Laboratorio 7: #DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DELA AMILASA
SALIVAL
Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de las
reacciones metabólicas que ocurren tanto a nivel celular como fuera de ellas, sin sufrir
ellas cambios en su estructura y/o función. La acción de las enzimas, por sus
características físico-químicas, puede verse afectada por las condiciones presentes en
el lugar de acción de éstas. Entre los principales factores que pueden modificar la
acción enzimática tenemos:
a) La temperatura: Todas las enzimas muestran cierta termolabilidad, aunque para
muchas de ellas el aumento de la temperatura, hasta cierto límite, acelera la
velocidad de la reacción. Sin embargo, dado que son estructuras proteicas, pueden
ser desnaturalizadas a medida que se aumenta la temperatura y perder su actividad
biológica. La temperatura a la cual se observa la máxima actividad enzimática se
denomina Temperatura Óptima.
b) El pH: Por su característica proteica, muchas enzimas por el pH de donde se
encuentran pueden cambiar desde un estado ionizado a uno no ionizado, afectando
así la actividad biológica de las mismas. Cada enzima posee un pH característico
donde puede realizar su función (pH óptimo) y cualquier variación del mismo puede
afectar la velocidad de la reacción química catalizada.
c) Inductores e inhibidores: Existen sustancias químicas que pueden afectar la
interacción del sustrato y la enzima, ya sea aumentando la actividad enzimática
(Inductores) o disminuyéndola (Inhibidores). Los inhibidores tienen gran utilidad en
bioquímica, ya que ayudan a determinar la especificidad de la enzima por el
sustrato, la naturaleza de los grupos funcionales en el mantenimiento de la estructura
activa de la enzima. Estos compuestos no son alterados químicamente por la
enzima.
Otros factores que pueden afectar la acción enzimática son: Cantidad de
sustrato, hidratación de la enzima, regulación alostérica, regulación por producto, etc.
La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y
que degrada el almidón. El almidón, principal polisacárido de reserva de las plantas,
está compuesto por dos tipos diferentes de moléculas: amilosa y amilopectina. Ambas
tienen como monómero la glucosa (Glu). La amilosa está formada por largas cadenas
de glucosa, donde el C1 de una glucosa está unido al C4 de la siguiente. Son cadenas
lineales y se arrollan en forma helicoidal. La amilopectina está formada por cadenas de
glucosa unidas en C1 con C4 (como la amilosa) pero con múltiples ramificaciones
(uniones C1 con C6). La α-amilasa rompe uniones entre C1 y C4 de dos glucosas. Por
lo tanto, usando almidón como sustrato, libera como productos dextrinas lineales y
ramificadas. Las dextrinas son oligosacáridos compuestos, en este caso, por unas
pocas unidades de glucosa.
La actividad de las enzimas puede evidenciarse ya sea detectando la aparición
de producto o bien la desaparición del sustrato. Para esto pueden usarse test
colorimétricos, absorbancia de la luz de determinada longitud de onda, sustratos
marcados radiactivamente, etc., según convenga en cada caso. En este práctico, para
medir la actividad de la α-amilasa, vamos a usar un conocido test colorimétrico que
permite revelar la presencia de almidón en una solución. Por lo tanto, vamos a seguir
la reacción detectando la desaparición del sustrato (evidenciada por el test
colorimétrico)
para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan las
distintas condiciones en que actúa la enzima (pH, temperatura, concentración de NaCl).
Para esta experiencia se contará con una solución de iodo/ ioduro de potasio (I2/KI)
denominada lugol o solución de Lugol. El almidón en presencia de esta solución
adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: el
iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones
hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la a-amilasa actúa, degrada
la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I2/KI ya no dará una
coloración azul.
Materiales: Soluciones y reactivos:
- 1 Gradilla. -Solución de almidón al 2%
- 10 tubos de ensayo. -Lugol
- 2 Micropipetas (200 y 1000 µl) -Solución salina fisiológica (0,9%).
- 3 vasos de precipitado ( 50 o 100ml) -Agua destilada.
- Baño de Hielo (0°C). -Saliva humana.
- Baño termoregulado (90°C).
- Estufa a 37°C
- Cubetas para espectrofotometría
- Espectrofotómetro
Metodología:
1. Un voluntario de cada grupo debe juntar aproximadamente 5 ml de saliva en un vaso
de precipitado pequeño y diluirla con solución salina fisiológica hasta obtener 15 ml
de “solución enzimática”.
2. Con los datos de la tabla siguiente, realizar la dilución del sustrato, realizar las
lecturas de absorbancia y construir la curva de calibración para el complejo yodo-
almidón.
Tubo Almidón 2% [µl] Concentración Absorbancia 590 nm
1 0
2 250
3 500
4 1.00
0
5 1.50
0
NOTA: A cada tubo se le debe de agregar 500 µl de lugol y completar hasta 5 ml
con agua destilada.
Experimento 1: Determinación de la Actividad Enzimática
1) Tome 2 tubos de ensayo con 1 ml de solución neutra de almidón 2 % (p/v).
Coloque el tubo en un baño térmico a 37°C durante por lo menos 2 min.
2) Manteniendo los tubos con el almidón (sustrato) a 37°C agregarle 1 ml de la
saliva diluida (enzima) al primer tubo y 1 ml de suero fisiológico al segundo
tubo; mezclar suavemente.
3) Incubar por 10 min a 37°C.
4) Añadir 500 µl de lugol y completar volumen a 5 ml con agua destilada.
5) Realizar la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro a 590 nm.
6) Determinar la concentración de almidón en cada tubo.
Experimento 2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
1) Tome 4 tubos de ensayos. Añada a cada uno 1 ml de solución saliva diluida.
2) Incube por 5 minutos cada tubo a la temperatura correspondiente:
Tubo 1: 0° grados.
Tubo 2: Temperatura
ambiente
Tubo 3: 37° grados.
Tubo 4: 90° grados.
3) Agregue a cada tubo 1 ml de solución de almidón 2%, mezclar suavemente.
4) Incubar por 10 min a la temperatura correspondiente.
5) Añadir 500 µl de lugol y completar volumen a 5 ml con agua destilada.
6) Realizar la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro a 590 nm.
7) Determinar la concentración de almidón en cada tubo.
.
Con los datos colectados construir curva de calibración y utilizando esta calcular
concentraciones de cada ensayo de modo de poder evaluar y comentar la influencia
que ejerce el cambio de temperatura en el ensayo.
Preguntas
1.- ¿Es la amilasa una enzima del tipo Hidrolasa?.
2.- ¿Es la amilasa una enzima proteica simple o compleja?.
3.- Se afirma en internet que “La enzima humana de las amilasas alfas es una
metaloenzima de calcio, totalmente incapaz de funcionar en ausencia de calcio”
¿Es correcta esta afirmación?.
¿Cómo podría verificarlo?.
4.- A un Tecnólogo médico le piden detectar y medir niveles de amilasa en el
plasma. Busque información respecto de que diagnóstico de enfermedades puede
apoyar este test.
