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El “MANUAL DE LABORATORIO PARA LA ASIGNATURA DE INMUNOBIOLOGÍA”

describe los métodos más utilizados para medir la capacidad de respuesta
inmunológica humoral y/o celular en general y la específica, con el fin de apoyar
el diagnóstico y la evaluación del estado clínico. En este se describe la tecnología
para producir reactivos moleculares y celulares útiles para diversos fines como
investigación básica y aplicada sobre diversos padecimientos; el desarrollo de
estuches de diagnóstico y su aplicación en la inmunoterapia contra enfermedades
infecciosas y no infecciosas; así como la generación y purificación de moléculas,
de utilidad en otras ramas, incluyendo la biotecnología. El manual de laboratorio
de Inmunobiología que se imparte en el sexto semestre a la Licenciatura en
Bioquímica Diagnóstica contiene los métodos que considero son los más
versátiles y útiles, por lo que no se incluyen métodos que actualmente ya no se
utilizan, o que son utilizados sólo en procesos de investigación sofisticados que
no podrían ser ejecutados en los laboratorios escolares.

El manual inicia con temas relacionados con la Inmunología básica, dando un

panorama general de esta disciplina, conceptos básicos sobre la respuesta
inmunitaria, que permitan, a un estudiante no familiarizado con esta área del
conocimiento, entender los procesos y marcadores biológicos a que hace mención
el resto del manual. A continuación, se abordan temas de Bioseguridad lo cual es
de suma importancia, ya que el estudiante conocerá las diferentes formas de
protección para poder desarrollar de manera segura su trabajo en el laboratorio y
así evitar accidentes que pudieran afectar su salud y la de sus compañeros y
maestros, así como al medio ambiente. Posteriormente se describe la ejecución
de diferentes técnicas inmunológicas y la producción de reactivos específicos,
primero con relación a los componentes y procesos de la llamada respuesta
humoral y después aquellos relacionados con la respuesta celular.

En este documento se incluyen 17 prácticas, las cuales comprenden: Número y

Titulo de práctica, Objetivos de la práctica, Introducción, Material y Reactivos,
Metodología, Diagrama de flujo, Metodología descriptiva, Espacios para Cálculos
y Resultados, Discusión, Conclusiones, Referencias, Cuestionario y Anexos. Lo

2
cual da como resultado un documento didáctico, de fácil interpretación tanto por
los diagramas, como por las diferentes imágenes que se incluyen en él, todo esto
favorece de forma importante el aprendizaje del estudiante.

Finalmente, se presentan tres secciones de apoyo: Listado de abreviaturas con

nomenclatura internacional, Descripción del material y Referencias que
enriquecerán el conocimiento de los estudiantes de la Licenciatura en Bioquímica
Diagnóstica. Seguramente este manual será una excelente guía para quienes
deseen y/o necesiten conocer o aplicar los métodos y técnicas relacionados a
Inmunobiología en las aulas de nuestra universdad y acercar los conocimientos
sobre los procesos inmunológicos básicos en beneficio de la población.

M. en C. Yolanda Medina Flores

Jefa del Laboratorio de Anticuerpos
Monoclonales Indre, SS.

3
4
5
6
 1. Definir Bioseguridad.

2. Realizar una tabla con 5 ejemplos de microorganismos

patógenos por cada nivel de bioseguridad.

Nivel de Bioseguridad Microorganismos

7
 3. ¿Qué es un RPBI?

4. ¿Qué tipos de RPBI se manejan en el laboratorio de

Inmunobiología y cuál es el tratamiento que se les da a los
mismos?

5. Explica el Rombo de clasificación de sustancias químicas de

la NFPA.

Referencias

8
Objetivos:

Conocer, entender y aplicar las normas de bioseguridad en las

prácticas de laboratorio con el fin de evitar accidentes.

Conocer, entender y aplicar las Normas Oficiales Mexicanas,

NOM, que regulan el uso y disposición de sustancias químicas y
biológicas.
Introducción:
Se define como Bioseguridad al conjunto de normas y actitudes que tienen como
objetivo la prevención y disminución de riesgos potenciales que pueden sufrir los
trabajadores en áreas de la salud, teniendo en cuenta que no solo se debe cuidar
la manipulación de agentes biológicos, sino también de sus toxinas y formas de
resistencia.

Dependiendo del nivel de bioseguridad (NBS) en el que se encuentren los

laboratorios, estos se clasifican como: Laboratorio Básico NBS 1 y NBS 2,
Laboratorio de Contención NBS 3, y Laboratorio de Contención Máxima NBS 4.

Las designaciones de los niveles de bioseguridad se basan en una combinación

de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo,
prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes
patógenos de los distintos grupos de riesgo (Tabla 1).

En México existen diversas normas que regulan el uso y disposición de sustancias

químicas y biológicas que representan un riesgo para la salud y el ambiente como
son la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 donde se encuentran las especificaciones
para la clasificación y manejo de los Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos
(RPBI).

9
 Tabla 1: Relación entre los Niveles de Bioseguridad, las
Prácticas y el Equipo.
NBS Tipo de Laboratorio Prácticas del Laboratorio Equipo de Seguridad

Enseñanza básica, investigación.

Microorganismos no patógenos Ninguno: trabajo en mesa
Básico
como: Naegleria gruberi, Bacillus TMA de laboratorio al
Nivel 1
subtilis, Saccharomyces cerevisiae, descubierto con tarja.
Penicillium roqueforti

Servicios de atención primaria;

Trabajo en mesa al
diagnóstico, investigación.
Básico TMA y ropa protectora; señal descubierto, autoclave y
Microorganismos como: E. coli,
Nivel 2 de riesgo biológico CSB para posibles
Streptococcus, Staphilococcus, virus
aerosoles.
de la hepatitis A, B, C, D, E

Diagnóstico especial e investigación. CSB además de otros

Microorganismos como: Prácticas de nivel 2 más ropa medios de contención
Contención
Micobacterium tuberculosis. especial, acceso controlado y primaria para todas las
Nivel 3
Histoplasma capsulatum, Yersinia flujo unidireccional de aire actividades (flujo negativo
pestis, virus de la Influenza de aire y filtros HEPA)

CSB de clase III o trajes

Practicas nivel 3 más cámara presurizados, autoclave
de entrada con cierre de doble puerta (a través
Contención Unidad de patógenos peligrosos y/o
hermético, salida con ducha, de la pared), aire filtrado,
máxima poco estudiados como el virus del
cambio completo de ropa y instalaciones separadas
Nivel 4 Ébola, el Coronavirus y el Hanta virus
calzado, eliminación especial de otros laboratorios con
de residuos cámaras de cierre
hermético

*TMA: Técnicas Microbiológicas Adecuadas.

*CSB: Cámara de Seguridad Biológica.

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 Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos
Los RPBI se dividen en 5 grandes grupos: Sangre, Cultivos y cepas de agentes
infecciosos, Patológicos, Residuos no anatómicos y Punzocortantes. El
almacenamiento de estos (Fig. 1) depende del grupo en el que se encuentren
(Tabla 2). Por otra parta la NOM-052-SEMARNAT-2005 establece que los
residuos peligrosos en cualquier estado físico por sus características Corrosivas,
Reactivas, Explosivas, Tóxicas, Inflamables, Venenosas y Biológico Infecciosas
(CRETIB), representan un peligro para el equilibrio ecológico, por lo que es
necesario definir cuáles son estos residuos, identificándolos y ordenándolos por
giro industrial y por proceso, los generados por fuente no específica, así como los
límites que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.

Figura 1. Recipiente hermético rojo para punzocortantes y Bolsas de

polietileno para residuos patológicos (roja) y no anatómicos (amarilla).

Tabla 2. Almacenamiento de RPBI

Tipo de residuo Estado físico Envasado Color
Sangre
Líquido Recipiente Hermético Rojo

Cultivos y cepas de Agentes

Infecciosos
Sólidos Bolsas de polietileno Rojo

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 Patológicos Sólidos Bolsas de polietileno Amarillo

Líquidos Recipiente hermético Amarillo

Residuos no Anatómicos Sólidos Bolsas de polietileno Rojo

Líquidos Recipiente hermético Rojo

Objetos Punzocortantes
Recipientes rígidos de
Sólidos Rojo
polipropileno

Todas las sustancias químicas utilizadas en el laboratorio suponen un riesgo para

la salud y el ambiente por lo que se han clasificado de diferentes maneras según
el riesgo que presentan.

La NFPA (Agencia Nacional de Protección del Fuego, de los EUA), clasificó los
riesgos de las sustancias en tres grandes grupos, asociando a cada riesgo un color
y un número que indica la gravedad del riesgo, estos datos son acomodados en
un rombo subdividido (Fig. 2).

Figura 2. Rombo de NFPA

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El Sistema HMIS (Siglas en inglés de Sistema de Identificación de Materiales
Peligrosos), alternativo en EUA, fue creado por la NPCA, utiliza los mismos
criterios, colores y niveles, con la diferencia de que se representa en un rectángulo
(Fig. 3).

Figura 3. Rectángulo HMIS

Las Buenas Prácticas de Laboratorio

Como parte de la guía elaborada para las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF),
en 1960 por las compañías farmacéuticas, surgió el concepto de Buenas Prácticas
de Laboratorio (BPL), las cuales establecen los elementos que un laboratorio
debe asegurar a fin de lograr que los resultados de los ensayos tengan una
confiabilidad apropiada. Actualmente las BPL son esenciales para llevar un
adecuado sistema de gestión de calidad en los laboratorios, así como para la
acreditación de estos, por organismos internacionales como la ISO (International
Organisation for Standardization).

A continuación, se enuncian algunas de las BPL más importantes en un laboratorio

de enseñanza:

Mantener en todo momento la No guardar alimentos ni

bata abrochada. bebidas en los refrigeradores
del laboratorio.
No comer, beber, ni fumar en
los laboratorios.
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 Las batas no deberán llevarse Transportar los productos en
a lugares de uso común. bandejas o recipientes para
evitar derrames en caso de roturas.
Es recomendable usar gafas
de seguridad cuando se No efectuar pipeteo con la
manipulen productos químicos o boca.
líquidos en ebullición.
Al terminar el trabajo,
Lavarse las manos antes de asegurarse de la desconexión
abandonar el laboratorio, al de aparatos, y llaves de gas.
quitarse unos guantes protectores y
siempre que se haya estado en Etiquetar debidamente las
contacto con material irritante, soluciones preparadas en el
cáustico, tóxico o infeccioso. laboratorio.

No llenar los tubos de ensayo Debe disponerse de la

más de dos o tres cm. información e instrucciones de
eliminación de residuos
Calentar los tubos de ensayo
de lado y utilizando pinzas. Los residuos se etiquetarán
adecuadamente indicando
Utilizar en todo momento fecha y contenido.
gradillas y soportes.
Considerar las disposiciones
legales existentes en el ámbito
local para residuo y deshechos.

14
Discusión:

15
Conclusiones:

Referencias:

16
 1. ¿Cómo se realiza el conteo de leucocitos y para qué se
utiliza la solución de Turck?

2. Describe la morfología normal y la función de cada

Leucocito presente en sangre periférica.

Célula Imagen Características Funciones

17
3. Explica el fundamento de la tinción de Wright.

4. ¿Cómo se realiza un frotis y qué características debe de

tener para que se pueda realizar un conteo?

5. Define Leucopenia, Leucocitosis y Neutropenia, y en qué

casos pueden presentarse.

18
 6. Se realizó un conteo de la serie blanca en cámara de
Neubauer, partiendo de una disolución 1:4, obteniéndose
como resultado 270 células contadas en los cuatro cuadros
primarios periféricos. Calcula el factor de corrección, el
número de leucocitos/ mm3 e interpreta los resultados.

Referencias

19
Objetivo General:
Identificar microscópicamente a las células del sistema inmunitario presentes en
circulación y conocer sus principales características fenotípicas y morfológicas.

Objetivos particulares:
Aprender a obtener una muestra de sangre por venopunción con el fin de
realizar un conteo de leucocitos.

Conocer y aplicar la metodología y cálculos para el conteo de células en la

cámara de Neubauer.

Realizar la interpretación clínica de los resultados, mediante la comparación

con los valores de referencia para la población mexicana.

Introducción:
La sangre es un tejido conectivo con matriz extracelular líquida, que en el
organismo cumple con diversas funciones, entre ellas:

Transporte y la distribución de sustancias esenciales para la vida como el

oxígeno, nutrientes, hormonas, líquidos, etc.

Eliminación de productos de desecho.

Regula y mantiene el medio interno de nuestro organismo en condiciones

óptimas para que puedan desarrollarse los procesos químicos vitales. Para
ello utiliza mecanismos como el control de pH, del equilibrio hidroelectrolítico o
de la temperatura.

Protege, ya que en la sangre hay células especializadas como leucocitos,

que tienen una función de defensa frente a agentes extraños del
organismo.(Merí, 2005).
20
La sangre está constituida aproximadamente en un 45% por elementos
corpusculares, y en un 55% por plasma. Por lo general, más del 99% de los
elementos corpusculares son los eritrocitos mientras que los leucocitos y
plaquetas ocupan menos del 1% del volumen sanguíneo total(Tabla 1).

El conteo de leucocitos es utilizado como un indicador inicial de pérdida de salud,

como una herramienta para determinar la capacidad del organismo de combatir
una enfermedad infecciosa, así como para verificar la eficacia de un tratamiento y
dar seguimiento a pacientes con enfermedades infecciosas e inflamatorias,
leucemia, linfoma y trastornos de la médula ósea(Ver anexo 1).

Cámara de Neubauer
Para conocer la concentración de células por mm3 o µL de sangre entera se utiliza
la cámara de Neubauer, la cual consta de un cubreobjetos y un portaobjetos en
el cual se encuentran cuatro canales longitudinales y un transversal central. En la
parte superior e inferior del canal transversal están grabadas dos rejillas de 9 mm2
de superficie, las cuales están a su vez divididas en una cuadrícula más pequeña
de 1mm2 (Fig. 1).

Figura 1. Cuadriculado de la cámara de Neubauer

Soluciones de Disolución
La dilución de la sangre para el recuento de cada tipo de célula se realiza con
soluciones adecuadas, que permitan la identificación de las células o que
destruyan al resto. Para el recuento de leucocitos se usa la solución de Turck,
formada por ácido acético al 2-3%, que se usa para destruir los eritrocitos, y
violeta de genciana para resaltar los leucocitos, que se tiñen ligeramente.

21
Frotis
Para asegurar la correcta evaluación de la morfología celular se requiere de un
frotis preparado de manera correcta. Se encuentran disponibles una variedad de
métodos para la preparación y tinción de los frotis sanguíneos, una de las tinciones
más comunes es la de Wright ya que permite realizar una evaluación morfológica
de las diferentes estirpes leucocitarias, así como determinar la cantidad que existe
de cada una.

Tabla 1. Fórmula leucocitaria

Leucocito % Cel/µL
Neutrófilos Totales 40-85 1500-7000

Neutrófilos en Banda 0-11 0-800

Neutrófilos 40-74 2000-6000

Segmentados

Eosinófilos 0-7 20-350

Basófilos 0-3 0-150

Linfocitos 12-46 1000-4200

Monocitos 1-13 100-800

22
Material Reactivos
1 cámara de Neubauer Solución de Turck (Ácido acético
1 pipeta de Thoma para leucocitos glacial y Violeta de genciana)
1 caja de Petri humedecida EDTA
3 portaobjetos Tinción de Wright (Azul de metileno y
1 tubo capilar Eosina)
1 piano contador Aceite de inmersión
Material para venopunción Amortiguador de fosfatos con pH 6.6
Microscopio Agua destilada

Diagrama de Flujo 1
R1: Agujas, depositar en
contenedor rígido rojo RPBI.
R2: Tubos con restos de la
muestra, depositar tapado
en bolsa roja RPBI.
R3: Torundas con gotas de
sangre, desechar en basura
municipal.
R4: Material de vidrio,
puntas amarillas y azules,
portaobjetos y cubreobjetos;
colocar en contenedores con
hipoclorito de sodio al 6%
R5: Mezclas reactivas,
colocar en contenedores
específicos para su
tratamiento.

23
 Metodología
[Link]ón de muestra sanguínea
Localizar la vena y limpiar la zona a puncionar con alcohol al 70%.

Colocar la ligadura y puncionar en un ángulo de 45º (insertar la aguja con

el bisel hacia arriba)

Posteriormente insertar el tubo al vacío con EDTA (tapón lila). Retirar el

tubo cuando éste se llene, seguido de la aguja.

[Link] de leucocitos
Tomar sangre con la pipeta de Thoma para leucocitos hasta la marca de
0.5, limpiando el exceso de sangre con algodón. Llenar hasta la marca de
11 con la solución de Turck y agitar suavemente.

Llenar la cámara dejando caer una gota en el borde del cubreobjetos, en

ambos lados de la cámara, desechando las tres primeras gotas. Dejar
reposar durante 1 min.

Colocar la cámara de Neubauer en el microscopio y buscar la cuadrícula con

el objetivo de 10X. Realizar el conteo de leucocitos con el objetivo de 40X.

Figura 2. Conteo en forma de culebra

24
 El número de leucocitos/mm3 será igual al número de células contadas
multiplicado por el factor de corrección (FC), que se obtiene en base a la
dilución y la profundidad de la cámara de la manera siguiente:

Dilución: 1/20

Cálculo de volumen contando: (0.1 mm3)*(4 cuadros)=0.4 mm3

1𝑚𝑚3
Corrección de volumen: ( ) = 2.5
0.4𝑚𝑚3

Factor de Corrección (FC)=(Dilución)(Corrección de volumen)

FC=(20)(2.5)=50

Reportar el valor en: leucocitos/µL

𝐿𝑒𝑢𝑐𝑜𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠
= (𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑢𝑐𝑜𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠) ∗ (𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛)
µL

[Link] diferencial de la serie blanca

Realización del frotis

Colocar una gota de sangre con el tubo capilar en el extremo de un
portaobjetos, extenderla con otro portaobjetos con un movimiento suave,
haciendo la extensión de sangre lo más delgada y fina que se pueda y dejar secar
al aire rápidamente.

Figura 3. Realización de un Frotis Sanguíneo

Tinción de Wrigth
Cubrir el frotis con colorante de Wright durante 5 a 8 minutos, agregar el
buffer, sin tirar el colorante, hasta que se forme una capa metálica que cubra el
frotis y dejarlo reposar de 5 a 8 minutos, por último, enjuagar con agua destilada
y secar.

25
 Conteo diferencial
Colocar el frotis en el microscopio y enfocar con el objetivo de 40X, colocar
una gota de aceite de inmersión y realizar la cuenta con el objetivo 100X,
contando un mínimo de 200 células.

Figura 4. Morfología de células sanguíneas (NB: Neutrófilo en Banda.

P: Plaqueta., E: Eritrocito. Bo: Basófilo, Lo: Linfocito, NS: Neutrófilo Segmentado,
Eo: Eosinófilo, Mo: Monocito)

Cálculos

26
 Resultados
Tabla 2. Resultados de los conteos de leucocitos expresados en porcentaje
Neutrófilos
Eq. Leucocitos totales Linfocitos Basófilos Eosinófilos Monocitos NK
BAN/SEG

Tabla 3. Resultados de los conteos de leucocitos expresados en valor

absoluto.
Neutrófilos
Eq. Leucocitos totales Linfocitos Basófilos Eosinófilos Monocitos NK
BAN/SEG

27
Imágenes de los leucocitos encontrados durante el conteo

Discusión

28
Nota: Incluir comparación de los resultados obtenidos con los valores normales para población
mexicana, para dar un diagnóstico de neutropenia, neutrofilia, entre otros.

Conclusiones

Referencias:

29
1. Elaborar una tabla con las ventajas y desventajas de los
diferentes métodos de separación de células.

2. ¿En qué se basa la separación por el método de “Ficoll &

Hypaque”?

30
 3. ¿En qué propiedades se basa la adherencia selectiva no
inmunitaria?

4. Mencionar la importancia de los marcadores de superficie

con relación a los métodos de separación de células y dar
algunos ejemplos.

5. ¿Con que finalidad se realiza un ensayo de viabilidad y qué

tipo de colorante es el Azul de Tripán?

Referencias

31
Objetivos:
Conocer las técnicas más empleadas para el fraccionamiento de la sangre
con el fin de separar las células inmunitarias.

Obtener un plasma rico en leucocitos por medio de tres técnicas:

sedimentación por gravedad, gradiente con “Fycoll & Hypaque” y
Alsever - gelatina al 3%.

Evaluar la eficiencia de las 3 técnicas mediante un conteo de viabilidad

celular utilizando azul de tripan y comparar el rendimiento obtenido.

Introducción:
El estudio in vitro de las células del sistema inmunitario requiere la obtención de
muestras (tejidos, sangre u otros líquidos orgánicos) y el posterior aislamiento de
las células de interés del resto de células de la muestra.

La evaluación de la respuesta celular se emplea para conocer el estado inmunitario

de los individuos, tanto sanos como con procesos en los que la respuesta
inmunitaria celular esté implicada (enfermedades infecciosas,
inmunodeficiencias, reacciones de hipersensibilidad retardada, tumores o rechazo
de injertos).El aislamiento de las células se puede realizar por métodos físicos o
por el estudio de marcadores y antígenos de membrana, algunos de los métodos
más utilizados se describen a continuación:

Físicos:
Centrifugación en gradiente de densidad. Se utiliza una
solución que, al disponerla en un tubo, alcanza diferentes densidades,
siendo menos densa en la superficie y más densa en el fondo. Al centrifugar, las
células se disponen en la zona con igual densidad a ellas. Este método permite
separar, por ejemplo, las células mononucleares de la sangre (linfocitos y
monocitos), de los polimorfonucleares. Si se realiza una centrifugación en una
32
solución de Ficoll (un polisacárido, Fig. 1) e Hypaque (diatrizoato sódico), los
polimorfonucleares se sedimentan más rápidamente en el fondo, mientras que los
mononucleares permanecen en las capas altas y pueden separarse.

Figura 1. Estructura molecular del Ficoll

Adherencia selectiva no inmunitaria a superficies. Algunas células se

adhieren de manera selectiva a ciertos materiales. Por ejemplo, los
Linfocitos B y monocitos se adhieren a las superficies de nylon mientras que no
lo hacen los Linfocitos T.

Estudio de marcadores y antígenos de membrana:

Técnica de las Rosetas. Se utiliza para separar las dos grandes
poblaciones de linfocitos. Si se incuba una mezcla de linfocitos
con hematíes de carnero, los linfocitos T se adhieren a la superficie de
estos formando rosetas (Fig.2), debido a que la molécula CD2 de su superficie
interactúa con el CD58 de la membrana de los hematíes. Si se realiza una
centrifugación en gradiente de densidad, las rosetas son más densas y se
depositan en el fondo, mientras que los linfocitos B quedan en superficie.

Figura 2. Ejemplo de una roseta fijada y teñida. (L=linfocito, E=Eritrocito)

33
 Adherencia inmunológica a superficies. Si se utilizan superficies de
plástico u otro material a los que se les ha unido un anticuerpo específico
para un determinado marcador de superficie y si se incuba una mezcla de
células con este material; sólo aquellas que posean el marcador se unirán al
anticuerpo y quedaran adheridas, mientras que las que no la posean
permanecerán libres y podrán separarse. Las células adherentes son PMN,
Macrófagos y Linfocitos B.

Separación por campos magnéticos. Cuando se incuba en un tubo una

mezcla de células con un anticuerpo específico para un determinado
marcador, al que se le ha acoplado una molécula paramagnética.
Entonces, las células portadoras del marcador se unirán al anticuerpo y al aplicar
un campo magnético estas células quedan retenidas en el tubo, mientras que las
que no portan el anticuerpo pueden ser separadas.

Separación por Citometría de Flujo. El citómetro de flujo puede actuar

como un sistema de clasificación y separación de células, ya que permiten
el recuento de células de una determinada población presentes en una
mezcla e incluso la separación de estas. (Fig.3)

Figura 3. Separación de linfocitos por citometría de flujo

34
Material Material para venopunción
1 gradilla Reactivos
5 tubos de ensaye de 13 x100 PBS 2x
3 pipetas de 2mL Ficoll & Hypaque
1 pipeta de 5 mL PBS 0.15M pH= 7.4
2 pipetas Pasteur Azul de tripán
Cámara de Neubauer Agua desionizada estéril
Jeringa de Insulina 1 mL Alsever - gelatina al 3%

Diagrama de Flujo 2

R1:Agujas: Desechar en contenedor rígido

R2:Material con sangre: Depositar en un contenedor con hipoclorito de sodio al
6%

35
Metodología
1. Obtención de Muestra Sanguínea
Obtener 10mL de sangre, por venopunción con sistema al vacío, en dos tubos
con heparina (tapón verde), uno de 6mL y el otro con 4mL. Colocar 6mL de
sangre para la técnica de sedimentación por gravedad, 4mL para “Ficoll &
Hypaque”.

2. Sedimentación por gravedad

Dejar reposar el tubo con 6mL de sangre durante 1 hora en posición vertical.
Extraer el plasma rico en leucocitos con ayuda de una pipeta Pasteur, depositarlo
en un tubo de ensaye y centrifugarlo a 90g por 10min. Desechar sobrenadante
por decantación y resuspender el paquete en 2mL de PBS 2x.

3. Choque hipotónico
Tomar 2mL del plasma rico en leucocitos en un tubo de ensaye y agregarle 2mL
de agua desionizada estéril. Agitar vigorosamente pero cuidadosamente en un
vortex durante 45 segundos y resuspender con 4mL PBS 2x en agitación en un
vortex.

4. Recuento de células
Utilizar la Cámara de Neubauer para contar los linfocitos presentes en la
suspensión celular. Por último, calcular el rendimiento (No. de células/mL) en el
plasma rico en leucocitos.

5. Determinación de Viabilidad celular con Azul de Tripán

Tomar una gota de la suspensión celular, colocarla en un tubo de ensaye y agregar
una gota de colorante azul de Tripán. Mezclar suavemente y depositar una gota
de la mezcla en la Cámara de Neubauer. Contar 100 células y determinar el
número de células muertas (teñidas de azul) y el número de células vivas
(refringentes) para obtener el porcentaje de viabilidad.

6. Separación por Ficoll & Hypaque

En un tubo de ensaye colocar 2mL de PBS 0.15 M pH=7.4 y agregarle 2mL de
sangre y homogenizar durante 1 min. Depositar suavemente 2mL de la sangre
diluida sobre 2mL de Ficoll & Hypaque cuidando de no romper la interfase.
Centrifugar el tubo a 700 g por 20 min.

36
Con una pipeta Pasteur colectar la capa blanca formada entre el Ficoll y el
plasma(Fig. 4).

Figura 4. Separación de Mononucleares por Ficoll & Hypaque

Realizar un lavado con 3mL de PBS y homogenizar 1min., por último, centrifugar
a 90g durante 10min. Desechar sobrenadante por decantación y re suspender el
paquete en 2mL de PBS.

7. Recuento de células y determinación de viabilidad

Repetir los pasos 4 y 5 con la suspensión celular obtenida, dilución 1:2.

8. Separación por Alsever-gelatina 3%

Mezclar la sangre por inversión y mantener la jeringa a 37ºC en posición vertical
con la aguja hacia arriba por 20 min. Doblar la aguja hacia abajo (Fig. 5) y
recuperar cuidadosamente el plasma rico en leucocitos en un tubo y realizar un
lavado con 3mL de PBS (repetir paso 6). Una vez obtenida la Suspensión de
leucocitos (Suspensión de leucocitos 2) realizar recuento de células y
determinación de viabilidad (repetir los pasos 4 y 5).

Figura 5. Jeringa para separación por Alsever-Gelatina al 3%

37
 Resultados
Tabla 1. Resultados del conteo de leucocitos y porcentaje de viabilidad
por “Ficoll & Hypaque” y sedimentación por gravedad.

Sedimentación por gravedad Ficoll & Hypaque Alsever –Gelatina 3%

Eq.
No. De cel./mL %viabilidad No. De cel./mL %viabilidad No. De cel./mL %viabilidad

10

38
Discusión

39
Conclusiones

Referencias:

40
1. Definir cultivo celular de linfocitos

2. ¿Qué es un mitógeno y cómo actúa?

3. Mencionar los mitógenos más utilizados y para qué

población se utilizan.

4. ¿Cuáles son las ventajas de utilizar técnicas colorimétricas

para evaluar la proliferación celular?

41
 5. Describir el fundamento del uso de MTT

Referencias

42
Objetivos:

Conocer las condiciones ideales para llevar acabo un cultivo de Linfocitos

Realizar un cultivo celular de Linfocitos T con el fin de llevar a cabo un
ensayo de proliferación con MTT para medir la respuesta a un antígeno
específico, evaluar la capacidad de respuesta intrínseca o conocer
el estado inmunocompetente de un sujeto.
Introducción:
Para funcionar en la inmunidad adaptativa, los escasos linfocitos antígeno
específicos deben proliferar de forma muy extensa antes de diferenciarse a células
funcionalmente efectoras a fin de generar un número suficiente de las mismas con
la especificidad deseada. Por ello el análisis de la proliferación inducida en
linfocitos constituye un tema esencial de estudio. Sin embargo, es difícil detectar
la proliferación de linfocitos normales en respuesta a antígenos específicos, ya que
sólo una porción mínima de las células será inducida a dividirse.

El estudio del cultivo de linfocitos recibió un gran impulso tras el descubrimiento

de ciertas sustancias que inducían la proliferación en todos o gran parte de los
linfocitos de una cierta clase. En conjunto, dichas sustancia se denominan
mitógenos policlonales, ya que inducen la mitosis en linfocitos, al parecer
activan esencialmente los mismos mecanismos de respuesta que el antígeno. Los
linfocitos suelen ser células en la fase G0 del ciclo celular; cuando se estimulan
con mitógenos policlonales, entran rápidamente en la fase G1 y progresan a
lo largo del ciclo.

Los estímulos mitogénicos en cultivo se pueden dividir en tres grupos principales:

• Activación por antígenos del complejo principal de histocompatibilidad
(MHC) alogénicos. Por ejemplo en la técnica del cultivo mixto de linfocitos.
43
 • Activación por un antígeno exógeno, en individuos previamente expuestos
al mismo in vivo.
• Activación por mitógenos policlonales, tales como algunas lectinas
vegetales, moléculas de origen microbiano, o por anticuerpos monoclonales
dirigidos contra proteínas de superficie que originan señales para la
proliferación (ej. anti- CD3, anti-CD2, entre otros).

Mitógenos policlonales
Entre los mitógenos policlonales, algunos muestran cierto grado de selectividad
hacia una determinada población de linfocitos (T o B). Esto posee utilidad para la
evaluación del estado funcional de dicha población en el individuo, al menos en
cuanto a su capacidad para proliferar. Por ejemplo, la fitohemaglutinina (PHA)1
y la concanavalina A (Con A) son lectinas de origen vegetal que estimulan con
cierta selectividad a los linfocitos T humanos, por lo que se emplean en el estudio
de pacientes con inmunodeficiencia. La respuesta mitogénica a estas lectinas está
disminuída o ausente en sujetos con defectos en sus linfocitos T.

Estudio de la respuesta mitogénica

La respuesta mitogénica de los linfocitos puede ser cuantificada
mediante 2 técnicas principalmente: Incorporación de timidina tritiada (3H- T) al
ADN celular. Si se cultiva un número constante de linfocitos en presencia
de un mitógeno, durante unos días, las células entrarán en mitosis. Al
agregar un pulso de timidina radioactiva al cultivo, ésta se incorporará al
ADN sintetizado de novo, en forma proporcional a la actividad mitótica de las
células.

La radioactividad incorporada en las nuevas células puede medirse, cosechando a

las mismas mediante filtración en una membrana o filtro poroso. Esto se realiza
en un aditamento denominado "cosechador" de células.

Figura 1. Cosechadores de células para la técnica de mitogénesis.

44
Técnicas colorimétricas que detectan, por ejemplo, la actividad de enzimas
intracelulares, mitocondriales, entre otras.
La técnica colorimétrica rápida más empleada es la que utiliza
el colorante 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 bromuro difeniltetrazolio
(MTT), que es reducido por deshidrogenasas mitocondriales de células
viables a formazán purpura. Se ha utilizado en una variedad de ensayos que
incluyen la cuantificación de linfocinas, cotitoxicidad, proliferación y activación
celular.

Usos
En la clínica, la técnica de proliferación de linfocitos, constituye una herramienta
para el diagnóstico de las inmunodeficiencias de tipo celular, tanto primarias como
secundarias. En inmunología clínica experimental, resulta de gran utilidad para el
estudio del efecto que los fármacos, productos biológicos (vacunas,
inmunomoduladores) y agentes patógenos provocan sobre la respuesta inmune
celular.

45
Material Reactivos
Placas de 96 pozos para cultivo Medio de cultivo DMEM MTT
celular SDS al 20% en DMF al 50% con
Campana de flujo laminar estéril pH=7.4
Material para venopunsión Concavalina A y Fitohemaglutinina
Patrón de Albúmina
Reactivo de fenol 2 N
SSF

Diagrama de Flujo 3

R1- Agujas: Desechar en contenedor rígido. Material con sangre: Depositar en

un contenedor con hipoclorito de sodio al 6%

46
Metodología

1. Obtención de muestra sanguínea

Obtener 10 mL de sangre con anticoagulante por venopunción

2. Separación de mononucleares
En un tubo de ensaye colocar 2 mL de PBS 0.15 M pH=7.4 y agregarle los 2mL
de sangre y homogenizar durante 1 min. Depositar suavemente 2mL de la sangre
diluida sobre 2 mL de “Ficoll & Hypaque” cuidando de no romper la interfase.
Centrifugar el tubo a 700 g por 20 min. Con una pipeta Pasteur colectar la
capa blanca formada entre el Ficoll y el plasma. Realizar un lavado con 3 mL de
PBS y homogenizar 1 min. por último, centrifugar a 90g durante 10 min. Desechar
sobrenadante por decantación y resuspender el paquete en 2mL de PBS. Realizar
un conteo en cámara Neubauer para determinar el número de células/mL.

3. Cultivo celular con Mitógeno

Realizar cultivo celular con 10,000cel/pozo en placas de 96
pozos (100 µL de medio de cultivo + 100 µL de células) y agregar 10 µL
del mitógeno de elección, a excepción de 8 pozos (testigo). Incubar 72
horas a 37 ºC en un ambiente con 5 % de CO2.
4. Incubación con MTT
Agregar a cada pozo 20µL de MTT a una concentración de 5mg/mL y dejar
incubar a 37 ºC toda la noche para favorecer la formación de cristales.
Posteriormente centrifugar la placa a 90g por 3 min. retirar el sobrenadante
cuidadosamente y adicionar 100 µL de SDS en DMF y dejar incubar
aproximadamente 3 horas hasta que se disuelvan los cristales (medio color azul.

5. Lectura de Cultivo
Verificar la completa disolución de cristales. Leer a 540-750 nm en lector de
ELISA.

6. Cálculo de Índice de Estimulación

El Índice de Estimulación de cada muestra se calcula de acuerdo con la siguiente
fórmula:

Do= Densidad óptica

47
 Cálculos y Resultados
Tabla 1. Resultados de la Proliferación celular en respuesta a los diferentes
Mitógenos.
Promedio de Do de Promedio de Do de
Equipo Mitógeno IE Observaciones
cultivos estimulados cultios no estimulados
1

10

Figura 2. Imagen de la placa de cultivo celular con MTT

48
Discusión

49
Conclusiones

Referencias:

50
1. Brevemente describir las etapas de la fagocitosis

2. ¿Qué es el estallido respiratorio?

3. ¿Cómo se evalúa la fagocitosis in vitro?

51
4. Mencionar algunos casos en los que se realicen pruebas
para evaluar la fagocitosis

5. ¿Cuál es la reacción que ocurre con el NBT durante la

práctica?

Referencias

52
Objetivos:
Evaluar la función fagocítica en células de sangre periférica humana para
determinar: Porcentaje de Células con capacidad fagocítica, Porcentaje de
Células con capacidad de producir radicales de oxígeno y Número de
levaduras promedio que fagocita una célula
Introducción:
Cuando un agente agresor sobrepasa las barreras naturales constituidas por
la piel y las mucosas, un segundo mecanismo de defensa entra en acción: la
fagocitosis. La cual se puede definir como el proceso por el que células
especializadas buscan, localizan, identifican e introducen a su citoplasma
partículas o microorganismos extraños para matarlos y digerirlos. Esta función es
ejercida principalmente por los Polimorfonucleares y Macrófagos.
El Neutrófilo polimorfonuclear es una célula de vida corta y dominante en el
torrente sanguíneo. Los gránulos neutrófilos son de dos tipos principales:
a) El gránulo primario azurófilo, presenta la típica
morfología lisosómica y contiene mieloperoxidasa y la
mayoría de los efectores antimicrobianos no oxidativos,
como defensinas, proteína bactericida estimuladora de la
permeabilidad (BPI) y catepsina G
b) Los gránulos secundarios específicos peroxidasa
negativos que contienen lactoferrina, gran parte de la
lisozima, fosfatasa alcalina y citocromo b unido a membrana.
Por otro lado los Macrófagos tras su diferenciaci
ón en monocitos sanguíneos, se instalan por
último en los tejidos como macrófagos maduros
donde constituyen el sistema fagocítico
mononuclear en mayor concentración en los
pulmones (macrófagos alveolares), el hígado
(células de Kupffer) y el revestimiento de los
sinusoides esplénicos y los senos medulares de
los ganglios linfáticos, donde ocupan localizaciones estratégicas para filtrar y
eliminar el material extraño. A diferencia de los neutrófilos, son células de vida

53
prolongada y mientras estos últimos constituyen la principal defensa contra las
bacterias piógenas, en general los macrófagos están más preparados para
combatir las bacterias, los virus y los protozoos capaces de vivir dentro de las
células del hospedador.
El proceso de la fagocitosis se cumple por etapas:

Paso del torrente circulatorio a los tejidos.

Se inicia con la adherencia del fagocito al endotelio vascular
promovido por citocinas y otras moléculas reguladoras de la respuesta
inmunitaria como la IL-1, el IFNγ y el TNFα, producidas por macrófagos y
linfocitos en el tejido que sufrió agresión. Estas moléculas generan la
producción y expresión, en la membrana de las células endoteliales, de moléculas
de adherencia como selectinas y los ICAM. Por influjo de las mismas citocinas los
fagocitos expresan moléculas de adherencia llamadas integrinas, complementarias
a las moléculas expresadas en las células endoteliales.
Búsqueda del Antígeno y Respuesta quimiotáctica
Cuando los fagocitos son sometidos al influjo de un gradiente de
factores quimiotácticos su desplazamiento se vuelve unidireccional y su
velocidad se incrementa en 4 a 5 veces. Tanto los macrófagos como los PMN son
atraídos con quimiocina como la MCP-1 molécula quimioatrayente y la IL-8,
respectivamente, que son producidas en el tejido agredido. Además los fagocitos
poseen en su membrana receptores para otros sustancias quimiotacticas
derivados de productos bacterianos, y para moléculas pequeñas producto de la
activación del complemento: C5a, C3a y C4a.
Reconocimiento del antígeno
Una vez que el fagocito llega al sitio de mayor concentración de factores
quimiotácticos, debe identificar la partícula extraña. Este proceso se
acelera si el microorganismo o partícula esta opsonizado. Este proceso está
controlado por más de 40 receptores específicos, como los PRR (Receptores de
Patrones de Reconocimiento).
Ingestión
La interacción receptor-ligando activa a la miosina, la actina y las
proteínas que unen a la actina, así los microfilamentos de actina entran
en un proceso de polimerización que permite el plegamiento de la membrana
plasmática en el sitio de contacto. Las prolongaciones de la membrana rodean
por completo al microorganismo o partícula y se fusionan en la parte distal y
forman una vacuola, llamada fagosoma o vacuola fagocitaria. Durante la formación
54
de está, la enzima NAD es arrastrada al interior de la vacuola en donde se reduce
a NADH para iniciar el proceso de destrucción.
Degranulación
Tan pronto como se forma el fagosoma, los movimientos dentro del
citoplasma se activan y los lisosomas se aproximan a la membrana del
fagosoma, se fusionan con él y vierten su contenido enzimático al interior,
para iniciar los procesos encaminados a la destrucción y digestión del
microorganismo o molécula fagocitada. Este proceso de degranulación está
desencadenado por el aumento intracitoplasmático de calcio que reacciona con
las sinexinas, las cuales facilitan la fusión de los lisosomas al fagosoma.
Muerte y digestión del antígeno
Los procesos químicos que llevan a la muerte del microorganismo
se dividen por lo general en dos grandes grupos: los oxígeno-
independientes y los que requieren la presencia del oxígeno para cumplir su
cometido. Asociado al proceso de la fagocitosis ocurre en las células el llamado
“estallido respiratorio”. Este consiste en el consumo aumentado de oxígeno y
glucosa y en la producción de cantidades elevadas de anión superóxido y peróxido
de hidrógeno, además de otros cambios relacionados como la activación del
sistema de la NADPH-oxidasa y del ciclo de las pentosas.

Las anormalidades en la función de las células fagocíticas pueden estar

relacionadas con defectos en adherencia, locomoción, deformabilidad,
reconocimiento, adhesión, ingestión, formación de fagosomas, desgranulación,
capacidad para matar microorganismos, o eliminación del material ingerido.

Las pruebas estándar de la función fagocítica incluyen las pruebas de

reducción del nitroazul de tetrazolio (NBT) y la emisión de quimioluminescencia.
En la prueba del NBT, los neutrófilos se incuban con el colorante oxidado, se
estimulan con éster forbólico (PMA) o con partículas ingeribles y se examinan al
microscopio para buscar la presencia o ausencia de formazán azul dentro de las
células. Generalmente la totalidad de las células normales son capaces de reducir
al NBT mientras que los neutrófilos de los pacientes con enfermedad crónica
granulomatosa (CGD) no lo hacen o lo hacen limitadamente (0-10% de las
células) por mecanismos diferentes a la producción de superóxido.

55
Material Reactivos
1caja de Petri Nitro azul de Tetrazolio NBT
2 Aplicadores de Madera SSF Estéril
4 cubreobjetos Safranina
2 portaobjetos Alcohol 70%
Algodón Resina Entallen
Material para venopunción Barniz de uñas

Diagrama de Flujo 4

R1: Agujas: Desechar en contenedor rígido Tubos con sangre: Depositar en un

contenedor con hipoclorito de sodio al 6%
R2: Material con sangre: Depositar en un contenedor con hipoclorito de sodio al
6%

56
Metodología
1. Armado de cámara
Colocar los cubreobjetos y los aplicadores de madera, sobre una base de algodón
humedecido, como se muestra en la figura:

Figura 3. Armado de cámara

Posteriormente incubar a 37º C durante 3 a 5 min. NO sobrepasar el tiempo
Indicado. (Realizar dos cámaras)

2. Obtención de Muestra
Utilizar las suspensiones de leucocitos 1 y 2 obtenidas en la práctica 3.

3. Adherencia y Fagocitosis
Colocar 30 µL de las suspensiones de leucocitos en cada cubreobjetos y agregar
30 µL de extracto de levadura a los cubreobjetos 2, 3 y 4. Posteriormente
colocar 2 gotas de NBT a los cubreobjetos 3 y 4, homogeneizar con
el aplicador de madera y tapar la cámara e incubar a 37º C por 1 hora.
Sacar los cubreobjetos de la cámara, enjuagarlos con SSF estéril y colocarlos
sobre una base de papel absorbente.

4. Tinción
Colocar 10 gotas de Safranina a cada cubre objetos y dejar reposar por 15
minutos. Decantar el colorante y finalmente colocar los cubreobjetos invertidos en
los portaobjetos, colocando 2 gotas de resina Entallen en cada portaobjetos,
esperar 5 minutos y sellar la orilla con barniz de uñas.

57
 Figura 4. Diagrama de Tren de Tinción

5. Resultados
Contar 200 células distinguiendo lo siguiente:
A. Células fagociticas
Que reducen NBT
Que no reducen NBT
Levaduras Fagocitadas
B. Célula no fagocítica

Valores de referencia:
Índice fagocítico: 2.03 - 3.92
% de Fagocitosis: 21 – 39

Figura 5. Reducción de NBT en Fagocitos

58
 Cálculos y resultados

Tabla 1. Resultados del conteo de células fagocíticas y no fagocíticas.

Células Fagocíticas
Técnica de No. De No Células Células no Levaduras
Reducen
Separación Cubreobjetos reducen Fagocíticas Fagocíticas Fagocitadas
NBT
NBT

Ficoll &
Hypaque

Alsever-
Gelatina
3%

Tabla 2. Porcentaje de fagocitosis, reducción e índice fagocítico

Técnica de No. De % de % de Índice
Separación Cubreobjetos Fagocitosis Reducción Fagocítico

Ficoll &
Hypaque

Alsever-
Gelatina 3%

59
Discusión

60
Conclusiones

Referencias:

61
1. ¿Cuál es la diferencia entre aglutinación y precipitación?

2. Definir floculación y mencione ejemplos de este tipo de

pruebas

3. ¿Qué es el factor reumatoide y en qué casos se realiza su

determinación?

62
 4. ¿Qué se determina con la prueba de reacciones febriles y
cuáles son los valores normales?

5. ¿Qué es y cómo se calcula el título de anticuerpos?

Referencias

63
Objetivos:
Conocer los diferentes tipos de pruebas serológicas empleadas en los
laboratorios clínicos.

Aplicar las técnicas de aglutinación y floculación con el fin de estudiar la

respuesta humoral.

Realizar los calculos para los títulos de anticuerpos, a partir de la realización

de pruebas de aglutinación y floculación.

Introducción:
La reacción entre un antígeno y un anticuerpo, dirigido específicamente contra él,
da lugar a un complejo antígeno-anticuerpo. El estudio de estas reacciones in vitro
se denomina serología.

Cuando el antígeno se halla unido de forma natural a un corpúsculo, como las

células sanguíneas o los microorganismos, la reacción antígeno-anticuerpo
produce una aglutinación. Mientras que no es tan sensible como otras pruebas
serológicas, la aglutinación es 100 veces más sensible que la precipitación. La
aglutinación sigue siendo útil en el diagnóstico clínico al ser un inmunoanálisis
barato, muy específico y rápido. Ensayos estandarizados de aglutinación son
útiles, como es el caso de la reacción para la tipificación del grupo sanguíneo ABO
y para la identificación de patógenos y de sus productos.

Entre las técnicas que utilizan las reacciones de aglutinación en los laboratorios
clínicos, se encuentran la aglutinación directa, la aglutinación indirecta, la inhibición
de la aglutinación y las pruebas de fijación del complemento.

Aglutinación Directa: Ocurre cuando un anticuerpo soluble se

encuentra con un antígeno que forma parte de una célula o de una
partícula insoluble (Fig. 1).

64
Este tipo de pruebas se emplean para el diagnóstico de infecciones bacterianas
causadas por Brucella, Salmonella y Proteus (Reacciones febriles), otro ejemplo
común de este tipo de aglutinación es el caso de la tipificación sanguínea.

Figura 1. Aglutinación directa

Aglutinación Indirecta: Se produce por anticuerpos solubles que se

han unido a células, partículas de látex o carbón (Fig. 2). Esta última es
5 veces más sensible que la aglutinación directa. Además, aumenta
considerablemente la capacidad de detectar reactivos solubles. Una prueba de
aglutinación con látex muy empleada es la que se utiliza para la detección de
anticuerpos séricos específicos para el factor reumatoide un anticuerpo que se
asocia con la enfermedad autoinmune Artritis Reumatoide. Otro ejemplo de
aglutinación indirecta es la titulación de la Proteína C reactiva (PCR).

Figura 2. Aglutinación indirecta

65
Las pruebas de aglutinación pueden realizarse en tubo o placa, en estas últimas
se mezcla sobre una placa una suspensión del antígeno con diversas diluciones
del suero. Se hace oscilar la placa durante unos minutos y se observa la dilución
del suero a la que aparece aglutinación.
El resultado se expresa como el inverso de la última dilución en donde se presenta.

Floculación: Es otro mecanismo útil para evidenciar reacciones

antígeno- anticuerpo in vitro y es considerada de interacción secundaria
porque no necesita ningún reactivo o sustancia biológica adicional para
hacer visible la reacción (Fig. 3). La característica lipídica del antígeno es la
condición que la hace ser una reacción de floculación. La prueba de VDRL
(Venereal Disease Research Laboratory) es el mejor ejemplo de una reacción de
floculación.

Figura 3. Ejemplo de Floculación

Material Reactivos
2 placas con fondo negro Equipo de diagnóstico para VDRL.
2 placas con fondo transparente Equipo de diagnóstico para Factor
10 aplicadores de madera Reumatoide.
Material para venopunción Equipo de diagnóstico para
Reacciones Febriles.
Equipo de diagnóstico para
antiestreptolisinas
Equipo de diagnóstico para VDRL
Solución salina fisiológica (SSF)
Solución amortiguadora de Fosfatos-
Salino (PBS) 1X pH=6.6
Solución de eritrocitos grupo O al 5%

66
Diagrama de Flujo 5

R1: Agujas: Desechar en contenedor rígido Tubos con sangre: Depositar en un

contenedor con hipoclorito de sodio al 6%
R2: Material con suero y sangre: Depositar en un contenedor con hipoclorito de
sodio al 6%

67
Metodología

1. Separación de suero
Obtener 5 mL de sangre sin anticoagulante por venopunción e incubar 15 min. a
37º C para favorecer la formación de coágulo. Centrifugar a 90 g por 10 min. y
separar el suero.

2. Aglutinación y floculación
Colocar en las placas correspondientes (según prueba) 25µL de suero en cada
círculo. Agregar 1 gota de reactivo (testigo positivo, testigo negativo y antígeno
(Fig. 4)), mezclar y mantener en agitación por 1 min. Observar el fenómeno de
la aglutinación o floculación según sea el caso.

Figura 4. Ejemplo de Aglutinación

3. Titulación
Titular las pruebas positivas de la manera siguiente: Realizar 10 diluciones dobles
del suero en una placa para aglutinación con SSF (Tabla 1). Posteriormente
repetir la técnica de aglutinación.

Tabla 1. Diluciones dobles para titulación

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SSF(µL) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Suero(µL) 25

Finalmente determinar el título de anticuerpos e interpretar los resultados según

el equipo de diagnóstico (inserto).

4. Antiestreptolisinas
Preparar los reactivos necesarios para la elaboración de la prueba: Solución de
Eritrocitos: Obtener Sangre humana tipo O, separar los eritrocitos y lavarlos 3

68
 veces con SSF. Preparar una solución al 5% en PBS. Solución Amortiguadora:
Obtener una solución 1X de PBS- Salino de pH=6.6.

Diluir el suero con PBS de la manera siguiente: 1:10 (0.5mLde suero +4.5mL de
PBS), 1:100 (1.0 mL dilución 1:10 + 9.0 mL de PBS) y 1:500 (2.0mL dilución
1:100 + 8.0 mL de PBS)
Preparar las siguientes mezclas en tubos de ensaye:

Tabla 2. Diluciones para prueba de Antiestreptolisinas

Dilución Testigos
1:10 1:100 1:500
de Suero + -
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Suero diluido
0.8 0.2 1.0 0.6 0.3 1.0 0.6 0.3 0.0 0.0
(mL)
PBS (mL) 0.2 0.8 0.0 0.4 0.7 0.0 0.4 0.7 1.0 1.5
Estreptolisina
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0
O (mL)
Mezclar e incubar a 37°C por 15 min.
Eritrocitos
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
5% (mL)
Mezclar e incubar a 37°C por 15 min.
Resuspender Eritrocitos e incubar a 37°C por 30 min.
Centrifugar a 350g por 5min.

Cálculos y Resultados

69
Tabla 3. Resultados de las pruebas de aglutinación y floculación
Resultado
Equipo Prueba Título
Positivo
1

10

70
Discusión

71
Conclusiones

Referencias:

72
1. Explicar el fundamento de purificación de proteínas por
cromatografía de intercambio iónico.

2. ¿Cuáles son los factores de los que depende la solubilidad

de una proteína?

3. ¿Cuál es la finalidad de realizar la precipitación en un baño

de hielo?

73
 4. ¿Cuál es el fundamento de diálisis y por qué se realiza en la
práctica?

5. ¿Al finalizar la diálisis el volumen del producto debe ser

igual o menor a la inicial y por qué?

Referencias

74
Objetivos:
Conocer las diferentes técnicas de purificación de Inmunoglobulinas
utilizadas en los laboratorios de Inmunología.

Precipitar Inmunoglobulinas del tipo IgG con sulfato de amonio, para su

posterior purificación mediante la técnica de diálisis.

Introducción:
La purificación de inmunoglobulinas humanas constituye el paso inicial para
obtención de antisueros de gran utilidad en el diagnóstico de diferentes
patologías. Los anticuerpos, sin importar su clase o subclase, se producen y
purifican en dos formas básicas para su uso como reactivos en inmunoensayos:
policlonales y monoclonales.

Los anticuerpos son proteínas, por lo que los métodos de purificación a partir de
muestras biológicas (suero, fluido ascítico o sobrenadante de cultivo) son formas
especializadas de los métodos de purificación de proteínas. La purificación se
puede hacer en forma cruda, es decir, precipitando todas las inmunoglobulinas y
otras proteínas, o solo los anticuerpos que puedan fijarse a un antígeno específico.
La purificación cruda de anticuerpos se puede hacer con diferentes métodos como
precipitación con Sulfato de amonio, adsorción tiofílica o cromatografía de
intercambio iónico.

La solubilidad de una proteína depende del balance relativo entre las interacciones
proteína-solvente, lo cual tiende a mantenerla en solución y de las interacciones
proteína-proteína, las cuales hacen que la proteína se agregue y precipite. La
fuerza iónica de las soluciones es de particular importancia para especificar cuál
de estos tipos de interacciones predomina.

Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para precipitar las proteínas a

causa de su gran solubilidad. La adición gradual de esta sal permite el
fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas, pero no

75
desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de
precipitación, permite solubilizar nuevamente las proteínas.
Luego, las proteínas precipitadas pueden separarse mediante centrifugación y
posteriormente pueden ser disueltas en una solución amortiguadora y dializada
por varios días para eliminar el sulfato de amonio. (Fig. 1)

Figura 1. Esquema de diálisis.

En la cromatografía por afinidad, un ligando es unido a un soporte sólido, como

por ejemplo gel de bolas de agarosa. La muestra fluida pasa a través del soporte
material permitiendo que las inmunoglobulinas se unan al ligando inmovilizado,
mientras que los componentes que no se han unido se lavan y diluyen del soporte.
Posteriormente se agrega una solución amortiguadora que cambie las condiciones
del medio y haga que se rompa la unión entre la inmunoglobulina y el ligando de
manera que el anticuerpo se encuentre de forma purificada.

Comúnmente se utilizan compuestos proteínicos como la proteína A, proteína G y

sus formas recombinantes, de Staphylococcus aureus y Streptococcus spp.,
respectivamente, que se unen a la región Fc de las inmunoglobulinas y son las
más escogidas para purificar IgG por afinidad.

76
Materiales Hilo cáñamo
Soporte universal 1 recipiente de plástico
1 bureta graduada de 50mL Agitador magnético
Pinzas para bureta Barra magnética
1 vaso de precipitado de 500mL Pipetas Pasteur
2 vasos de precipitado de 100mL. Material para venopunción
1 gradilla. Reactivo
10 tubos de ensaye 13x100 Solución saturada de sulfato de
Membrana de Diálisis amonio (NH4)2SO4

Diagrama de flujo 6

R1: Agujas, depositar en

contenedor rígido para
punzocortantes RPBI.
R2: Tubo con restos de
sangre, depositar tapado en
bolsa roja RPBI.

77
Metodología

1. Separación de suero
Obtener 20mL de sangre completa por venopunción e incubar 15min. A 37º C
para favorecer la formación de coágulo. Centrifugar a 90g por 10min. y separar
el suero.
2. Armado de soporte Universal. (Fig. 5)

Figura 5. Armado de soporte Universal

3. Precipitación con Sulfato de Amonio
Colocar 20mL de suero en un vaso de precipitados dentro del baño de hielo
Adicionar 20mL de (NH4)2SO4 con la bureta y mantener agitación constante con
la barra magnética por 15min. Transferir el precipitado formado a un tubo de
ensaye y centrifugar a 700g durante 30min.
Decantar el sobrenadante y disolver el precipitado en 10mL de agua destilada,
volver a precipitar con 5mL de (NH4)2SO4 y agitación constante por 15 min.
Transferir el precipitado obtenido a un tubo de ensaye y volver a centrifugar
repitiendo las condiciones anteriores. Decantar el sobrenadante y disolver el
precipitado en 5mL de agua destilada. Medir el volumen.
4. Diálisis
Hervir la membrana de diálisis por 5 min. en agua destilada y posteriormente
cerrar uno de los extremos con hilo cáñamo. Colocar el precipitado antes disuelto
en la membrana y cerrar el otro extremo. Colgar las membranas de diálisis de una
varilla de vidrio y colocarlas dentro de un vaso de precipitados con agua destilada.
Realizar la diálisis por 7 días cambiando el agua destilada cada 24 horas. Una vez

78
terminada la diálisis recuperar el contenido de la membrana, medir su volumen y
congelar para su posterior uso.

Resultados
Tabla 1. Resultados de los volúmenes obtenidos tras la diálisis

Volumen inicial (mL) Volumen final (mL) Observaciones

Discusión

79
Conclusiones

Referencias:

80
1. ¿Qué es una curva de calibración y cómo se realiza?

2. Define solución patrón, solución blanco y sustancia

estándar.

3. ¿En qué se basa el método de Kjeldahl y por qué se

considera el estándar de oro?

81
 4. ¿A qué se debe que las proteínas tengan su pico máximo
de absorbancia a 280nm?

5. ¿Cuáles son las 2 reacciones que se llevan a cabo en el

método de Lowry?

Referencias

82
Objetivos:
Conocer los métodos para la cuantificación de proteínas más utilizados en
los laboratorios del área biológica.

Determinar la concentración de proteínas presentes en el dializado de la

práctica anterior mediante la técnica de Lowry, con el fin de verificar la
eficacia de la purificación .

Introducción:
Las principales moléculas que intervienen en una reacción de carácter inmunitario,
es decir, Antígenos y Anticuerpos por lo general son de naturaleza peptídica-
proteica. Para la realización de diferentes pruebas tanto cuantitativas como
semicuantitativas es necesario conocer las concentraciones de dichas moléculas.
La cantidad de proteínas en la muestra analizada puede estimarse por diversos
métodos. Los ensayos colorimétricos involucran la adición de una sustancia
química que es capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacídicos.

El resultado de estas reacciones es el cambio de color en la solución, que es

cuantificado mediante una medida de absorbancia. En general, estos métodos son
más sensibles que la cuantificación por absorbancia directa a 280 nm.
Posteriormente, para determinar la concentración de proteínas totales de la
muestra a analizar los resultados de absorbancia se interpolan en una curva de
calibración construida de una proteína estándar, por lo general albúmina sérica
bovina (BSA) y albumina, cuya concentración es conocida. Los ensayos
colorimétricos más utilizados son:

Bradford (595nm): Se basa en la unión de un colorante, Azul de

Comassie G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. Las proteínas se
unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un
coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.

83
 Lowry (750 nm): Se trata de una reacción de redox basada en la
reacción de las proteínas con el reactivo de Folin dando un complejo de
color. Este reactivo es una disolución de tungstato sódico y molibdato
sódico en ácido fosfórico y ácido clorhídrico. El mecanismo del proceso es el
siguiente: el Cu2+, en medio alcalino, forma un complejo con los enlaces
peptídicos de las proteínas reduciéndose a Cu+. Este ion, así como los grupos R
de los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas, reaccionan con el reactivo
de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para
formar un compuesto de color azul.

BCA (Bicinchoninine acid assay) (562nm): El ácido bicinconínico, sal

sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso
con iones Cu1+en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método
analítico capaz de monitorizar el ion cuproso producido en una reacción entre las
proteínas con Cu2+en medio alcalino (reacción de Biuret).

El método de Kjeldahl: es el procedimiento estándar para la calibración

de los patrones de referencia de las otras técnicas puesto que es muy
preciso al cuantificar el nitrógeno presente en las mismas. La materia
orgánica de la muestra se oxida por digestión con ácido sulfúrico concentrado lo
que convierte al nitrógeno amínico en sal amónica. Luego se neutraliza el ácido,
con ese exceso de álcali y se destila el amoniaco recogiéndolo sobre un volumen
medido de disolución valorada de ácido, cuyo exceso se determina por valoración
con disolución valoradora de base.

Tabla 1. Comparación entre los métodos más comunes de cuantificación

de Proteínas
Método Ventajas Desventajas
Absorción A bajas concentraciones absorben de manera La muestra debe estar pura, ya que otras
a 280nm proporcional con su concentración. Rápido y moléculas no-proteínicas también absorben
sencillo. a esa longitud de onda.
Bradford Este método es sensible, simple, rápido y Interfieren los detergentes y las soluciones
barato. Pocas sustancias interfieren en su básicas.
determinación.
Lowry Es rápido, sencillo y relativamente sensible. Es afectado por un amplio rango de
compuestos no proteínicos como EDTA y
detergentes.

84
BCA Muy sensible, puede realizarse en un amplio Requiere de tiempos de incubación largos.
intervalo de temperaturas y es sencillo. Los Altamente susceptible a interferencias.
complejos coloreados son muy estables. No
interfieren los detergentes
Biuret Reacción es bastante específica, pocas La sensibilidad del método es muy baja y
sustancias interfieren. sólo se recomienda para soluciones muy
concentradas

Material Reactivos
1 gradilla Sulfato de Cobre pentahidratado 1%
10 tubos de ensaye de 13 x100 Tartrato de Sodio y Potasio 2%
1 pipeta de 2mL Carbonato de sodio 2% en NaOH
2 pipetas de 1 mL 0.1N
Espectrofotómetro con 2 celdas Patrón de Albúmina 1mg/mL en
1 matraz aforado de 100 mL solución salina fisiológica (SSF)
1 vaso de precipitados de 100 ml Reactivo de fenol 2 N
SSF
Diagrama de flujo 7

R1: Verter las

soluciones sobrantes
en la tarja con
abundante agua

85
 Metodología

1. Preparación de reactivos
Reactivo A: Realizar la siguiente mezcla: Tartrato de Sodio y Potasio al 2% 0.5mL
CuSO4-5H2O al 1% 0.5mL Na2CO3/NaOH al 2% 0.1N 49mL
Reactivo B: Realizar la siguiente mezcla: Reactivo Fenol (Folin-Ciocalteau) 2N
2.0mL y Agua destilada 2.0 mL.
2. Preparación de la curva

Tabla 2. Curva Patrón para la cuantificación de Proteínas en mL

Muestra Muestra
Blanco 1 2 3 4 5 6 7
1 2
Estándar 0 0.02 0.04 0.06 0.1 0.2 0.3 0.4 0 0
SSF 0.4 0.38 0.36 0.34 0.3 0.2 0.1 0 0.36 0.39
Muestra 0 0 0 0 0 0 0 0 0.04 0.01
Reactivo A 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Mezclar y dejar en reposo 10min.
Reactivo B 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Mezclar y dejar en reposo 30min.
3. Lectura de Curva y Muestras
Ajustar el espectrofotómetro a λ = 550 nm y leer
4. Determinación de la concentración proteínica
Con los resultados obtenidos realizar una gráfica de regresión lineal en papel
milimétrico, graficando la concentración de proteína contra la absorbancia.
Interpolar la absorbancia de las muestras problema para conocer su
concentración.

Cálculos y Resultados

86
 Tabla 3. Resultados de la Curva Patrón de Albúmina
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 Muestra 1 Muestra 2
[Alb]
mg/mL
Abs

Gráfica 1. Concentración de Proteína en mg/mL en función de la

Absorbancia

87
Discusión

88
Conclusiones

Referencias:

89
1. Definir inmunización activa y pasiva, así como las diferencias
entre ellas

2. ¿Qué es un inmunomodulador?

3. Mencionar el fundamento de la acción del ACF y AIF

90
 4. ¿Qué animales de laboratorio son los más utilizados para
obtener anticuerpos policlonales y cuáles son las vías de
administración más empleadas?

5. ¿Cómo se lleva a cabo el cambio de isotipo de IgM a IgG y

por qué?

Referencias

91
Objetivos:
Conocer las diferentes formas de inmunización más utilizadas así como los
adyuvantes más comunes en las prácticas de inmunología.

Inmunizar ratones hembras, de seis semanas de nacidas con peso de 18

a 20g, con IgG Humana por tres semanas con Adyuvante de Freund
completo e incompleto con el fin de obtener títulos altos de anticuerpos anti IgG
humana.

Estudiar el papel que juegan el antígeno, los anticuerpos y los adyuvantes

en los mecanismos de regulación del sistema inmunitario mediante
la inmunización de ratones..

Introducción:
La Inmunización es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un
individuo competente desarrolla una respuesta inmunitaria al entrar en contacto
con un inmunógeno. El tipo y magnitud de la respuesta producida se deben a
múltiples variables entre ellas se encuentra: la inmunogenicidad de un antígeno,
que depende de su complejidad estructural, peso molecular, conformación y
naturaleza química, dosis, vía de administración, entre otras.

La síntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra moléculas específicas que el

organismo no reconoce como propias (determinantes antigénicos), para que esta
síntesis ocurra, primero debe existir un contacto entre las células encargadas de
la síntesis y el determinante antigénico, contacto que es mediado por algunas
células involucradas en la respuesta celular.

Cuando un organismo se expone a un antígeno desconocido, el sistema inmune

puede requerir mucho tiempo para producir cantidades apreciables de
anticuerpos. Al final de la infección la concentración alcanzada
de anticuerpos declina. A tal respuesta se le llama primaria. Cuando el organismo
se expone posteriormente al antígeno, la respuesta ocurre mucho más
rápido y la concentración alcanzada, es apreciablemente mayor, en este caso

92
se habla de respuesta secundaria. Existen dos tipos de inmunización:
Inmunización pasiva: Consiste en la inyección de anticuerpos o suero
inmunitario en un receptor no inmunizado, como en el caso de los
lactantes que poseen inmunidad pasiva, dado que ellos nacen con los
anticuerpos que les transfiere la madre a través de la placenta. Dichos
anticuerpos desaparecen entre los 6 y 18 meses de edad. Otra forma de obtener
la inmunidad pasiva es con la gammaglobulina, la cual es suministrada
por un médico y cuya protección es también temporal. Inmunización activa: Se
trata de la inmunización con un antígeno a través de la aplicación de vacunas
y preparados antigénicos atenuados con el fin de generar una respuesta
inmunitaria por parte del organismo.

Tabla 1. Tipos de Inmunización

Tipo de
Clasificación Ejemplo
Inmunización
Natural Inmunidad
Pasiva
Artificial Inmunosueros
Natural Infección
materna
Activa
Artificial Vacunas

La aplicación práctica de los antisueros es muy diversa, pues se puede utilizar con
fines terapéuticos (inmunización pasiva), en diversos estados infecciosos o
tóxicos (neumonía lobar, tétanos, entre otros). Además son útiles en la
identificación de microorganismos aislados de procesos infecciosos y en la
clasificación taxonómica de diversas especies. También han servido como
herramienta de trabajo para dilucidar mecanismos inmunológicos básicos
(especificidad inmunológica, activación del complemento, fagocitosis y
citotoxicidad) y en la determinación rápida y específica de la naturaleza de
diversas sustancias químicas (proteínas, carbohidratos, haptenos, entre otros).
Las sustancias inmunomoduladoras constituyen una familia muy
heterogénea si se toman en consideración su origen, naturaleza
química y actividad biológica específica. Dentro de ellas ocupan un lugar
muy importante los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen
dos funciones fundamentales: la estimulación de la resistencia no específica del

93
hospedero contra las enfermedades infecciosas y el cáncer; y por otra parte,
la potenciación de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y
de la respuesta de los animales de laboratorio durante la inmunización
experimental con vistas a la producción de antisueros.
Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que, incorporados al
antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta
inmunitaria. Con su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, así
como un mayor nivel de anticuerpos específicos. Algunos ejemplos de
los adyuvantes más utilizados son los siguientes:
Adyuvante Completo de Freund (FCA): Formado por el detergente Arlacel
A para emulsificar el adyuvante incompleto (FIA) en aceite mineral, al que se le
añaden micobacterias muertas. El FIA es suficiente para inducir la formación de
anticuerpos frente a muchos Antígeno, pero el FCA es capaz de producir una
respuesta celular y maduración de la respuesta humoral.
El FCA es el adyuvante más usado en los laboratorios, pero no se usa en humanos
por producir reacciones granulomatosas.
Sales de Aluminio El segundo adyuvante más empleado es el alumbre (hidróxido
de aluminio o fosfato de aluminio). Estimula la respuesta humoral y es el único
que se usa en vacunas humanas. La eficacia es máxima cuando se usa con
toxoides bacterianos y en la vacuna contra el VHB (Virus de la Hepatitis B).
La mayoría de las veces sólo se logra una respuesta adecuada llevando a cabo
más de un estímulo antigénico, asegurando así que se obtendrán títulos altos
de anticuerpos o el número deseado de células especificas
estimuladas. En la práctica de la inmunología comúnmente se
usan los conejos o los ratones, con excepción de la vía intravenosa, la primera
inoculación del antígeno se hace en presencia de adyuvante completo, dando 2
o 3 estímulos más con adyuvante incompleto y posteriormente un último
reto sin adyuvante por otra vía.
La combinación de vías, dosis e intervalos entre los estímulos debe
ser probada empíricamente cuando se trate de un antígeno o una especie que
no hayan sido trabajados antes.

94
Regulación
La intensidad de la respuesta inmune tiene que estar controlada, ya que una
respuesta demasiado vigorosa podría dañar al organismo: se han desarrollado,
por tanto, mecanismos homeostáticos para mantener la respuesta inmune
regulada. La tolerancia inmunológica forma parte de dicha regulación, al evitar
que se monte una respuesta contra antígenos propios, mediante
mecanismos específicos tanto centrales (órganos primarios) como
periféricos (órganos secundarios).
En un sujeto cualquiera de una especie dada, la intensidad de la respuesta inmune
frente a un antígeno extraño (infección o inmunización) está regulada por 3
principales mecanismos:
Antígeno: Existen varios factores que afectan la regulación como son la
naturaleza del antígeno, la vía de entrada y la dosis, ya que como se muestra
en la figura 1, dosis muy altas o muy bajas pueden inducir tolerancia. Además
cuando el antígeno es eliminado, los linfocitos B y T vuelven a una situación
de reposos y la respuesta inmune va disminuyendo de intensidad.

Figura 1. Tolerancia frente a un antígeno

Anticuerpo: El anticuerpo producido frente al antígeno, regula negativamente la
respuesta al bloquear las interacciones entre el epítopo y el BCR así como al
receptor FC presentes en los linfocitos B: esto inhibe la proliferación del linfocito
y por la tanto la diferenciación a célula plasmática, lo que frena la producción de
anticuerpos. Los anticuerpos también pueden regular la respuesta mediante la red
idiotipo anti idiotipo. Regulación por células:

95
Existen células reguladoras (Treg) que secretan citocinas como: IL-10 y
TGF-β que impiden la activación de linfocitos T. Cuando se quieren obtener
anticuerpos específicos contra cierto antígeno y se realiza una inmunización es
importante, además de la dosis de antígeno, tener en cuenta el cambio de isotipo
de IgM a IgG que se lleva acabo de manera natural en una respuesta ante un
antígeno cualquiera. (Fig. 2)

Figura 2. Cambio de Isotipo IgM- IgG

Material Reactivos
4 jeringas de Insulina IgG humana comercial
Adyuvante de Freund Completo
e Incompleto

96
Diagrama de flujo 8

R1 y R2. Agujas: Desechar en contenedor rígido.

R1. Material con sangre: Depositar en un contenedor con hipoclorito de sodio al
6%.

97
Metodología
1. Selección de ratones
Seleccionar ratones hembras de aproximadamente seis semanas de nacidas con
un peso de 18 a 20 g, que no hayas sido enfrentadas a ningún antígeno
previamente.
2. Obtención de muestra sanguínea
Colocar al animal sobre una jaula y fijar la cola de forma horizontal, procurando
que la vena caudal quede a la vista. Limpiar la cola con Alcohol al 70 %. Introducir
una jeringa con aguja para insulina calibre 25x16 mm a la vena y tomar 1 mL de
sangre.
3. Cuantificación de proteínas
Cuantificar las proteínas totales presentes en la muestra por medio de la
técnica de Lowry (ver práctica 4)
4. Preparación de antígeno
Utilizar IgG humana obtenida a partir de la diálisis, a una concentración de 50 μg
en 0.1 ml, adicionar el Adyuvante completo de Freund (FCA) para la primera dosis
y el Adyuvante incompleto de Freund (FIA) para las dosis posteriores en forma
de emulsión (de una jeringa a otra que no se disuelva) a la concentración
comercial y en un volumen de 0.1 ml.
5. Primera inoculación de antigeno
Inocular el antigeno preparado con el adyuvante via subcutanea en la región
dorsal de la manera siguiente: Elegir la zona de inoculación, cortar el pelo del
animal y limpiar con alcohol al 70%, levantar ligeramente la piel e introducir la
aguja (calibre 25x16 mm) lateralmente, aproximadamente una tercera parte de
la aguja, e inyectar la solución en el lomo en dos o cuatro lugares
6. Segunda y tercera inoculación de antígeno
Repetir la inmunización a los 7 y 14 días después de la primera inoculación
como se explica en el paso 5.
7. Obtencion de muestra sanguínea
Repetir paso 2, después de 7 días de la tercera inmunización.

98
 8. Titulación de anticuerpos
Almacenar el suero a 4ºC para su posterior uso.

Cálculos y Resultados

Tabla 2. Resultados de la inmunización de ratones con IgG humana

Título de anticuerpos
Fecha α IgG humana Observaciones
Inicio:

Final:

99
Discusión

100
Conclusiones

Referencias:

101
1. Describir brevemente las funciones de los órganos
inmunológicos

2. En un esquema identificar los principales órganos

inmunológicos del ratón

3. ¿Cuáles son las características del tejido linfoide asociado y

porque es importante en la respuesta inmune?

102
 4. ¿Cuáles son las diferentes zonas que conforman un ganglio
linfático y que células se encuentran en cada una de ellas?

5. ¿Qué poblaciones celulares se encuentran en los órganos

que se van a estudiar?

Referencias

103
Objetivos:
Sacrificar a los ratones previamente inmunizados con el propósito de
localizar in situ los órganos linfáticos visibles del ratón como son: Ganglios
linfáticos, axilares, inguinales y mesentéricos; Timo, bazo, placas de Peyer y
medula ósea con el fin de conocer la posición anatómica, apariencia, color y
textura de los mismos.

Obtención de una suspensión celular a partir de los órganos antes

mencionados, purificación y medición de la viabilidad con azul de Tripán en
cámara de Neubauer y por microscopia óptica a 40x.

Introducción:
El Sistema Inmune está formado por células, tejidos y órganos con un origen
embriológico común: el mesodermo. Los órganos linfoides son tejidos
organizados que contienen un gran número de linfocitos tras un armazón de
células no linfoides. En la arquitectura de estos órganos participa especialmente
el tejido reticular, en el cual es necesario distinguir dos componentes: las células
reticulares y las fibras reticulares. Las primeras forman una esponja gracias
a las prolongaciones citoplasmáticas que se anastomosan o conectan entre
sí, y que junto a los macrófagos e histiocitos forman el sistema reticuloendotelial.
Ellas secretan las fibras reticulares que forman una red que sostiene los elementos
linfoides; si bien se modifica para dar a cada uno de ellos sus características
morfológicas y funcionales específicas, su función es la de filtrar la linfa y la sangre,
retirar de ellas las moléculas extrañas que son luego fagocitadas por los
macrófagos. Por otra parte, retienen las partículas antigénicas para presentarlas
paulatinamente a los linfocitos.
En estos órganos, las interacciones que establecen los linfocitos con células no
linfoides son importantes, bien para desarrollo, bien para la iniciación de
respuestas inmunitarias adaptativas, o bien para el sustento de los linfocitos. Los
órganos linfoides se pueden clasificar de forma genérica en órganos linfoides
primarios o centrales, donde se generan los linfocitos, órganos linfoides

104
periféricos o secundarios, en los que se inician las respuestas inmunitarias
adaptativas al facilitar el encuentro entre las células presentadoras de antígeno y
los linfocitos y órganos linfoides terciarios en los que se alojan a las células de
memoria y en los procesos infamatorios crónicos son los sitios ectópicos donde
se organizan estructuras linfoides in situ.
Órganos linfoides primarios:
Medula ósea. Es un órgano de gran tamaño, de 3000 a 4000
gramos y se encuentra localizado en forma dispersa en el interior de
los huesos. Sirve de albergue a la célula básica o pluripotencial, de
la cual se originan las células inmunitarias (mononucleares y polimorfonucleares).
Los linfocitos representan del 10 al 20 % de las células de la médula ósea. Los
linfocitos B maduran dentro de este órgano y una vez finalizada su diferenciación,
entran en la circulación sanguínea, desde la que migran a los órganos linfoides
secundarios.
Timo. Constituye el órgano central de la inmunidad celular. Se origina en
el tercero y cuarto arcos faríngeos, durante la sexta u octava semana de
gestación (Fig. 1). Es un órgano constituido por una estructura epitelial
esponjosa en cuyo interior se encuentran los linfocitos, de esta estructura salen
prolongaciones que rodean los vasos sanguíneos para formar una cápsula o
doble barrera que evita la entrada de antígenos y de células linfoides que no hayan
adquirido, en la médula ósea, los receptores de membrana afines a los receptores
del endotelio de los capilares venosos tímicos. Al igual que los linfocitos
B, los linfocitos T una vez finalizada su maduración y diferenciación salen del
timo y migran a los órganos linfoides secundarios.

Figura 1. Estructura y ubicación anatómica del Timo

105
Órganos linfoides secundarios:
Ganglios linfáticos. Se trata de órganos pequeños en forma de riñón,
situados estratégicamente en las zonas de drenaje de canales linfáticos
de la mayor parte de los órganos del cuerpo humano (Fig. 2).
Dichos órganos constituyen el punto de convergencia de los vasos del sistema
linfático que recolectan el fluido extracelular de los tejidos y lo devuelven a la
sangre. Durante el tránsito por el ganglio la linfa sufre un proceso de filtración por
el cual se retienen las partículas extrañas que son fagocitadas por macrófagos o
células dendríticas para posteriormente presentarlas de forma paulatina a los
Linfocitos T y B.

Figura 2. Estructura de un Ganglio Linfático

Bazo. El bazo es un órgano del tamaño de un puño (en el humano)
situado justo tras el estómago y constituye un órgano de función mixta:
hematológica e inmunológica. Desde el punto de vista inmunitario
representa un filtro que atrapa los antígenos que hayan entrado. La cantidad de
linfocitos que pasan por el bazo en un tiempo determinado supera a la que circula
por los demás órganos linfoides.
GALT, BALT, MALT, SALT y NALT. El tejido linfoide asociado al tubo
digestivo (gut-associated lymphoid tissue o GALT) incluye al apéndice y
estructuras especializadas del intestino delgado denominadas Placas de
Peyer (Fig. 3), que recogen el antígeno de las superficies epiteliales de la vía
intestinal por medio de células especializadas llamadas células multifenestradas o
células M. Agregados de linfocitos organizados de forma similar, aunque
dispuestos de manera difusa, protegen la vía respiratoria, donde se denominan
tejido linfoide asociado a los bronquios (bronchial-associated lymphoid tissue o
106
BALT), así como otras mucosas, donde se denominan, tejido linfoide asociado a
mucosas (mucosal-associated lymphoid tissue o MALT). Entre estas últimas
se puede incluir el tejido linfoide asociado a la nariz: amígdalas y adenoides
(nasal-associated lymphoid tissue o NALT) y aunque es similar, una excepción
es el tejido linfoide asociado a la piel (skinn- associated lymphoid tissue o SALT)
porque no está relacionado con las mucosas.

Figura 3. Corte histológico del intestino sonde se observan las Placas de

Peyer (P)
El Apéndice como órgano inmunológico
El apéndice es una prolongación delgada y larga que pende del ciego, dado que
es un fondo de saco ciego, el contenido intestinal puede quedar atrapado en el
apéndice lo que con frecuencia conduce a inflamación e infección. Posee nódulos
linfáticos abundantes, lo que lleva a pensar que tiene una función inmunológica.
Varios datos recientes sugieren que (junto con el ciego y el íleon terminal) sería
el órgano “bursaequivalente” de los mamíferos, es decir, la parte del sistema
inmunológico inmaduro en la que los linfocitos B potenciales alcanzan la
inmunocompetencia (equivalente de la bolsa de Fabricio de las aves).
Material 3 portaobjetos
1 gradilla Tabla de disección
10 tubos de ensaye de 13 x100 Cámara de anestesia
3 pipetas Pasteur Reactivos
Equipo de disección 100 mL de SSF/ PBS pH = 7.4
3 coladeras Azul de Tripan
3 émbolos de jeringas Tinción de Giemsa
2 cajas de Petri Cloroformo
2 pipetas de 2 mL Patrón de Albúmina
Cámara de Neubauer

107
Diagrama de Flujo 9

R1, R2- Residuos anatómicos; envolver en papel y desechar en bolsa amarilla

en el contenedor especial para su posterior incineración.

108
Metodología
1. Obtención de muestra sanguínea a ratones inmunizados
Colocar los ratones previamente inmunizados (Práctica 9) en una cámara y
saturar el ambiente colocando cloroformo dentro de un vaso de precipitados
con algodón. Una vez anestesiados colocarlos sobre la mesa y extraer 1 mL de
sangre por punción cardiaca.
2. Sacrificio de ratones
Sacrificar a los ratones inmunizados por
exceso de anestesia en la cámara saturada
de cloroformo. Sacrificar a los demás ratones
por la técnica de dislocación cervical (Cada
integrante del equipo debe tener un ratón).
3. Localización de Ganglios linfáticos
Incidir en la piel desde la laringe hasta la
pelvis, localizar e identificar los ganglios
linfáticos inguinales y axilares como se
muestra en la Fig. 4.
Figura 4. Anatomía de un ratón
4. Obtención de órganos
Realizar la disección del ratón, identificar y obtener el bazo, timo y placas de
Peyer basándose en la imagen. Con ayuda de bisturí y tijeras obtener el fémur del
ratón, posteriormente retirarle los restos de tejido muscular.
5. Maceración y lavado
Macerar individualmente los órganos extraídos con la coladera y el embolo
agregando 2 mL de SSF (excepto el femur). Realizar dos lavados centrifugando
con SSF y por último resuspender con 1mL de SSF.
Una vez que el fémur esté limpio realizarle varios cortes transversales, utilizando
bisturí y tijeras, finalmente colocarlos en un portaobjetos y fijar con cinta adhesiva
transparente.

109
 6. Frotis y tinción
Realizar un frotis de cada una de las
suspensiones celulares obtenidas y teñirlas con
Giemsa. Realizar un conteo diferencial de al
menos 100 células.
En el caso de la medula ósea observar el tejido
en el microscopio con el objetivo de 5X,
identificando la estructura de la misma como se
muestra en la Fig 5.
7. Prueba de Viabilidad
Realizar una dilución 1/20 de cada una de las
suspensiones con SSF. Mezclar una gota de la
dilución con una gota de azul de Tripán. Contar
a 40x en la cámara de Neubauer y determinar el
porcentaje de viabilidad (Ver practica 3).

Figura 5. Estructura del Fémur

Cálculos y resultados
Tabla 1. Resultados obtenidos del conteo diferencial de órganos de
Ratón
Total de
Órgano Linfocitos % Monocitos % PMN%
Células/mL
Bazo
Timo
Placas de
Peyer

110
Tabla 2. Resultados obtenidos de la prueba de viabilidad de células de
órganos de Ratón
Órgano Número de Número de Porcentaje de
[Link]/mL [Link]/mL viabilidad
Bazo
Timo
Placas de Peyer

Figura 6. Imágenes de los órganos y células obtenidos tras el sacrificio

111
Discusión

112
Conclusiones

Referencias:

113
1. Describir el fundamento de la técnica de ELISA

2. Esquematizar las variantes más comunes de ELISA

3. ¿Por qué es necesario bloquear la placa de ELISA?

114
 4. ¿Qué enzimas se utilizan para esta prueba y cuáles son sus
sustratos?

5. Mencionar 5 utilidades de la técnica de ELISA

6. Mencionar 3 diferencias entre ELISA y Western Blot

7. Cuál es el fundamento de la Inmunocromatografía

Referencias

115
Objetivos:
Determinar la presencia de anticuerpos en muestras biológicas, como
diagnóstico indirecto de infección a través del inmunoensayo enzimático
ELISA..

Determinar el título de anticuerpos obtenidos tras la inmunización

de ratones en la práctica 9 para corroborar la veracidad del proceso de
inmunización.

Realizar pruebas de inmunocromatografía para diagnóstico, con el fin de

comprender el fundamento de dichas pruebas.

Introducción:
Una de las técnicas inmunológicas más usadas, dada su alta especificidad es
la ELISA por sus siglas en inglés enzyme-linked immuno-sorbent assay, dicha
técnica es extremadamente económica con respecto al uso de reactivos y permite
realizar un gran número de pruebas en un tiempo relativamente corto. ELISA
utiliza anticuerpos que se unen covalentemente a las enzimas; de este modo
se conservan las propiedades catalíticas de las enzimas y la especificidad de los
anticuerpos. Las enzimas de unión típicas utilizadas, catalizan reacciones cuyos
productos son coloreados y pueden medirse en cantidades muy pequeñas.
Se han desarrollado diversas variantes de ELISA, ELISA Directo ELISA Indirecto
y el ELISA de captura o “en sandwich”. En los ELISA directo e indirecto, el
antígeno se adsorbe sobre la fase sólida (placas con pozos de un plástico
especial o placas de microtitulación), en el ELISA en sandwich las placas se
sensibilizan con anticuerpos dirigidos contra el antígeno problema. (Fig. 1).

116
 Figura 1. Esquema de la ELISA de captura o “Sandwich”
El ELISA directo comúnmente se utiliza para cuantificar antígenos conocidos, el
indirecto para buscar y cuantificar anticuerpos contra antígenos conocidos, el
ELISA en sandwich se utiliza para la búsqueda y cuantificación de antígenos o
anticuerpos bien definidos. Las soluciones para la dilución de los reactantes y el
lavado de los pozos son variadas, la más utilizada es el regulador de fosfatos 0.01
M en solución salina (PBS). Un paso que no se puede obviar en las técnicas de
ELISA es el bloqueo de los pozos con soluciones de proteína ajenas al el substrato
de la enzima, a veces se requiere del uso simultáneo de un cromógeno por que
no desarrolla color per se (como en el caso de la peroxidasa, donde además de
peróxido de hidrógeno se utiliza orto- fenilendiamina o algún otro cromógeno),
en otras ocasiones el sistema Ag-Ac en estudio. Los bloqueadores más utilizados
son albúmina (bovina, humana o de huevo, según el ensayo), gelatina,
caseína y le leche descremada, todos ellos a la concentración del 2 al 3% en PBS.

117
Los anticuerpos de detección son anticuerpos dirigidos contra alguno de los
reactantes (antígeno o anticuerpo problemas), acoplados a enzimas. Las enzimas
de mayor uso son la peroxidasa de rabano, la fasfatasa alcalina y la β-
galactosidasa, pero no son las únicas. Para el revelado del sistema se
utiliza cromógeno forma parte del substrato como en el caso de la fosfatasa
alcalina (p-nitrofenil fosfato) y de la β-galactosidasa (0-nitrofenil β-D-
galactopiranosido). El cromógeno es necesario para que el producto resultante
tenga algún color.
ELISA para Diagnóstico
Materiales Reactivos
1 Gradilla Equipo de Diagnóstico disponible
1 Juego de Micropipetas Agua Destilada Estéril
Diagrama de flujo 10

R1- Agujas: Desechar en contenedor

rígido
R2- Material con suero: Depositar en un
contenedor con hipoclorito de sodio al
6%

118
Metodología ELISA para Diagnóstico
1. Obtención de muestra sanguínea
Obtener 10 mL de sangre completa (sin anticoagulante) por venopunción
2. Separación de Suero
Incubar 15 min. a 37º C el tubo de sangre para favorecer la formación del
coagulo. Centrifugar a 90 g por 10 min. y separar el suero.
3. Preparación de reactivos
Temperar los reactivos y seguir las instrucciones del equipo de diagnóstico
disponible.
4. Dilución de Muestra
Diluir la muestra según lo indique el equipo de diagnóstico disponible.
5. Adición de Suero
Colocar 200μl de suero diluido y testigos (positivo, negativo y sin conjugado)
en los pocillos e incubar la placa a 37 ºC por una hora.
Desechar el contenido de los pocillos en una bandeja con hipoclorito de sodio al
6% y realizar 4 lavados con 350μL de la solución de lavado.
Secar los pocillos golpeándolos ligeramente sobre papel absorbente para eliminar
toda la solución de lavado.
6. Adición de conjugado
Agregar 200 μL del conjugado a cada pozo (excepto al testigo sin conjugado)
y agitar delicadamente. Incubar la placa a 37 ºC por una hora.
Nuevamente desechar el contenido de los pocillos y realizar 4 lavados.
7. Adición de sustrato y cromógeno
Adicionar 200 μL del sustrato cromogénico y dejar la reacción desarrollarse en
la obscuridad durante 30 min. a temperatura ambiente.
8. Paro de la Reacción
Detener la reacción enzimática añadiendo 100 μL de la solución de paro en cada
pocillo.
9. Lectura de resultados
Leer la densidad óptica a 450/620 nm con ayuda de un lector de placas.

119
ELISA para IgG de ratón
Material Reactivos
1 gradilla Conjugado (IgG de cabra anti ratón
1 juego de Micropipetas con peroxidasa)
Sustrato- Cromógeno (Peroxido-p-
nitrofenil fosfato)
Sol de paro (Ac. Sulfúrico 4 N)
Solución Salina Fisiológica SSF
Solución de lavado (PBS 1X)

Diagrama de flujo 11

R1- Material con suero: Depositar en un

contenedor con hipoclorito de sodio al 6%

120
Metodología de ELISA para IgG de ratón

1. Elaboración de placa para IgG de ratón

Colocar 1 μg/100μL de IgG humanas (obtenidas tras diálisis en práctica 3) en
cada pozo y dejar reposar a 37ºC durante una hora. Realizar 10 lavados con
PBS-Tween y bloquear con caseína a 37ºC por 1 hora
2. Preparación de reactivos
Temperar los reactivos necesarios para la ELISA
3. Dilución de Muestra
Diluir el suero obtenido de los ratones inmunizados, tras su sacrificio (Práctica
10), 1/10 y 1/20 con SSF
4. Adición de Suero
Colocar 100 μl de suero y testigo (sin conjugado) en los pocillos e incubar la
placa a 37ºC por una hora.
Desechar el contenido de los pocillos en una bandeja con hipoclorito de sodio al
6% y realizar 4 lavados con 350μL de la solución de lavado.
Secar los pocillos golpeándolos ligeramente sobre papel absorbente para eliminar
toda la solución de lavado.
5. Adición de conjugado
Agregar 100 μL del conjugado a cada pozo (excepto al testigo sin conjugado)
y agitar delicadamente. Incubar la placa a 37 ºC por una hora.
Nuevamente desechar el contenido de los pocillos y realizar 4 lavados.
6. Adición de sustrato y cromógeno
Adicionar 100 μL del sustrato cromogénico y dejar la reacción desarrollarse en
la obscuridad durante 30 min. a temperatura ambiente.
7. Paro de la Reacción
Detener la reacción enzimática añadiendo 100 μL de la solución de paro en cada
pocillo.
8. Lectura de resultados
Leer la densidad óptica a 450/620 nm con ayuda de un lector de placas.

121
Inmunocromatografía para Diagnóstico

Material Reactivos
1 juego de Micropipetas Inmunocromatografia de diagnóstico

Diagrama de flujo 12

R1- Material con suero:

Depositar en un contenedor
con hipoclorito de sodio al 6%

Metodología de Inmunocromatografía para Diagnóstico

1. Temperado de muestra
Atemperar la muestra de suero previamente utilizada (ELISA)
2. Colocación de muestra
Colocar 100 µL de la muestra en la parte inferior de la tira y dejar reposar por 3
a 5min.

Figura 2. Colocación de muestra (en S)

122
 3. Lectura de resultados
Concluido el tiempo leer los resultados como se muestra a continuación.

Figura 3. Posibles resultados de inmunocromatografía

Resultados

Tabla 1. Resultados obtenidos del ELISA Indirecto de Diagnóstico

Pozo DO Resultado (+/-)
Testigo sin suero
problema
Testigo sin conjugado

Testigo positivo

Testigo negativo

Problema

Problema

Figura 4. Resultados obtenidos del ELISA Indirecto de Diagnóstico

123
 Tabla 2. Resultados obtenidos del ELISA Indirecta para IgG de Ratón
Pozo DO Resultado (+/-)
Testigo sin suero
problema
Testigo sin conjugado

Problema

Problema

Figura 5. Resultados obtenidos del ELISA Indirecta para IgG de Ratón

Tabla 3. Resultados obtenidos de la Inmunocromatografía de Diagnóstico

Prueba de diagnóstico Resultados (+/-)

Figura 6. Resultados obtenidos de la Inmunocromatografía de

Diagnóstico

124
Discusión

125
Conclusiones

Referencias:

126
1. Describir brevemente 3 métodos de separación y purificación
de anticuerpos además de los que se realizarán en la práctica

2. ¿Qué condiciones deben cambiarse en la columna para eluir a

los anticuerpos específicos en la cromatografía de afinidad?

3. Realizar una tabla comparando las ventajas y desventajas de la

cromatografía de afinidad y la electroforesis

127
 4. ¿Cómo se forma el gel de poliacrilamida?

5. ¿Cuál es la función del SDS?

Referencias

128
Objetivos:
Conocer diferentes técnicas de separación de proteínas más utilizadas
como son la cromatografía y la electroforesis.

Realizar la separación de una mezcla de proteínas sometiéndolas a un

campo eléctrico utilizando como soporte un gel de poliacrilamida.

Introducción:
Con base en características como solubilidad, tamaño, carga y afinidad
específica de unión ha sido posible separar y purificar proteínas. Existe una
batería importante de técnicas de separación y purificación, como son la
cromatografía y la electroforesis.

Cromatografía de afinidad: Un método físico aplicable para la separación

de proteínas es la cromatografía que emplea, como fundamento para
la separación, la distribución de las sustancias en dos fases, una móvil
y otra estacionaria. La cromatografía de afinidad requiere de un enlace covalente
de un reactivo llamado ligando por afinidad, con un soporte sólido.

Los ligandos por afinidad característicos son anticuerpos, inhibidores de enzimas

u otras moléculas que en forma reversible y selectiva se enlazan a las moléculas
que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad.

Las moléculas que no se unen atraviesan la columna con la fase móvil. Después
de que se eliminan las moléculas indeseables, las moléculas retenidas pueden ser
arrastradas cambiando las condiciones de la fase móvil.

La fase estacionaria es un sólido como la agarosa o cuentas de vidrio poroso

en las que el ligando por afinidad está inmovilizado. La fase móvil en la
cromatografía por afinidad desempeña dos papeles distintos. Primero, debe
soportar el fuerte enlace de las moléculas del analito con el ligando. Después, una
vez que se han eliminado las especies indeseables, la fase móvil debe debilitar o
eliminar la interacción analito-ligando de modo que el analito pueda ser eluido.

129
En los laboratorios de inmunología este tipo de cromatografía se utiliza para aislar
anticuerpos específicos en una mezcla de proteínas (por ejemplo suero),
aprovechando la unión específica de los anticuerpos al antígeno. El antígeno se
inmoviliza en una matriz sólida (pequeñas bolas químicamente reactivas), que
se cargan en una columna, por la que a continuación se hace pasar la mezcla.
Los anticuerpos específicos se unen al antígeno y quedan retenidos en la
columna, mientras que el resto de las proteínas de la mezcla fluyen y se eliminan
mediante lavados. Entonces los anticuerpos específicos pueden eluirse y
recolectarse.

Fig 1. Ejemplo de una columna de afinidad para la detección de

Aflatoxinas (Afla Test VICAM)
Electroforesis: La electroforesis es una técnica de separación de
moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico. Las
moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una
velocidad determinada por su relación carga-masa.
La electroforesis de proteínas generalmente se lleva a cabo en geles de
poliacrilamida con un tamaño de poro característico, de manera que la separación
de las moléculas se basa en la filtración por el gel (tamaño y forma) así como en
la movilidad electroforética (carga eléctrica). El pH del gel es suficientemente
alto (por lo general alrededor de 9) como para que casi todas las proteínas tengan
cargas netas negativas y se muevan hacia el ánodo en el que se aplica la corriente.
Las moléculas de tamaño y carga similares se mueven en forma de banda a través
del gel, las proteínas más pequeñas migran más rápido que las proteínas
más grandes. Luego de la electroforesis las bandas separadas pueden visualizarse

130
en el gel mediante una técnica adecuada, por ejemplo, si se sumerge el gel en
una solución de un colorante que se una fuertemente a las proteínas como el azul
brillante de Coomassie. Este colorante permite detectar cantidades mayores a
0.1μg de cualquier proteína en una banda fina.
Dado que el colorante es preparado en una solución con ácido acético, la fijación
de las proteínas y su coloración ocurren al mismo tiempo. Una técnica efectiva
para separar mezclas de proteínas es en la que las proteínas son expuestas al
detergente iónico SDS antes y durante la electroforesis en gel. Las cadenas
polipeptidicas forman un complejo con moléculas cargadas negativamente del
SDS y migran por lo tanto como complejos, además se agrega un agente
reductor (β-Metanol) para romper cualquier unión –S-S- en las proteínas o entre
estas. El tratamiento con SDS elimina el efecto de las diferencias de forma, por lo
que la longitud de la cadena, que refleja la masa, es el único determinante de la
velocidad de migración de las proteínas en el gel.

Material Reactivos
Cámara de electroforesis Solución de monómeros
Fuente de poder TEMED
2 vasos de precipitados de 50mL SDS al 10%
2 vasos de precipitados de 200 mL Persulfato de amonio al 10%
1 vaso de precipitados de 500 mL Amortiguador TRIS-HCl pH = 6.8
1 matraz Erlenmeyer y pH = 8.8
1 pipeta Pasteur y propipeta Agar noble al 1%
1 triángulo de porcelana Agua destilada
1 Tripie Solución reguladora de corrimiento
Tela de asbesto Solución reguladora de muestra
Mechero Marcadores de peso molecular Azul
Tubos Eppendorf Micropipetas Baño de Coomassie
María Soluciones decolorantes I y II Carbón
Recipiente hermético activado
Agitador
Embudo Transluminador

131
Diagrama de flujo 13

R1- Gel de Poliacrilamida: Guardar en un recipiente hermético con

amortiguador a 4º C

132
Metodología
1. Armado de Cámara
Ensamblar los cristales de la cámara de electroforesis sellando con agar tres lados
como se muestra en la figura y dejar secar.
2. Preparación de reactivos y gel Reactivos:
Preparar los reactivos necesarios para el corrimiento según el anexo II.
Gel Separador: Preparar el gel según la concentración deseada (ver anexo II) y
justo antes de verterlo en la cámara agregar el TEMED y el Persulfato de Amonio.
Llenar la cámara a un 75%, cubrir con 150 µL de Isopropanol dejar gelificar y
desechar el Isopropanol.
Gel concentrador: Preparar el gel (ver anexo II) y verter en la cámara. Colocar el
peine para formar los carriles.
3. Preparación de Muestra
Colocar de 20 a 30 µg de la muestra a separar en tubos eppendorf y agregar el
mismo volumen de la solución reguladora de muestra. Hervir 3 minutos en baño
María.
4. Colocación de Muestra en gel
Llenar los tanques superior e inferior con la solución de corrimiento y colocar las
muestras y marcadores de peso molecular, en los carriles, con ayuda de una
micropipeta.
5. Corrimiento electroforético
Conectar los cables de la corriente eléctrica en los polos
correspondientes, prender la fuente de poder a 70 volts y dejar correr
hasta la separación total de las proteínas.
6. Tinción del gel
Una vez terminado el corrimiento desmontar la cámara y retirar el gel. Colocar el
gel en un recipiente hermético con Azul de Coomassie. Desteñir el gel con el
decolorante I (ácido acético, metanol y agua), se deben observar bandas
reveladas y finalmente colocar en decolorante II.
7. Determinación de movilidad relativa (Rf)
Colocar en el transluminador y medir la distancia recorrida por el frente del
disolvente y cada una de las muestras, para calcular el Rf:

133
Resultados

Tabla 1. Resultados obtenidos del Corrimiento Electroforético

Contenido de Pozo RF Peso molecular

Marcadores de PM

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Figura 2. Resultados obtenidos del Corrimiento Electroforético

134
Gráfica 1. Grafica de Rf vs. Log del peso molecular de los marcadores de
peso molecular

135
Discusión

136
Conclusiones

Referencias:

137
1. Describir el fundamento de la técnica de Western Blot

2. ¿Cuáles son las enzimas y cromógenos más utilizados en el

Western Blot?

3. Mencionar los principales usos de la técnica de Western Blot

138
 4. Mencionar 5 enfermedades que se confirmen y
diagnostiquen por dicha técnica

5. ¿Cuáles son las sustancias que se utilizan para bloquear la

membrana de nitrocelulosa y por qué?

Referencias

139
Objetivos:
Transferir las proteínas separadas electroforéticamente, en la práctica
anterior, de un gel de poliacrilamida hacia una membrana o papel con el
objetivo de identificar dichas proteínas..

Comprobar la transferencia de proteínas en el papel mediante la tinción

con los colorantes: Rojo de Ponceau, Negro de Amido y Tinta China,
comparando la eficiencia de los mismos.

Introducción:
El término “blotting” se refiere a la transferencia de muestras biológicas de un gel
a una membrana y su subsecuente detección en la superficie de la membrana.
El Western blotting (también llamado inmunoblotting o
inmunoelectrotranserencia) surgió a partir de una técnica similar para detectar
secuencias de DNA que se denomina Southern blotting (Ed Southern). La
transferencia Western introducida en 1979 por Towbin y colaboradores, es hoy
en día, una técnica de rutina en el análisis de proteínas que tiene muchas
aplicaciones, tanto en investigación como en diagnóstico clínico.

Al igual que la inmunoprecipitación la inmunotransferencia se utiliza para identificar

la presencia de una proteína determinada en un lisado celular o muestra
biológica, sin necesidad de marcar grandes cantidades de células con isotopos
radiactivos. La separación de proteínas se realiza mediante una electroforesis con
SDS (SDS-PAGE), sin embargo mientras las proteínas están aún en la matriz del
gel no pueden ser alcanzadas por las grandes moléculas de los anticuerpos, por
lo que se extraen del gel y se colocan en una fina membrana de nitrocelulosa
(NC) o polivinildifluoruro (PVDF).

Para llevar a cabo la transferencia de las proteínas se coloca el gel de SDS sobre
la membrana y se aplica verticalmente con respecto al nivel del gel una corriente
eléctrica, mientras se sumergen en una solución conductora. Las micelas SDS-
proteínas se transfieren electroforéticamente hacia el ánodo desde el gel hacia la

140
matriz, y se produce una impresión (en inglés blot) de la muestra de la proteína
en la membrana. Ésta une las proteínas transferidas con fuerza. Los puntos de
unión restantes de la matriz se saturan con proteínas inertes (por ejemplo
leche en polvo).

Figura 1. Cartucho para Electrotransferencia

La eficiencia de la transferencia puede variar entre las proteínas, basándose
en la capacidad de las proteínas de migrar hacia afuera del gel y de que tan
propensas son a la unión con la membrana bajo condiciones particulares. La
eficiencia depende de factores como la composición del gel, el contacto del gel
con la membrana, la posición de los electrodos, el tiempo de transferencia, tamaño
y composición de las proteínas, del campo de fuerza y la presencia de
detergentes y alcohol en la solución reguladora. La transferencia óptima se
obtiene generalmente usando soluciones reguladoras con fuerza iónica y corriente
eléctrica bajas.

Después de la transferencia y antes de llevar acabo la detección, las proteínas

presentes en la membrana se tiñen con un colorante para comprobar la
transferencia, además también se puede teñir el gel para confirmar la ausencia de
proteínas. Como los colorantes pueden interferir con la unión de los anticuerpos,
estos deben ser removidos fácilmente tras los lavados. Los colorantes más usados
en la práctica son el Rojo de Ponceau (permanente) y el Negro de Amido
(temporal).

141
La detección de la proteína de interés se realiza mediante la adición de un
anticuerpo específico para dicha proteína (Anticuerpo primario), en general el
Anticuerpo primario no se detecta directamente, es necesario agregar un
anticuerpo secundario conjugado con una enzima o fluorocromo para detectarlo
(detección indirecta).

Figura 2. Detección Indirecta de Proteína

Material Reactivos
Cámara de Transferencia Solución reguladora
Fuente de Poder Solución Bloqueadora
Cartucho para transferencia Rojo de Ponceau
Nitrocelulosa Negro de Amido
Tinta China
Conjugado
Sustrato-Cromógeno
Solución de paro; ácido acético 2N
Solución lavado; PBS pH 7.2 con
Tween-20 al 0.05%.

142
Diagrama de flujo 14

R1- Tiras de nitrocelulosa; Desechar en basura municipal, si proviene de

diagnóstico desechar en bolsa roja

143
Metodología
1. Electroforesis
Utilizar el gel obtenido en la práctica anterior.

2. Colocación de gel
Abrir el cartucho de la cámara de electrotransferencia, en el lado izquierdo colocar
el gel sobre la esponja y en el derecho colocar el papel de nitrocelulosa. Cerrar el
cartucho.

3. Armado de cámara de electrotransferencia

Colocar el cartucho dentro de la cámara cuidando que el gel este orientado del
lado de cátodo (-) y el papel del ánodo (+).
Vertir la solución amortiguadora (Buffer) de transferencia en la cámara hasta un
85% de su capacidad.

4. Transferencia
Cerrar la cámara y encender la fuente de poder a 125 mA durante 1 hora,
utilizando un sistema de refrigeración por agua o en su defecto colocar dentro de
un refrigerador a 4ºC, para evitar el sobrecalentamiento.

5. Tinción
Cortar 4 tiras del papel de nitrocelulosa (reservar 1 para paso 7) y sumergir en
los diferentes colorantes por 5 min. Decolorar con agua destilada, hasta observar
la aparición de las bandas.

6. Lectura de resultados
Observar las bandas formadas en el papel de nitrocelulosa y comparar las
diferentes tinciones.

7. Inmunodetección
Utilizar la tira de nitrocelulosa previamente cortada e incubar con1.5 mL del
conjugado diluido 1/500 en solución bloqueadora, por 20 min. a temperatura
ambiente, decantando el sobrenadante.
Lavar 5 veces con la solución de lavado y posteriormente incubar las tiras de
papel, con 1.5 mL de la mezcla sustrato-cromógeno hasta la aparición de las
bandas. Por último, agregar 0.5 mL de la solución de paro y dejar secar.

144
Resultados

Tabla 1. Resultados obtenidos de la Electrotransferencia

Colorante Observaciones Imagen

Rojo de Ponceau

Negro de Amido

Tinta China

Inmunodetección

145
Discusión

146
Conclusiones

Referencias:

147
1. Describir el fundamento de la citometría de flujo

2. Mencionar las principales aplicaciones de la citometría de

flujo

3. ¿Qué parámetros pueden medirse con esta técnica?

148
 4. Mencionar 3 fluorocromos que se utilizan en el marcado de
anticuerpos

5. ¿Cuáles son las diferencias entre los citogramas dot-plot e

histogramas?

Referencias

149
Objetivos:
Conocer la estructura de un citómetro de flujo así como el fundamento de
la técnica mediante una clase teórica, con el fin de comprender la utilidad
de la misma.

Analizar citogramas con el propósito de aprender a interpretar los

resultados proporcionados por el citómetro de flujo.

Introducción:
La citometría de flujo constituye una técnica relativamente reciente de análisis
celular que en relación a otras metodologías ha tenido un carácter innovador.
Dicha técnica permite un análisis paramétrico de un gran número de células en
suspensión a medida que éstas pasan alineadas y una a una por delante de un
haz de luz, habitualmente un láser. Por un lado, el análisis, aunque realizado sobre
un gran número de células con la consecuente fiabilidad estadística, proporciona
información sobre cada célula en particular, además la citometría de flujo permite
la obtención no solo de una información cualitativa sino también cuantitativa sobre
los diferentes parámetros estudiados.

La utilización de fluorocromos se basa en la particularidad de ciertas

moléculas para emitir luz con menor longitud de onda. Estas propiedades se
encuentran en moléculas como la fluoresceína (FITC) o la ficoeritrina (PE) u otros
compuestos de nueva generación como pueden ser los Alexa-Fluor.

Cuando las células o partículas a analizar atraviesan el punto de detección, la luz

de laser es dispersada por la propia célula detectándose tanto la dispersión
frontal (“Forward Scatter” o FSC), que nos da una idea de volumen; como la
dispersión lateral (“Side Scatter” SSC), que nos informa de la complejidad. La
representación gráfica de estos dos parámetros permite diferenciar las
poblaciones a analizar y, en todo caso, permite descartar la información
procedente de restos celulares, agregados del medio extracelular o células

150
apoptóticas que pueden alterar el análisis. Si la intención es la de detectar
una determinada molécula en particular, sólo se necesita utilizar un anticuerpo
marcado con un fluorocromo. El citómetro detecta la emisión de luz del
fluorcromo, cuando este es activado por la luz del láser; esta señal de emisión es
filtrada, amplificada y detectada a diferentes longitudes de onda, y toda esta
información es procesada por un sistema informático.

Figura 1. Diagrama de la estructura de un Citómetro de Flujo

FACS
Los linfocitos en reposo presentan una apariencia uniforme, ya que todos
son células pequeñas y redondeadas, con un núcleo denso y escaso citoplasma.
Sin embargo, esta población celular contiene muchas subpoblaciones funcionales,
que normalmente se identifican y distinguen entre sí de acuerdo con la
expresión diferencial de proteínas de superficie celular, las cuales pueden
detectarse mediante anticuerpos específicos.

Un citómetro de flujo equipado para separar las poblaciones identificadas se

denomina separador celular activado por fluoresencia o FACS (Fluorescence-
activated cell sorter). Estos instrumentos se utilizan para estudiar las propiedades
de las subpoblaciones celulares. En el separador de células, las señales recibidas
por el ordenador se emplean para generar una carga eléctrica que pasa desde
la célula de flujo hacia la corriente de líquido en el preciso momento en que dicha

151
corriente se fragmenta en pequeñas gotas, cada una de las cuales contiene
sólo una célula. Las gotitas con carga pueden desviarse de la corriente principal
en el momento en que pasan entre dos placas con carga opuesta, de
forma que las gotas con carga positiva se desvían a la placa con carga negativa
y viceversa. De esa manera es posible purificar, a partir de una población
heterogénea de células, subpoblaciones específicas

Citogramas
Cuando las células se marcan con un sólo anticuerpo fluorescente, los datos
en una citometría de flujo suelen representarse mediante un histograma de
intensidad de fluorescencia frente al número de células. Cuando se utilizan dos o
más anticuerpos, cada uno conjugado con diferentes fluorocromos, los datos
suelen representarse mediante un diagrama bidimensional de dispersión o un
diagrama de contornos, en el cual la fluorescencia de cada célula para el
anticuerpo marcado con el primer fluorocromo se confronta con el marcaje del
segundo: por tanto, una población de células marcadas con el primer fluorocromo
puede subdividirse en su función del marcaje con el segundo anticuerpo.

Figura 2. Representación gráfica de datos en Citometría de Flujo

(Citogramas)

152
Utilidad
Mediante la citometría de flujo se pueden realizar numerosos tipos de ensayo,
como la estimación del contenido en ácidos nucleicos, actividad enzimática, flujo
de calcio, potencial de membrana y pH, así como la detección de antígenos tanto
en la superficie como en el citoplasma y orgánulos de las células por medio de
anticuerpos marcados directa o indirectamente con fluorocromos.

Una vez examinado un amplio número de células, el citómetro puede

proporcionar información cuantitativa sobre el porcentaje de células que
poseen diferentes moléculas, como la inmunoglobulina de superficie que
caracteriza a las células B, las moléculas asociadas al receptor de células T
denominadas (CD3) y las proteínas correceptoras CD4 y CD8, que distinguen
las principales subpoblaciones de células T. De la misma manera, el análisis
mediante FACS ha sido crucial para definir estadios en el desarrollo temprano de
las células B y T.

Gracias al perfeccionamiento progresivo de la tecnología FACS, pueden emplearse

simultáneamente un número creciente de anticuerpos marcados con distintos
fluorocromos.

153
Discusión

154
Conclusiones

Referencias:

155
Si se cuenta con el material pertinente se podrá realizar durante la práctica 12 de
Electroforesis, la técnica de cromatografía de afinidad siguiendo la metodología
siguiente:

Material Reactivos
1 Jeringa de 5 mL Proteína A Staphylococcus
2 Tubos cónicos de 15 mL aureus(Sefarosa)
5 Tubos de vidrio de 13x100 PBS 1X
2 Pipetas de 10 mL Pipeta Pasteur Tris 1.0 M, 100mM, 10mM pH=8
Glicina 100mM pH=3

Diagrama de flujo 16

R1- Eluato: Depositar en contenedor con hipoclorito de odio al 6%

156
Metodología

1. Montaje de columna
Pesar 1.5 g de proteína A-sefarosa comercial e hidratar con 5 mL de PBS 1X.
Centrifugar a 90 g por 15 min. y desechar el sobrenadante con ayuda de una
pipeta Pasteur.
Repetir dos veces.
Resuspender la proteína A en 5 mL de PBS 1X y empaquetar la columna (jeringa)
evitando la formación de burbujas.
Por último colocar la columna en un soporte.

2. Preparación de muestra
Obtener suero humano y ajustar el pH por la adición 1/10 del volumen de Tris
1.0mM pH=8.

3. Paso de Muestra por Columna

Pasar la solución anterior por la columna de Proteína A.

4. Lavado de Columna
Lavar la columna con 19 veces el volumen de la columna con Tris 100
mM eliminando el eluyente. Volver a lavar la columna con 10 veces el volumen
con Tris 10mM eliminando el eluyente.

5. Elución de Anticuerpos
Eluir la columna con 3 mL de glicina 100 mM pH=3 adicionando lentamente.
Colectar el eluido en tubos de vidrio que contengan 50 µL de Tris 1M pH=8

6. Determinación de Proteínas
Diluir el suero y la proteína purificada 1/50 y 1/100 con PBS. Leer la densidad
óptica a 280 nm y determinar la concentración de proteína de la manera
siguiente:
1.35 Abs = 1mg/mL de proteína

157
Preparación de Soluciones para Cromatografía de Afinidad

Tris Base 1M PM 121.14

Pesar 12.114 g en 90 mL con agua bidestilada, ajusta pH a 8 con HCl 2 N

Tris 100 mM
Pesar 1.21 g en 90 mL con agua bidestilada, ajusta pH a 8 con HCl 2 N

Tris 10 mM
Pesar 0.121 g en 90 mL con agua bidestilada, ajusta pH a 8 con HCl 2 N

Glicina 100 mM PM 97.05

Pesar 0.9705 g para 100 mL, ajustar pH a 3 con HCl 2 N.

Preparación de soluciones para electroforesis

Tris/HCl 1.5M pH 8.8

Pesar 18.15 g de Tris
Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada
Añadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 8.8
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL)

Tris/HCl 1 M pH 6.8
Pesar 12.1 g de Tris
Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada
Añadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 6.8
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL)

SDS 10% (p/v)

Pesar 10 g de SDS
Añadir agua destilada hasta completar el volumen de 100 mL

Glicerol 50% (v/v)

Tomar un volumen de 50 mL de glicerol al 100%
Añadir 50 mL de agua destilada
158
Azul de Bromofenol 1% (p/v)
Pesar 100 mg de azul de bromofenol
Completar con agua destilada hasta 10 mL y mezclar hasta disolver
Filtrar la solución en papel Whatman No 1 para eliminar el colorante no disuelto

Acrilamida 30%
La solución de acrilamida al 30% (p/v) es una mezcla de acrilamida
(29.2g) y bisacrilamida (0.8g).
Pesar ambos reactivos y añadir agua destilada hasta 100 mL Filtrar en papel de
filtro Whatman No1

Persulfato de amonio al 10% (p/v)

Pesar 0.5 g de sulfato de amonio
Disolver en 5 mL de agua destilada

Solución Amortiguadora de Corrimiento

Pesar 3 g de Tris (25 mM)
Pesar 14.4g de glicina (192 mM) Pesar 1g de SDS (0.1%)
Añadir agua destilada hasta completar 1 L

NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8.3. Se puede preparar una

solución 10 veces más concentrada y diluir el volumen necesario en el momento
del corrimiento. Esta solución puede almacenarse indefinidamente a Temperatura
ambiente.

Solución Reguladora de muestra 2X

0.24 mL de Tris/HCl 1M pH 6.8
2 mL de Glicerol 50%
0.8 mL de SDS 10%
0.5 mL de 2-mercaptoetanol* Opcional
0.5 mL de azul de bromofenol
0.96 mL de agua destilada

159
 CANTIDADES PARA LA PREPARACIÓN DE GELES POLIACRILAMIDA
Gel Separador Cantidad en mL a preparar
6% 5 mL 10mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL
H2O 2.7 5.3 8.0 10.6 13.3 15.9 21.1 26.5
30% Acrilamida Mix 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04
8% 5 mL 10mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL
H2O 2.3 4.6 7.0 9.3 11.6 13.9 18.6 23.2
30% Acrilamida Mix 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.4
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03
10% 5 mL 10mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL
H2O 2.0 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.8 20.0
30% Acrilamida Mix 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.6
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
12% 5 mL 10mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL
H2O 1.7 3.3 5.0 6.6 8.3 9.9 13.2 16.4
30% Acrilamida Mix 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 20.0
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
15% 5 mL 10mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL
H2O 1.2 2.3 3.5 4.6 5.7 6.9 9.2 11.4
30% Acrilamida Mix 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.0
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

160
 Gel
1mL 2mL 3mL 4mL 5mL 6mL 8mL 10mL
Concentrador
H2O 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8
30% Acrilamida Mix 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7
1.0 M Tris (pH 6.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25
10% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
10% APS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01

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