros logísticos.

La forma de la curva patrón va a ser distinta en el

RIA clásico y sus variantes respecto a la obtenida
en el IRMA. En el RIA clásico, al representar la
curva patrón la relación entre la concentración y
la radiactividad de la forma unida, al aumentar la
concentración problema (L) la cantidad de L* L*- Ac
(B) que se forma disminuye y la for
forma de la curva
será descendente,, mientras que en el IRMA, a
mayor concentración problema (L) mayor es la
cantidad de Ac1-L-Ac2*
Ac2* (B) que se forma, la curva
será ascendente.

La forma de la curva patrón depende de tres factores

factores: (1) concentración
ración del anticuerpo,
(2) constante de afinidad del anticuerpo y (3) concentración total
otal del antígeno o ligando
marcado.
cado. Estos tres elementos son interdependientes entre sí y la concentración de cada
uno de ellos debe establecerse durante el diseño del en
ensayo,
sayo, de tal forma que permitan una
determinación en condiciones óptimas, permitiendo obtener RIA de alta sensibilidad, con
rangos de dosificación más o menos amplios y con cantidades de ligando marcado que sean
fácilmente medibles.

6.7. LECTURA DE LOS RESULTARESULTADOS

Obtenida la curva de calibración, la lectura de la concentración de la sustancia determinada
en la muestra se calcula interpolando en la curva patrón la medida de radiactividad
obtenida para cada tubo problema.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 12

 En la actualidad y, dado el predominio de los ensayos de tipo IRMA, es posible automatizar
o semiautomatizar todo el proceso descrito del ensayo. Para ello se utilizan equipos ccomo
el RIA-Mat®,, que consta de diversos módulos que permiten la dispensación automática de
los reactivos y las muestras,
s, la incubación, el lavado de los tubos, el contaje de la
radiactividad de cada uno de los tubos, la creación de la curva patrón y la lectura de cada
una de las muestras. Con ello, la labor del Técnico en Imagen para el Diagnóstico queda
reducida a colocar los reactivos y muestras en unas posiciones predeterminadas,
programar el equipo, supervisar las tareas programadas y, finalmente, recoger los
resultados.

6.8. CONTROL DEL ENSAYO

En cada ensayo se debe realizar el control de la ejecución y de los resultados. Estos
controles cotidianos pueden realizarse utilizando muestras de control y a través del
análisis de la curva patrón
patrón.

En el primer caso se utilizan muestras de control obtenidas comercialmente (control

externo) o preparadas
as de sueros control en el propio laboratorio (control interno).

La evaluación de la curva control utiliza una serie de parámetros, como cuentas totales,
unión no específica, asociación máxima (Bo/T), intersección en la curva para una unión del
10, 50 y 90 % (10 % B/Bo, 50 % B/Bo y 90 % B/Bo), pendiente de la curva y coeficiente de
variación. Estos parámetros deben mantenerse constantes en evaluaciones repetidas y
son índices del estado y comportamiento de los distintos reactivos, condiciones
ambientales, equipos y técnicas usadas en los procedimientos.

7. CONTADORES DE POZO. CARACTERÍSTICAS

Nuestros sentidos no pueden percibir la radiación. Por eso necesitamos recurrir a equipos
que puedan detectarla y, además, permitan conocer su intensidad y energía, ya que
conocer su intensidad nos permite discriminar entre la mayor o menor existencia de
sustancia radiactiva y conocer su energía nos permite discriminar la radiación primaria de
la radiación dispersa.

Los equipos que permiten detectar y medir las emisiones radiactivas se denominan
contadores y la detección de la radiación se basa en los efectos que, directa o
indirectamente, produce esta al atravesar la materia (interaccionar con la materia). Es
decir,
ir, no detectaremos la radiación, pero sí sus efectos, y estos nos permiten detectarla y
medirla.

Existen multitud de tipos de contadores en función del tipo de radiación que pueden
detectar, el mecanismo de detección y el tipo de utilización o uso del d
detector.
etector.

En RIA se utilizan los contadores centelleo que están basados en la propiedad que tienen
algunas sustancias de ser fluorescentes. Es decir, la propiedad de emitir en forma de luz
la energía absorbida procedente
ente de la radiación. Los fotones de la radiación incidente ceden
su energía a electrones de los átomos del material fluorescente saltando a un orbital de
mayor energía. Como esta situación es inestable, el electrón regresa a su órbita inicial
emitiendo el remanente energético en forma de fotón de luz visible.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 13

 Dependiendo de la naturaleza del sistema fluorescente empleado, los detectores de
centelleo pueden ser de dos tipos: de centelleo sólido o de centelleo líquido.

7.1. DETECTORES DE CENTELLEO SÓLIDO: CONTADOR GAMMA

El material fluorescente que se utiliza habitualmente en medicina nuclear es un cristal de
yoduro
duro sódico activado con talio INa(Tl). Cuando la radiación llega al cristal, se produce
un efecto fotoeléctrico, se pone fin al fotón incidente y la energía depositada permite la
fluorescencia del talio que, a su vez, emite los fotones luminosos. Estos fotones luminosos
son recogidos por un fotocátodo creando una señal eléctrica medible tras ser amplificada
por unos tubos fotomultiplicadores. Esta señal el eléctrica
ica medible es, en último término,
té la
que permite obtener la información necesaria.

Este tipo de detectores está especialmente indicado para eell contaje de emisiones gamma y
por ello también se les denomina contador gamma, ya que es absolutamente necesario
necesar
que la radiación sea penetrante
trante para alcanzar el cristal.

Para el contaje de la muestra radiactiva en este tipo de contador solo es necesario colocar la
muestra en el interior del cristal de centelleo que tiene forma de pozo, y de aquí que
también se denominen contadores de pozo pozo.. Para colocar la muestra en el interior del pozo
se utiliza un tubo de ensayo o tubo de contaje.

7.2. DETECTORES DE CENTELLEO LÍQUIDO: CONTADOR BETA

Dado que las emisiones beta β tienen escaso poder de penetración, el centelleo sólido
só no
permite detectarlas adecuadamente, ya que no alcanzarían el detector. Para solventar este
inconveniente se recurre a la utilización de sustancias líquidas centelleantes y que,
mezcladas con la muestra, permiten detectar la radiación emitida por est
esta. Estos
contadores, por lo indicado, se denominan contador beta o contador de centelleo
líquido.

Para el contaje de una muestra radiactiva en este tipo de contador se ha de preparar una
disolución de la misma en un disolvente apropiado y añadir uno o varios líquidos
centelleadores (denominados fluoróforos primario y secundario)) para formar una
mezcla (conocida con el nombre de cóctel de contaje o de centelleo), ), que es el que
realmente se introduce en el detector en el interior de un recipiente que denominamos
deno vial
de contaje.

El sistema funciona de la siguiente manera: la energía de la radiación emitida por la

muestra es captada por el disolvente, que emitirá un fotón de luz que será captado, a su vez,
por el fluoróforo primario. El fluoróforo primario emitirá un fotón de luz de diferente
longitud de onda, que será captada por el fluoróforo secundario y que, a su vez, emitirá un
fotón de luz con una longitud de onda a la que sea sensible el fotocátodo del detector. El
resto del sistema es similar al des
descrito en el contador gamma.

El disolvente a utilizar, aparte de ser fluorescente, debe ser aquel que permita la adecuada
disolución de la muestra, como son el tolueno, dioxano, naftaleno, etc. Como fluoróforo
primario se suele utilizar el PPO (2 55-difeniloxazol)
loxazol) y como fluoróforo secundario el POPOP
(1,4-di-[2-(5- feniloxazol)-benceno.
benceno. Pero existen muchos otros.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 14

 7.3. VALORACIÓN Y CONSIDERACIONES EN LA MEDIDA DE LA RADIACTIVIDAD
Cuando utilizamos un contador y efectuamos una medida de la radiactividad, el co contador
nos
os proporciona un valor o una actividad relativa, pero se trata de una actividad observada
sobre la que inciden una serie de fa
factores que vamos a describir.

 Canal de contaje:: en cualquier detector la energía de la emisión radiactiva se convierte

en un impulso eléctrico denominado pulso. La intensidad de este pulso depende de la
energía de la emisión emitida y, como consecuencia de ello, el contaje de la actividad de
una muestra consistirá en la medida del número de pulsos registrados por unidad de
tiempo, que se expresará
resará en cuentas por minuto (cp
(cpm). Como, previo al registro, cada
pulso es analizado por un dispositivo eléctrico del contador que constituye el
denominado canal de contaje, formado por tres elementos: dos discriminadores y un
circuito de anticoincidencia
anticoincidencia.. Cada canal de contaje permite el contaje de emisiones
con energía comprendida entre los límites fijados por los discriminadores de tal forma
que, ajustando adecuadamente los valores, detectaremos exclusivamente los pulsos
originados porr las emisiones radiactivas de un determinado radionúclido.

 Actividad de fondo:: la actividad de fondo es aquella medida de radiactividad que el

contador detecta incluso en ausencia de radiactividad. Se debdebee a la radiación ambiental,
la inestabilidad de los
os circuitos electrónicos o al ruido térmico del equipo contador.
Siempre existe una actividad de fondo inevitable, por lo que para calcular la actividad
neta de la muestra habrá que restarla a la actividad bruta de la misma, teniendo en
cuenta que cuanto mayor sea la actividad de la muestra, menos trascendencia tendrá la
actividad de fondo.

La forma práctica de calcular o contar el fondo consiste en contar viales similares a los que
después se emplean en el contaje de las muestras, ya sean vacíos o con aagua para el contaje
gamma, o conteniendo el cóctel de centelleo en el contaje beta. El contaje del tubo vacío no
debería dar más de una 70 cpm, ya que un fondo mayor indicaría contaminación de la
fuente por isótopos, vial o tubo contaminado, situación inap
inapropiada
ropiada del contador o posible
fallo de la electrónica del contador.

 Tiempo muerto:: todo contador necesita un tiempo mínimo para poder discernir entre
dos pulsos eléctricos consecutivos. Este tiempo se denomina tiempo muerto y supone
que si durante dicho periodo de tiempo se produjese la llegada de una nueva emisión
radiactiva, el contador no la detectaría y, por tanto, la medida estaría afectada por un
error que se denomina pérdida de coincidencia
coincidencia.
Los contadores suelen tener unos tiempos muertos de uno unoss 10 seg y la pérdida de
contaje suele no ser trascendente para los contajes habituales, pero habrá que tenerlo
en cuenta para actividades importantes.

 Estadística de contaje:: dado que la desintegración radiactiva es un fenómeno

probabilístico (estadístico), la medida repetida de una muestra de radiactividad no
siempre arroja el mismo valor. Por ello, las muestras deben ser contadas durante un
tiempo tal que el error relativo entre ellas sea muy similar.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 15

 Para conseguir que el error estadístico en el contaje de las muestras sea el deseado
podemos utilizar la siguiente fórmula:

Donde T es el tiempo de contaje, K es ell nivel de confianza del intervalo, ε es el error

estadístico deseado y R es la actividad relativa de la muestra
muestra.

En general, el error de contaje de las muestras suele ser del 1 %.

 Eficiencia del contador

contador:: la eficiencia de un contador es el número de cuentas
registradas por el contador
ador comparadas con el número de emisiones de la fuente.
Cada contador se calibra inicialmente para cada uno de los núclidos mediante un patrón
que tenga un esquema
uema de desintegración similar y una vida media larga. Esta
calibración quedará registrada y, con cada análisis, se medirá el patrón y se comparará
con dicho valor.

Si los resultados varían más de 2 desviaciones típicas se deben volver a comprobar

todas las condiciones y repetirse la prueba. Si el error persiste debe avisarse al
responsable del laboratorio para que compruebe el problema realizando tests más
específicoss (desviación estadística mediante la prueba de chi cuadrado (x (x²),
comprobación del fondo, etc.) y tome la decisión más adecuada.
En el caso de un contador gamma la eficiencia en el contaje de las muestras es similar
para todas ellas. Depende solo del contador y se puede calcular con un patrón de
actividad absoluta conocida. Sin embargo, en los contadores de centelleo líquido la
eficiencia no solo va a depender del contador, sino que también depende de la propia
muestra. Por ello, la valoración de la ef
eficiencia
iciencia en estos contadores debe hacerse
muestra a muestra, y para ello se utilizan varios métodos (estándar interno, estándar
externo y relación de canales). Para el contaje de 125I en un contador gamma suele ser
del 80-90
90 % mientras que para el 3H en un contador beta suele ser del 35-45
35 %.

 Desactivación, autoextinción o quenching:: este fenómeno se produce solamente

en centelleo beta o líquido y consiste en cualquier fenómeno que de alguna manera
interrumpe la transferencia de energía en la muestra de contaje ntaje y que supone
una disminución en el número de impulsos detectados y que estos sean de menor
intensidad con el consiguiente error en la medida.
Dado que la utilización actual de contaje beta es muy reducida, no
pormenorizaremos en los distintos fenóme
fenómenos que producen quenching,
quenching aunque sí
diremos que existen diversos procedimientos para corregir este fenómeno que
comienzan con la adecuada preparación de la muestra y vial de contaje y que
finalizan con diversos sistemas incorporados en los contadores que corrigen este
fenómeno mediante los procedimientos denominados relación de canales y
estándar externo.. Los contadores llevan incorporado un software para el
procesamiento de los datos. Esto aporta grandes ventajas como la velocidad, mejora
de la exactitud y precisión, control de calidad adicional y, sobre todo, la
representación de la curva estándar y el cálculo de resultados.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 16

 8. EL CONTROL DE CALIDAD DEL RADIOINMUNOANÁLISIS
El conocimiento de la fidelidad de los exámenes ejecutados en el laboratorio tiene un
significado médico práctico no siempre bien apreciado. Con el perfeccionamiento creciente
del diagnóstico, el médico se apoya cada vez más en los resultados de los exámenes de
laboratorio y, por ello, en el la
laboratorio
boratorio clínico actual el control de calidad desempeña un
papel importante.

Cada resultado de una medición efectuada en el laboratorio pu puede

ede estar afectado
afectad por un
error. Existen tres tipos de errores: errores groseros, errores sistemáticos y errores
aleatorios.

El error grosero se debe a la falta de la debida atención al ejecutar un análisis como, por
ejemplo, confusión de especímenes, de reactivos, etc. Estos errores por confusión pueden
reducirse, sobre todo, mediante una correcta organización en el laboratorio.

En el error sistemático los resultados se desvían del valor nominal en la misma dirección
(hacia arriba o hacia abajo). Sus causas no siempre se detectan y pueden deberse, por
ejemplo, a dispensar volúmenes (pipeteo) con pipetas mal graduada
graduadas,s, contaje de muestras
con un fondo excesivo, mala preparación de los reactivos, etc. Por regla general, los errores
sistemáticos pueden evitarse, pero ello supone una cierta experiencia en el trabajo de
laboratorio. La dimensión característica del error ssistemático es la exactitud.
exactitud

El error aleatorio conduce a una mala repetibilidad del proceso analítico y es fruto de la
posibilidad de que se produzcan errores casuales. La dimensión característica de los
errores aleatorios es la precisión y, habitualmente,
e, se expresa como la desviación estándar
(DS) y el coeficiente de variación (CV).

El concepto de fidelidad en las determinaciones analíticas es difícil de definir, ya que es un

término genérico que incluye a su vez conceptos como precisión, exactitud, especificidad
e y
sensibilidad.

La precisión es el grado en que una serie de medidas de una misma muestra difieren de la
media. Se expresa como coeficiente de variación (CV) y debe estudiarse para diferentes
niveles de la curva. Habitualmente, se admite una reproducibilidad intraensayo de 5-10
5 %e
interensayo del 5-15 %.

La exactitud o certeza es el grado en que una cantidad medida corresponde a la cantidad

presente en la muestra. La exactitud de un ensayo se conoce a través de la recuperación y el
paralelismo.
ismo. La primera se realiza adicionando concentraciones crecientes de sustancia
pura a un suero libre de sustancia o de concentración conocida y calculándose la
concentración esperada; mientras que para valorar el paralelismo se hacen diluciones
seriadas dee la muestra, se realiza el ensayo RIA, y si las curvas son idénticas o paralelas
indica que el anticuerpo reconoce inmunológicamente la misma estructura antigénica.

La especificidad es la capacidad de discriminar entre estructuras similares. La valoraci

valoración
de la especificidad depende de la sustancia a medir y de su rango de concentración, y se
hace calculando el porcentaje de reacción cruzada.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 17

 La sensibilidad analítica es la más pequeña cantidad de Ag no marcado que puede ser
distinguida del estándar ceroo y es el límite de detección del ensayo. Se determina
calculando la precisión del estándar cero y depende de la afinidad del Ac por el Ag, la
actividad específica del Ag marcado, las condiciones de la incubación, la precisión del
análisis, etc.

La sensibilidad funcional es la menor concentración que un ensayo es capaz de detectar

con un coeficiente de variación interensayo del 20%.

9. CONCLUSIÓN
Los métodos de RIA ofrecen un consider
considerable
able atractivo por su extrema sensibilidad, su
relativa facilidad de creación
eación y su coste relativamen
relativamentete bajo en comparación con otros
sistemas
temas analíticos comparables. A medida que se descubren nuevas sustancias
su problemas
o las ya conocidas se convierten en objetos de interés, el método analítico de primera
elección es el RIA.. De aquí que sean profus
profusamente
amente empleados en los campos de la
investigación y el diagnóstico.

Los RIA continúan utilizándose en medicina clínica debido a la facilidad de montar el

análisis.. En efecto, si se dispone de un anticuerpo, un receptor o una pr
proteína de unión
específicos, y se puede marcar la sustancia problema con un radioisótopo, puede crearse un
sistema de RIA.

En las últimas décadas el gran desarrollo de las técnicas inmunológicas

lógicas que no utilizan
sustancias radiactivas han ido desplazando al RIA ya que, por un lado, no utilizan ningún
material radiactivo, han conseguido una sensibilidad adecuada para la medicina práctica
diaria y, sobre todo, son técnicas totalmente automatizables de tal forma que existen
múltiples equipos que realizan esto
estoss inmunoensayos con un coste y calidad adecuados para
la práctica clínica rutinaria, y obteniendo resultados en un tiempo mínimo.

TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA Página 18