CLASE N°3: TÉCNICAS ASOCIADAS A ANTICUERPOS (RIA, ELISA Y WESTERN BLOT)

Fecha: 03/04/2023

ANTICUERPOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS

Antes de comenzar con las técnicas asociadas a anticuerpos, ahondemos un poco más en conceptos importantes, como lo es
la diferenciación de los anticuerpos primarios y secundarios.

1) Anticuerpos Primarios:
 Es un anticuerpo que se une directamente al antígeno (proteína específica) que se desea detectar en la
muestra biológica.
 El anticuerpo primario se produce a partir de un animal inmunizado con el antígeno o mediante técnicas
de ingeniería molecular, es decir, son moléculas generadas por un “hospedero” en respuesta a la
administración de un antígeno mediante la inyección de este por diversas vías.
 Se une específicamente al antígeno y se utiliza para detectar su presencia en la muestra biológica mediante
la formación de un complejo anticuerpo-antígeno.

2) Anticuerpo Secundario:
 Es un anticuerpo que se une al anticuerpo primario para amplificar la señal de detección.
 El anticuerpo secundario se produce a partir de un animal inmunizado con el tipo de anticuerpo primario
que se utiliza en la detección.
 El anticuerpo secundario se une al anticuerpo primario mediante una región constante y reconocible de
la molécula de anticuerpo, que se llama región Fc. El anticuerpo secundario amplifica la señal de detección
porque cada anticuerpo secundario puede unirse a muchos anticuerpos primarios, lo que aumenta la
cantidad de complejos anticuerpo-antígeno en la muestra biológica.
 En general este tipo de anticuerpos se conjugan a un marcador y eso permite la detección por alguna
reacción colorimétrica, fluorimétrica, quimioluminiscente, etc.

Importante: La diferencia a la hora de utilizar en laboratorio estos anticuerpos, es que los primarios son anti-antígeno, mientras que los
secundarios son anti-especie (no reconocen epítopos del antígeno, sino que la procedencia del anticuerpo primario)
CONCEPTOS IMPORTANTES:

 Reactividad: Hablamos de la especie del antígeno, es decir “es reactiva contra…”.

 Tipo de Reacción: Es la unión entre moléculas, como por ejemplo una unión entre antígeno y anticuerpo, la cual es
de carácter no covalente (enlaces que son débiles en específico pero son lo suficientemente fuertes como para
hacer una unión) el cual es menos fuerte que uno covalente, pues este último son fuerzas electroestáticas.

 Especificidad: Las inmunoglobulinas están diseñadas específicamente para ir contra un antígeno, reconociendo un
epítopo de esa molécula extraña. Es decir, no son universales.

 Capacidad de amplificar la señal: Los anticuerpos primarios que están asociados a un cromóforo no van a amplificar
la señal como lo hace un anticuerpo secundario.

 Huésped: Animal en el cual se sintetizarán los anticuerpos, tanto primarios como secundarios

 Cromógenos: Sustancias que, cuando se exponen a ciertas condiciones, producen un cambio de color observable
a simple vista. Por ejemplo, se utilizan cromógenos para revelar la presencia de un anticuerpo específico unido a
un antígeno en una muestra de tejido. El cromógeno se une al complejo anticuerpo-antígeno, lo que resulta en un
cambio de color que se puede detectar bajo un microscopio.

Algunos ejemplos de como se utilizan estos conceptos serían:

1) Anti-distrofina humana de conejo  El huésped sería un conejo, mientras que el antígeno o reactividad es la
distrofina humana.
2) Anticuerpo secundario de cabra anti-conejo marcado con alexo 488  El huésped sería la cabra, mientras que el
antígeno o reactivad sería el Fc (receptor de la región constante) del antígeno primario sintetizado por el conejo.

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES

Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos Policlonales

 Anticuerpo derivado de un clon que detecta solo  Mezcla de anticuerpos que detectan diferentes
un epítopo del antígeno. epítopos de un antígeno.
 Producidos usando hibridomas.  Derivan de Suero.
 Costosos de producir en laboratorio.  Baratos de producir en laboratorio.
Los anticuerpos conjugados son moléculas compuestas por un anticuerpo unido covalentemente a otra molécula, como
un fluoróforo, una enzima o un agente citotóxico. Estos conjugados se utilizan en una variedad de técnicas de laboratorio
para detectar, cuantificar o eliminar sustancias específicas. Algunos ejemplos de anticuerpos conjugados son:

 Marcaje fluorescente
 Marcaje enzimático
 Biotina
 Partículas magnéticas, agarosa
 Oro coloidal

TÉCNICAS ASOCIADAS A ANTICUERPOS

Las técnicas asociadas a anticuerpos son una variedad de técnicas

de laboratorio que utilizan anticuerpos para detectar, cuantificar
o purificar sustancias específicas. Algunas de las técnicas más
comunes son:

1) Radioinmunoensayo (RIA)  Técnica de laboratorio que

utiliza anticuerpos y radioisótopos para detectar y
cuantificar la cantidad de antígenos específicos en una
muestra. El anticuerpo es etiquetado con un
radioisótopo y mezclado con la muestra que contiene el
antígeno de interés. Los complejos formados entre el
anticuerpo y el antígeno son separados y la cantidad de
radioisótopo presente es medida, lo que permite la
cuantificación de la cantidad de antígeno en la muestra.

2) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  Utiliza anticuerpos para detectar la presencia y la cantidad de
antígenos específicos en una muestra. Los anticuerpos se unen al antígeno de interés, y se revelan utilizando una
enzima ligada al anticuerpo que convierte un sustrato incoloro en un producto coloreado.

3) Western Blot  Utiliza anticuerpos para detectar proteínas específicas en una muestra. Las proteínas se separan
mediante electroforesis y se transfieren a una membrana, donde se incuban con anticuerpos específicos para la
proteína de interés. Los anticuerpos se revelan utilizando un sustrato que produce un cambio de color observable
a simple vista.

4) Inmunohistoquímica  Esta técnica utiliza anticuerpos para detectar antígenos específicos en tejidos. Los
anticuerpos se unen a los antígenos de interés y se revelan utilizando un cromógeno que produce un cambio de
color observable a simple vista.

5) Citometría de flujo  Técnica de laboratorio que se utiliza para analizar y separar células individuales en una
muestra en función de sus características físicas y químicas. La muestra se hace pasar a través de un instrumento
llamado citómetro de flujo, que la hace fluir en una corriente líquida a través de un láser. El láser ilumina las células
individuales y detecta la luz que se dispersa por las células. Esta información se utiliza para determinar el tamaño,
la forma y otras características de las células.
Estas son solo algunas de las técnicas más comunes asociadas a anticuerpos, y hay muchas otras técnicas que utilizan
anticuerpos para diversos fines, como la purificación de proteínas, la detección de anticuerpos específicos en sueros, entre
otras.

0) INMUNOENSAYOS (Introducción a las técnicas)

Un inmunoensayo es una técnica de laboratorio que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar la presencia de
moléculas específicas, como proteínas o antígenos, en una muestra biológica. Esta técnica se basa en la capacidad
de los anticuerpos para unirse de forma específica a las moléculas objetivo y, por lo tanto, detectar su presencia
en la muestra.

Hay varios tipos de inmunoensayos, incluyendo ensayos enzimáticos (ELISA), inmunocromatografía y ensayos de
aglutinación, entre otros. Estas técnicas se utilizan ampliamente en la investigación biomédica y el diagnóstico
clínico para detectar y cuantificar una amplia gama de moléculas en diferentes tipos de muestras biológicas.

Debido a que existen varios tipos de inmunoensayos, es el tipo de método de detección el que va a determinar el
nombre que tendrá ese ensayo, por eso se habla de, por ejemplo, un inmunoensayo quimioluminiscente significa
que utiliza una señal lumínica, en cambio, si es un ensayo enzimático, es que utiliza enzimas para la detección, y
así con los demás.
TIPOS DE INMUNOENSAYOS Y SUS MÉTODOS DE DETECCIÓN

1) RADIOINMUNOENSAYOS (RIA)
Un radioinmunoensayo (RIA) es una técnica de laboratorio que utiliza
isotopos radiactivos para detectar y medir cantidades extremadamente
pequeñas de una sustancia, como una hormona o un anticuerpo, en una
muestra biológica. Fue desarrollado por dos endocrinólogos Rosalyn Yalow y
Salomon Berson para cuantificar los niveles de insulina en diabéticos.

En esta técnica, se utiliza un anticuerpo que se une específicamente a la

sustancia de interés y se le agrega una pequeña cantidad de la sustancia
radiomarcada. Se mide la cantidad de radioactividad presente en la muestra,
lo que indica la cantidad de sustancia presente. Su límite de detección es de
0.001 µg mL-1.
El RIA es una técnica muy sensible y precisa que se utiliza en la investigación y el diagnóstico médico para medir
hormonas, drogas, anticuerpos y otras sustancias en la sangre u otros fluidos corporales. Sin embargo, su uso se
ha reducido debido a la preocupación por los riesgos de seguridad y los desechos radiactivos.

Algunas especificaciones del RIA son:

 El antígeno marcado utiliza un isótopo que emite radiación gamma, como el I125, pero también se
pueden utilizar isótopos con radiación beta como el tritio (H3).
 Es un análisis robusto y barato.
 La muestra a ensayar puede ser una mezcla compleja como suero, sangre, orina, médula ósea, saliva, etc.

¿Cuáles son los fundamentos del RIA?

El RIA se basa en la competencia entre dos antígenos, uno marcado

con una sonda radiactiva y otro sin marca (muestra) por la unión a
un anticuerpo monoclonal de alta especificidad.

Primero se satura el anticuerpo con el antígeno marcado, luego se

agregan cantidades crecientes del antígeno sin marcar para
desplazar al primero. La variación de la señal radiactiva es
proporcional a la concentración del antígeno en la muestra.

Se dice que el RIA está en fase sólida porque el anticuerpo o el

antígeno marcado se adhirió a una superficie sólida. Tenemos una
placa adherida con el anticuerpo marcado, y primero se administró
el antígeno marcado hacia anticuerpos que están enlazados, por lo
tanto, ahora queda el anticuerpo unido al yodo.

En esa misma situación se mide cuánto hay libre, porque todo lo otro quedó marcado. Esta muestra desplaza lo
que ya estuvo enlazado, por lo que la cantidad que desplaza va a ser igual a la concentración que tiene la muestra,
y por eso es que se dice que es un ensayo competitivo. Hay una parte en la curva que la concentración es lineal,
por lo tanto ahí puedo medir cuánto había en tiempo cero.
 Algunas aplicaciones del RIA en la medicina son:

 Detección de drogas (Ej: anfetamina)

 Detección vitaminas (Ej: ácido fólico).
 Detección de hormonas (tiroídeas, hormonas tróficas).
 Screening banco de sangre (Hepatitis B).

2) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA, siglas en inglés para Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, es una técnica de laboratorio
ampliamente utilizada para detectar la presencia y cantidad de proteínas específicas en una muestra.

En esta técnica, se utiliza una placa con pocillos que se recubre con una proteína de interés y se incuba con una
muestra biológica que puede contener esa proteína. Luego, se añade un anticuerpo específico que se une a la
proteína objetivo y se detecta mediante la adición de una enzima que produce un cambio de color en presencia
de un sustrato específico.

La ELISA puede utilizarse en diversas aplicaciones, como en diagnósticos médicos, control de calidad de alimentos,
detección de contaminantes ambientales, entre otros.

 El ensayo de inmunosorbente ligado a enzima es similar al

RIA pero en lugar de usar un isótopo radiactivo se utiliza una
enzima y un sustrato cromogénico. Su límite de detección es
casi tan bueno como el del RIA.

 Se utiliza una enzima capaz de catalizar la reacción que

convierte un sustrato incoloro en un producto coloreado
(sustrato cromogénico).

 Este ensayo utiliza una placa de pocillos de tamaños específicos y pequeñitos, en donde en el fondo del
pocillo está una película ya sea de antígeno o anticuerpo, por lo que es una reacción inmunológica, que
tiene una enzima que permite la detección de un sustrato y producir un color.

 Se utiliza una placa de ELISA que tiene 96 pocillos que se mete en un lector de placas, uno mide la
generación del color por la reacción enzimática, en general ELISA utiliza como enzima la fosfatasa alcalina,
la peroxidasa rabanito o la b-galactosidasa, y otras más, las cuales unen covalentemente al anticuerpo.
Es un método sencillo muy utilizado hoy en día.

 Al ser una reacción inmunológica podemos tener anticuerpos que se van a unir al antígeno directamente,
o que van a reconocer el antígeno de manera indirecta.

 Ensayo cualitativo (detección de presencia o ausencia) o cuantitativo.

Existen tipos de ELISA según su técnica, y estas son conocidas como ELISA indirecto, sándwich y competitivo. Estas
son diferentes en la forma en que se utilizan los anticuerpos para detectar la proteína de interés. A continuación,
se detalla la diferencia entre ellas:

 ELISA indirecto: En esta técnica, la proteína de interés se une a una placa y luego se incuba con un
anticuerpo primario que se une específicamente a la proteína. Después se añade un anticuerpo
secundario que se une al anticuerpo primario y que está conjugado con una enzima. La enzima produce
un cambio de color en presencia de un sustrato cromogénico específico, lo que indica la presencia de la
proteína de interés, pues es revelado.

 ELISA sándwich: En esta técnica, se utilizan dos anticuerpos diferentes para la detección de la proteína
de interés. Un anticuerpo se une a la placa (inmovilizado) y el otro se utiliza como anticuerpo de detección
que se une a la proteína una vez haya sido añadido el antígeno. El anticuerpo de detección está conjugado
con una enzima y produce un cambio de color en presencia de un sustrato cromogénico específico. Esta
técnica es útil para proteínas que no tienen sitios de unión de anticuerpos expuestos.
  ELISA competitivo: En esta técnica, se incuba la muestra con una proteína marcada y un anticuerpo
específico no conjugado en la placa. Si la proteína de interés está presente en la muestra, se unirá al
anticuerpo específico, lo que significa que la proteína marcada no podrá unirse al anticuerpo y, por lo
tanto, no habrá cambio de color. Si la proteína de interés no está presente, la proteína marcada se unirá
al anticuerpo y producirá un cambio de color.

En resumen, la técnica de ELISA indirecto utiliza un solo anticuerpo, mientras que la técnica de ELISA sándwich
utiliza dos anticuerpos diferentes y la técnica de ELISA competitivo utiliza una proteína marcada y un anticuerpo
específico no conjugado para detectar la presencia de la proteína de interés.

Algunas de las aplicaciones de ELISA en el diagnóstico médico son: detección de anticuerpos contra agentes
infecciosos (bacterias, virus, parásitos), detección de hormonas (HCG), detección de agentes infecciosos,
detección de autoanticuerpos, entre otros.

3) WESTERN BLOT
El Western Blot es una técnica de laboratorio utilizada para detectar y cuantificar proteínas específicas en una
muestra biológica, como una muestra de tejido o una solución de proteína purificada. La técnica se basa en un
método muy común para la separación de las proteínas por tamaño mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), y su posterior transferencia a una membrana de
nitrocelulosa o PVDF. Tiene como finalidades:
 Estimación del peso molecular de las proteínas
 Determinación de la abundancia relativa de las principales proteínas de la muestra
 Evaluar la pureza de una muestra proteica
 Evaluar el progreso de un proceso de fraccionamiento o purificación

Lo que se conocemos como Western Blot, es un sistema de separación de proteínas, y además, a través de la
aplicación de una carga eléctrica, se puede hacer que estas proteínas migren por un gel y se puedan ir separando
por tamaño, es decir, generamos un gel que tiene distintos poros y a través de ellos, van a ir quedando retenidas
las proteínas de mayor peso molecular, después las de tamaño intermedio, y finalmente las más pequeñas,
quedando estas al fondo (todo esto va a depender del tamaño del poro del polímero)

En el proceso se usan distintos tipos de polímero, los geles de acrilamida o poliacrilamida son los más usados, y
estos separarán proteínas por tamaño; es importante saber que la separación de la proteína va a depender de
cómo se haga el gel de separación, ya que las proteínas van a migrar desde una región positiva a una negativa, por
lo que al hacer esto se pueden ordenar por tamaño, para que esto suceda hay que ser metodológico para que
todas las proteínas sean iguales en carga (se sabe que estas tienen cargas distintas)

Generalmente, se utiliza un sistema discontinuo de geles como medio de soporte, lo que permite una mejor
resolución de las proteínas deseadas. Dicho sistema consta de un gel separador y otro que se encuentra encima
de este, conocido como gel concentrador, el cual posee los pocillos para la carga de la muestra. En este sistema,
los geles son generados a partir de 2 buffer de pH diferentes: pH 6,8 para el concentrador y 8,8 para el separador.

Además, a diferencia de una electroforesis nativa, en este sistema se una un detergente aniónico llamado dodecil
sulfato sódico (SDS) que desnaturaliza proteínas y les imprime una densidad de carga (carga/masa) negativa y
uniforme entre todas ellas. El poro presente en el gel dependerá del % de acrilamida y del % del cruzador, la
bisacrilamida. Este detergente le entrega una gran cantidad de cargas negativas a las proteínas y por lo tanto las
hace independientes al quedar todas cargadas negativamente, así ahora lo único que importa es el peso de ellas.

Entonces: Se extraen proteínas (ya sea del suero sanguíneo, del líquido
cefalorraquídeo, entre otras) y se homogeniza, es decir que se disolverá en esta
solución de geles con detergente para luego separarlo por tamaño. Una vez
terminado ese proceso, hay que fijar las proteínas a una membrana y teñirlas
para poder observarlas, ya que el gel es básicamente transparente, y para esto
se usan químicos como el “Azul de Coomassie” o el nitrato de plata, que
interaccionan principalmente con aminoácidos básicos (como la histidina, la
arginina, la lisina) y nos posibilita verlos. Si se desea separar a las proteínas por
carga, no se debe añadir el detergente.

En la imagen se ven
distintos tipos de muestras
y sus pesos moleculares,
pues quedan todas las
proteínas clasificadas por
tamaño y se puede
cuantificar y evaluar la
cantidad que hay, pues si
hay más color quiere decir
que hay más cantidad de la
proteína.
Cuando ya están separadas por tamaño, se transfieren para poder
mantenerlas y para poder evaluar en ellas los distintos anticuerpos.
Entonces, se tiene el gel, la membrana, papel filtro, y de nuevo una
carga eléctrica, la cual va a determinar que la corriente eléctrica va
a llevar a las proteínas desde el gel a la membrana.

En la imagen adjunta vemos el detalle de los procesos, en A

tenemos la extracción, en B vemos donde cargan o llenan el
sistema de carriles o pocillos con la muestra, En C se separan las
proteínas, en D se transfieren a una membrana, en E esta
membrana se incuba con anticuerpos, y si ese anticuerpo tiene un
sistema de detección, podemos detectar color. Todas las proteínas
se transfieren, pero no todas esas proteínas o bandas de proteínas
van a reaccionar con el anticuerpo.

La aplicación del Western Blot

en el diagnóstico es
principalmente la
confirmación diagnóstica de
enfermedades virales por
detección de anticuerpos en
el suero sanguíneo, como el
VIH, la hepatitis B, los herpes,
etcétera.