PRACTICA N˚10
METABOLISMO DE LOS AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Determinar actividad enzimática de la TGPen suero sanguíneo.
INTRODUCCIÓN
La transaminación es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo amino
desde un aminoácido hasta un cetoácido, dando como resultado conversión del primero en
un cetoácido y el segundo en un nuevo aminoácido. Esta reacción es de gran importancia en
el metabolismo de los aminoácidos y es catalizada por enzimas llamadas
TRANSAMINASAS o Aminotransferasas, presentes en la mayoría de tejidos animales. El
cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfa-
cetoglutarato es el aceptor del grupo amino, formándose por tanto ácido glutámico.
NH3 H O
R-CH-COO- C=O OOC- CH2-CH2- C-COO-
Enzima
O H NH3
R-C-COO-H-C-NH3 OOC-CH2-CH2-CH-COO-
Enzima
L-aminoácido + alfa-cetoglutarato alfa-cetoácido + L-glutámico
El interés clínico está centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfa-
cetoglutarato aminotransferasa (ALT o Transaminasa glutámico PirúvicaTGP) y L-
aspartato: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (AST o Transaminasa Glutámico
OxalacéticaTGO). Estas enzimas tienen una acción eminentemente intracelular, por lo que
la actividad sérica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad será
evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran de los cuales resultan
particularmente importantes corazón e hígado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado
aumento de la actividad de TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta
enzima tan abundante en el miocardio. En este caso no existirá aumento en la actividad
sérica de TGP o será mínimo.
En hepatitis vírales u otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de
tejido, habrá también un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas,
incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como la ictericia. En este caso TGP será
la enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático. Una elevada
actividad de transaminasas puede detectarse también en otras condiciones como: traumas
accidentales o quirúrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc.
EXPERIMENTO 1
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ALANINA AMINOTRANSFERASA
(TGP)
Objetivos
Estudio de la transaminación en suero sanguíneo.
Aplicación del método enzimático espectrofotométrico para la determinación de la
actividad de la TGPsérica.
Método
La determinación de TGP se realiza acoplando su acción transaminasa a la acción de la
enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en presencia de NADH.
Procedimiento:
1. PREPARACIÓN del Reactivo de trabajo (RT):
a) Mezclar: 0.2 ml. de (R2) Substrato + 0.8 ml. (R1) Tampón.
b) Pipetear en un tubo, mezclar, incubar 1 minuto.
Evaluaremos 2 muestras de suero sanguíneo:
Sistemas
Reactivos
1 2
RT (mL) 1,0 1,0
1 Muestra (μL) 100 ---
2 Muestra (μL) ---- 100
2. Condiciones del ensayo:
a) Longitud de onda: . . . . . . . . . .. 340 nm
Cubeta:. .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . 1 cm paso de luz
Temperatura constante . . . . . . ...37ºC
Colocar en una cubeta las soluciones preparadas y llevar al espectrofotómetro
Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la
absorbancia cada minuto durante 3 minutos.
Expresión de Resultados:
Absorbancias
1 Muestra
2 Muestra
Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min)
ΔA/min x 1750 = U/L de AST
Unidades: Una Unidad de actividad enzimática (UI) es la cantidad de enzima que convierte
1 μmol de substrato por minuto, en condiciones estándar. La concentración se expresa en
unidades por litro (U/L).
Interrogantes Bioquímicas.
1. ¿Cuál es la distribución celular de la TGO y TGP?
- La TGO está presente en las células de los músculos y el corazón mientras que la
TGP se encuentra exclusivamente en las células del hígado.
2. Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una enzima, exclusivamente
citosólica. ¿Está Ud. de acuerdo con esta afirmación? ¿Cuál sería la distribución
intracelular de la TGO? Fundamente su respuesta.
- Sí, porque se encuentra en el citosol de las células hepáticas. Mientras que la
TGO es una enzima bilocular, lo cual significa que se encuentra distribuida en el
citoplasma y en las mitocondrias de las células.
3. Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se incorporaran
en una proteína. Señale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este
fenómeno.
-
4. ¿Participan las reacciones de transaminación en la biosíntesis de aminoácidos?
-
5. ¿Qué pensaría de un ensayo en el cual una muestra biológica como el suero, se
mezcla con alanina, alfa-cetoglutarato, NADH y un exceso de lactato
deshidrogenasa?
