Tamaños relativos de las células y sus componentes

1 cm=10-2m
1 mm=10-3m
1 µm=10-6m
1 nm=10-9m
1 Å=10-10m
Molecula Célula
pequeña virus bacteria eucariota

1Å 1 nm 10nm 100nm 1µm 10µm 100µm 1mm 1cm

Microscopio electronico

Microscopio óptico
Ojo humano

0,2µm 0,15mm
Microscopios usados en microbiología

Microscopía óptica Microscopía electrónico

Luz visible (l=400-700nm) Haz de electrones (l=0,005 nm)
Amplificación: Magnificación de un objeto proporcionada por una
lente convexa.

Contraste: diferencias en la intensidad de la luz

Permite dis;nguir un objeto del fondo o detalles del
mismo.
Es propiedad del objeto.
Aumento contraste: Colorantes o diferencias de fase
Propiedad de la lente

Poder de Resolución: es la menor distancia entre dos puntos

adyacentes que pueden ser percibidos por separados (0,2 mm ojo humano)

Depende de tres factores

longitud de onda de luz de iluminación (l)
tamaño de la lente objetivo (!)
Indice de refracción del material entre
objetivo y objeto (n)
!
Longitud de onda
PR =
2 x AN AN = n x (sen !)
 v Utiliza luz visible para iluminar las estructuras celulares
v Está compuesto por dos lentes: Objetivo y Ocular

AUMENTOS Línea de visión Lente Ocular

Trayectoria de la luz
Prisma
Poder total de aumento:
A. lente obje+vo X A. Lente ocular
Lente Objetivo
10x 10x
40x Muestra

100x Condensador

Luz

Los aumentos están limitados

por la resolución
Tipos de lentes objetivos
Distancia frontal (5 0,46 0,13 mm)
Campo de visión (1,5 0,35 0,17mm2)
Profundidad de campo (7 017 0,25µm)

Objetivo de
inmersión

Longitud de onda
PR =
2 x AN 10x 40x 100x

OBJETIVO 10x 40x 100x

Aumentos totales 100 400 1000
AN = n x sen µ 0,25 0,55 1,25-1,4
Poder Resolución (nm) 900 350 200
(l=450)
Efecto del aceite de inmersión en la trayectoria de la luz

Objetivo de
inmersión
Objetivo de
Luz no inmersión
refractada

Sin aceite de inmersión

la luz se refracta y
se pierde

aceite de inmersión
100X
Porta

OBJETIVO DE INMERSION 100x

Distancia frontal (mm) 0,13 Lentes del
condensador
Campo de visión (mm2) 0,17 Condensador

Profundidad de campo (µm) 0,25

Aumentos totales 1000 Diafragma

AN = n x sen µ 1,25-1,4 Fuente de luz

Poder Resolución (nm) 200

 Problema
Tenemos un microscopio óptico con dos lentes objetivos:
AN1=0,5 y AN2=1,25
Datos, l = 500 nm, PR del ojo humano = 0,2 mm
a)¿Alguna lente tiene suficiente poder de resolución para ver una bacteria de 300 nm de
diámetro?
b) Qué lente ocular utilizaría

a)
longitud de onda PR1=500 nm
PR = Vemos una bacteria
2 x AN PR2=200 nm
de 300 nm
b) At= aumentos de la lente objetivo x aumentos lente ocular
Si el ojo humano tiene un poder de resolucion de 0,2 mm y la bacteria un diametro de 300 10-6
mm, al menos tendremos que aumentar 0,2/ 300 10-6 = 670 veces

AN>1 Objetivo de inmersión = 100x Ocular 10x

M.O. de campo claro: Tipos de preparaciones
Preparación en fresco
Preparación en fresco
Observación de microorganismos vivos
Poco contraste

Tinciones
Observación de microorganismos muertos.
Aumentan el contraste

Tipos de colorantes
Colorantes básicos: carga positiva, muy
utilizados, se unen a superficies de
microorganismos
(safranina, fucsina básica, cristal violeta, Tinción Simple
azul de metileno)
Tinc. Simples
Colorantes ácidos: carga negativa, tiñen
tejidos animales infectados con Tinc. Diferenciales
microorganismos
(eosina, fucsina ácida, rojo Congo)
Tinc. Específicas
 Tinc. Diferencial: Tinción de Gram
v Tinciones Simples
Aumentan el contraste

v Tinciones Diferenciales
Permite distinguir entre tipos de microorg.

v Tinciones Específicas: Revelan estructuras bacterianas

Tinc. de cápsula Tinc. de endospora Tinc. de flagelo
 Tinciones diferenciales: la tinción de Gram
G- G+

Tinción primaria 1) Cristal violeta 1 min

(colorante)
Todas las células azul-violeta

Gram-positiva Gram-negativa
Peptidoglicano Peptidoglicano
Lugol(IK )3 min
2) (mordiente)
Todas las células azul-violeta
Membrana
Membrana Periplasma
LPS
3) Etanol 30 seg
(decolorante)
Gram positivas azul-violeta
Gram negativas incoloras

Tinción de contraste 4) Safranina 2 min

(colorante de contraste)

Gram positivas azul-violeta

Gram negativas rosas
Técnicas usuales de tinción para bacterias

Tinción Uso Técnica

Tinciones simples
•Colorante Un colorante; proporciona Colorante básico (azul metileno, fucsina básica) durante 5 min.
contraste para observar un Se tiñen las bacterias; la mayoría de los tejidos no se tiñen
organismo completo
Tinciones diferenciales
•Tinción de Gram Dos o más colorantes; Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta
distingue entre bacterias y después con una solución de iodo. Las células se tiñen de
Gram positivas y Gram violeta oscuro. Se decolora con alcohol al 95%. Las Gram
negativas positivas permanecen teñidas, las negativas pierden el
colorante. Se tiñen con safranina. Las Gram positivas se
oscurecen y las negativas se tiñen de rosa
Tinciones específicas
•Tinción de esporas de Tiñe selectivamente las Se cubre la preparación con verde malaquita y se calienta a
Wirtz-Conklin endosporas emisión de vapores 5 min. Se lava con agua 30 seg y se tiñe
con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto
de la célula toma color rosa
•Tinción de flagelos de Permite observar los flagelos Se añade una mezcla de ácido tánico y rosanilina a las células
Leifson fijadas. El mordiente engruesa los flagelos; el colorante los
tiñe
•Tinción negativa Revela la presencia de Tinta china o nigrosina para teñir en fresco. El colorante no
capsulas penetra la cápsula que se observa como una región clara
alrededor de la célula
Otros Microscopios ópticos

Tipos de M.O. Características clave Aspecto de la imagen Principales aplicaciones

Las muestras requieren

Campo claro Contraste por absorción Imagen clara tinción; se observan
organismos completos
No requiere tinción; se
Contraste por interferencia;
Imágenes claras y pueden observar
Contraste de las diferencias en el índice
detalladas rodeadas de preparaciones en fresco de
fases de refracción cambian fase
un halo células vivas (estructuras
de la luz
internas)
En el objetivo entra sólo la
Imagen brillante contra Células vivas o estructuras
Campo oscuro luz dispersada por la
fondo oscuro externas (flagelos)
muestra
Emisión de luz visible de
Especímenes muy Identificación de tipos de
especímenes fluorescentes
Fluorescencia iluminados con luz
coloreados (luminosos) microorganismos presentes
contra fondo oscuro en una mezcla
ultravioleta
 Microscopio de Contraste de fases
Se coloca un dispositivo llamado anillo de fases
que amplifica la diferencia entre la fases de la luz
que atraviesa la muestra y la del líquido circundante Lente ocular

v Visualiza células vivas, sin teñir

v Proporciona considerable detalle interno.
v La imagen aparece con un halo de luz

Útil para estudiar motilidad, determinar la forma de

Lente objetivo
las células vivas, detectar endosporas, cuerpos de
inclusión …... Luz modificada
por la muestra
Microscopio de contraste de fase

Muestra

Anillo de fases
Microscopio de campo oscuro
La luz llega a la muestra únicamente desde los lados. La única luz que llega a la lente es la
que dispersa la muestra. Imagen clara con fondo oscuro.

Visualiza células vivas, sin teñir. Útil para Observación de estructuras externas, estructuras
internas de microorganismo eucariotas…

Ojo Ojo
Campo claro

Lente ocular

Sólo la luz dispersada por

Lente objetivo
la muestra es capturada
por la lente objetivo
Muestra
Campo oscuro
Luz no dispersada
Lente condensador
Disco opaco

Luz Luz
Ameba en campo oscuro
(Objetivo10/0.25, ocular 10X)
E. coli en campo oscuro
Colonias del alga verde Volvox. Colonias hijas dentro de la
colonia Volvox madura. Microscopía de campo oscuro
Células visualizadas por diferentes tipos de microscopía óptica.
El mismo campo de células de la levadura Saccharomyces cerevisiae
visualizado por microscopía de campo claro, microscopía de contraste de
fases y microscopía de campo oscuro. Las células tienen una anchura media
de 8-10 μm.

Contraste de fases Campo claro Campo oscuro

 Microscopía de Fluorescencia
La microscopía de fluorescencia se utiliza para visualizar
muestras que emiten Fluorescencia (Propiedad de una
sustancia de emitir luz de un color diferente al de la luz
que han absorbido).
Las células emiten fluorescencia porque contienen
sustancias fluorescentes naturales o porque estan
teñidas con un colorante fluorescente (fluorocromos)

v El microscopio de fluorescencia emite luz ultravioleta,

violeta o azul
v Compuestos fluorescentes absorben la luz UV y
emiten luz visible

Al utilizar luz ultravioleta el PR

es menor (100nm)
 Herramienta esencial en diversos ámbitos de la microbiología

v Microbiología médica: Bacterias patógenas pueden identificarse tiñéndolas con

fluorocromos o marcándolas de forma específica con anticuerpos fluorescentes.

v Ecología microbiana: Las células pueden teñirse con sondas marcadas con
colorantes fluorescentes (fluorocromos) que se unen a componentes específicos
de la célula. Los microorganismos pueden observarse y cuantificarse en un nicho
ecológico relativamente inalterado.

Colorantes que hacen que las células Mycobacterium teñida con Auramina Anticuerpos fluorescentes unidos a
vivas emitan fluorescencia verde y las Streptococcus pyogenes
muertas roja
 1.3 Microscopía Electrónica
Microscopía electrónica de barrido (MEB)

El Poder de Amplificación y el poder de

resolución del microscopio electrónico
es mucho mayor que el del
microscopio óptico.
Utilizan electrones en lugar de luz visible para
generar las imágenes de células y estructuras. La Microscopía electrónica de transmisión (MET)

longitud de onda de los electrones es de

aproximadamente 0,005 nm, unas 100.000 veces
menos que la luz visible.
Muchos microscopios electrónicos tienen límites de
resolución de 0,5 nm y aumentos útiles por encima
de 200.000 x .
Utiliza lentes electromagnéticas y todo el equipo
trabaja en un sistema de vacío.
 Microscopía electrónica

Microscopio
electrónico de Microscopio óptico
transmisión (MET)
Aumentos >200.000X 1000X
Haz de electrones Luz visible
Radiación utilizada
λ (0,005 nm) λ (450-700nm)
Poder de resolución Hasta 0,2 nm 200nm
Lente Electromagnética Cristal
Montaje de la Sobre rejilla y a vacío En portaobjetos
preparación

Imagen Se registra en pantalla Se produce en el ojo

o placa fotográfica

Metales pesados
Tinciones (a. ósmico, plomo, sales de Colorantes
uranio etc..)
Microscopía Electrónica de Transmisión (MET)
Los electrones pasan a través de la muestra y son proyectados en una pantalla
v Los electrones tienen poco poder de penetración, incluso la célula es demasiado
gruesa para visualizarse: es preciso realizar cortes ultrafinos para ver las estructuras
internas.
v Es necesario aumentar el contraste mediante tratamiento con metales pesados (a.
ósmico, plomo, sales de uranio etc..)

Haces de electrones Fuente de electrones

Lentes electromagnéticas

Muestra

Lentes electromagnéticas Visor

Lentes electromagnéticas

Pantalla fluorescente o Poder de resolución ≥ 0,2nm

película fotográfica Aumentos > 200.000x
MET cátodo

ánodo

Tinción positiva
(ultracorte)

Analiza estructuras celulares

 MET: Preparaciones de la muestras

v Secciones ultrafinas de la muestra (20-60 nm de espesor).

Uso de microtomo
v Desecadas, fijación química y teñidas con sales de metales
pesados. Trabaja en sistema de vacío.

Tinción positiva Tinción negativa

 Microscopía electrónica de barrido -MEB
v Se obtienen imágenes tridimensionales de una célula
v La imagen se crea con los electrones secundarios emitidos por la muestra
v Las muestras se recubren de metales pesados (oro)
v Sólo se observa la superficie del objeto
v Gran profundidad de campo (porción de la imagen que queda enfocada)

Aumentos 15-100 000X

Resolución menor que MET (3-20 nm)

Fuente de electrones Haz de electrones primarios

Lentes
electromagnéticas
Pantalla con imagen

Colector
Electrones

electrones
Secundarios

Muestra
Bacterias adheridas a un filtro (40 000 X)
Amplificador
MEB

v Útil para estudiar estructuras externas

de microorganismos
(sólo se ve la superficie de los objetos)

v No son necesarios cortes ultrafinos

v Excelente profundidad de campo

v Amplio rango de aumentos

(15 hasta 100.000 veces)

Saccharomyces cerevisiae
Microgra(as electrónicas.
Microgra(a de un corte fino tomada por microscopía electrónica
de transmisión (TEM) o microscopía electrónica de barrido (MEB).

MET MEB
 Los usos de los microscopios

Tipos de microscopía Características clave Aspecto de la imagen Principales aplicaciones

Microscopía óptica
Las muestras requieren tinción;
•Campo claro Contraste por absorción Imagen clara se observan organismos
completos

Contraste por interferencia; las Imágenes claras y detalladas No requiere tinción; se pueden
•Contraste de fases diferencias en el índice de rodeadas de un halo observar preparaciones en
refracción cambian fase de la luz fresco de células vivas

En el objetivo entra sólo la luz Imagen brillante contra fondo Células vivas o flagelos dema-
•Campo oscuro dispersada por la muestra oscuro siado finos para contraste fases

Emisión de luz visible de Especímenes muy coloreados Identificación de tipos de

•Fluorescencia especímenes fluorescentes (luminosos) contra fondo microorganismos presentes en
iluminados con luz ultravioleta oscuro una mezcla

Microscopía electrónica
Hace pasar un haz de electro- Imágenes muy ampliadas con Virus y ultraestructuras
•Transmisión (MET) nes a través de la preparación gran detalle celulares; no microorganismos
vivos (muestras desecadas)

Barre los especímenes con un Estructuras de microorganismos

chorro de electrones; la salida intactos, estructuras externas;
•Barrido (MEB) de electrones secundarios Imagen tridimensional no microorganismos vivos
genera imagen en ordenador (muestras desecadas)
Células visualizadas por diferentes 2pos de microscopía
a) Tinción simple de bacterias tomada por microscopía óp2ca de campo claro
(aumentos 100x; 400x; 1000x); b) Microgra;a de un corte fino de una célula
bacteriana en división, tomada por microscopía electrónica de transmisión (TEM)

a) b)
Microgra(as electrónicas.
(a) Microgra+a de un corte
fino de una célula
bacteriana en división,
tomada por microscopía
electrónica de transmisión
(TEM). Cada célula mide
unos 0,8 μm de ancho. (b)
TEM de moléculas de
hemoglobina teñidas por
Ención negaEva; (c)
Microgra+a tomada por
microscopía electrónica de
barrido (MEB)
Fundamentos del Cultivo de microorganismos

2.1 Concepto de cultivo puro

“Es un cultivo de una sola especie

microbiana, proveniente de una
sola célula”

1- Esterilización
2-Técnicas de Cultivo
3-Técnicas de Aislamiento
Cultivos puros de: Escherichia coli Sarcina lutea Serratia sp.
 Fundamentos del Cultivo de microorganismos

Técnicas de cultivo
Hay que proporcionar a los
microorganismos el adecuado:

o Ambiente bioquímico
(requerimientos nutricionales)
o Ambiente biofísico
(temperatura, pH, O2…)

“Microorganismos diferentes pueden tener

requerimientos nutricionales muy diferentes”
 Fundamentos del Cultivo de microorganismos
2.2 Medios de cultivo
Nutrición microbiana
NUTRIENTE: compuestos químicos del medio externo a par3r de los cuales
se forman los componentes celulares y se ob3ene energía.

Moléculas pequeñas à Macromoléculas

à Energía

MEDIO DE CULTIVO
Conjunto de nutrientes necesarios para
crecer un determinado microorganismo
Composición química de una célula * procariótica

* Es ampliamente constante a todos los organismos. Todas están compuestas

mayoritariamente por macromoléculas y agua: El agua (70-80%) es el principal
“nutriente”
Composición elemental E. coli

Porcentaje de
Macromoléculas peso seco
(%)

Proteínas 55
Polisacáridos 5
Lípidos 9,1
DNA 3,1
RNA 20,5
Total 96
 Tipos de nutrientes

MACRONUTRIENTES, se precisan en grandes cantidades

C, O, N, P, S, K, Mg, Ca, Fe

MICRONUTRIENTES o elementos traza, son iones metálicos

esenciales para la mayoría de las células, pero se requieren en
pequeñas cantidades
Co, Cr, Mn, Ni, Zn, Cu, Mo

FACTORES DE CRECIMIENTO, compuestos orgánicos esenciales

pero no pueden ser sintetizados por el organismo. Se necesitan en
pequeñas cantidades. Los requerimientos son variables según el
tipo de microorganismos. Son principalmente:
Aminoácidos, bases nitrogenadas y aminoácidos
 Principales nutrientes: MACRONUTRIENTES

% del
Elemento peso seco Fuente Función

Carbono 50 Compuestos orgánicos o CO2 Principal constituyente del material celular

Constituyente del material celular y del

H2O, Compuestos orgánicos,
Oxígeno 20
CO2 y O2
H2O celular. Como O2, aceptor de
electrones en la respiración aerobia

NH3, NO3-, nitrógeno orgánico,

Nitrógeno 14
N2
En proteínas, ácidos nucleicos, otros

H2O, compuestos orgánicos y Principal constituyente de compuestos

Hidrógeno 8
H2 orgánicos y H2O celular

Fósforo 3 Normalmente PO43- En ácidos nucleicos, fosfolípidos…

Normalmente SO42- H2S, So,

Azufre 1 compuestos orgánicos En aminoácidos (Cys, Met), vitaminas …,
azufrados

Potasio 1 Sales inorgánicas Principal catión inorgánico celular

Magnesio 0,5 Sales inorgánicas Importante catión celular

Importante catión celular, componente de

Calcio 0,5 Sales inorgánicas
endosporas
7
Hierro 0,2 Sales inorgánicas Constituyentes de citocromos
 Micronutrientes (elementos traza)

Difíciles de medir por estar en pequeña proporción. Generalmente están presentes en

el agua o componentes del medio. Son cofactores de enzimas esenciales para la célula
8
 Factores de crecimiento: vitaminas y sus
funciones

FACTORES DE CRECIMIENTO

compuestos orgánicos
esenciales pero no
pueden ser sintetizados
por el organismo. Se
necesitan en pequeñas
cantidades. Los
requerimientos son
variables según el tipo de
microorganismos.

9
Categorías nutricionales de los microorganismos

Fuentes de Carbono y energía

Fuente de carbono

Autótrofos CO2

Heterótrofos Moléculas orgánicas

Fuente de energía

Fotótrofos Luz
Oxidación de compuestos
Quimiótrofos orgánicos (organotrofos) e
inorgánicos (litotrofos)

10
Categorías nutricionales de los microorganismos*

Fuente de Fuente de
Tipo nutricional Ejemplos
energía carbono
Cianobacterias, algunas bacterias del
Fotoautótrofos Luz CO2 azufre rojas y verdes, microalgas

Compuestos Algunas bacterias rojas y verdes no del

Fotoheterótrofos Luz orgánicos azufre

La mayoría de microbios no
Compuestos Compuestos fotosintéticos, incluyendo la mayoría
Quimioheterótrofos orgánicos orgánicos de patógenos, hongos, muchos
protistas, y algunas arqueas.
Compuestos Bacterias oxidadoras de azufre, de
inorgánicos
Quimiolitoautótrofos (H2, NH3, NO2,
CO2 hierro, de hidrógeno, nitrificantes y
H2S)
muchas arqueas

*La mayoría de los microorganismos conocidos son:

Fotoautotrofos o Quimioheterotrofos
2.2 Medios de cultivo
Tipos de medios de cultivo

Pueden ser Líquidos o Sólidos

Medios Líquidos: Se denominan usualmente caldos.

Medios Sólidos: A partir de medios líquidos añadiendo solidificantes,

generalmente Agar, a una concentración entre 1-2%

AGAR:
v Polímero natural de algas marinas
v Funde a 90ºC, y permanece líquido ≥ 45ºC
v No metabolizable por la mayoría de
microorganismos (relativamente inerte)
v Otros solidificantes: gelatina, gel de sílice

Placa con Matraz con

medio sólido medio líquido
Tipos de medios de cultivo según su composición química

Medio definido (sintético o mínimo)

Aquel del que se conoce su composición exacta.
Se preparan a partir de compuestos químicamente puros.

Medio complejo (nutricionalmente ricos)

Se desconoce la composición química exacta. Se añaden además de los ingredientes
habituales, hidrolizados de compuestos naturales como:

v Peptonas Hidrolizados de proteínas de la carne, caseína, soja

Aporte de fuente de N, C y energía

v Extractos de carne Rico en aminoácidos, péptidos,

nucleótidos, vitaminas, minerales y ácidos orgánicos

v Extracto de levadura Aporte de vitaminas del grupo B

y compuestos de N y C

v Sangre
 Ejemplos de medios de cultivo para microorganismos con
requerimientos simples y complejos

Medio definido para E. Coli MD para Leuconostoc mesenteroides

K2HPO4 7g K2HPO4 0,6g
KH2PO4 2g KH2PO4 0,6g
(NH4)2SO4 1g NH4Cl 3g
MgSO4 0,1g MgSO4 0,1g
CaCl2 0,02g Glucosa 25g
Glucosa 4-10g Acetato sódico 20g
Elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Aminoácidos (los 20 aa esenciales, 100-200µg/cada
Cu, Ni, Mo) 2-10 µg de cada Purinas y pirimidinas (A, G, U, xantina) 10mg/cada
Agua destilada 1000 ml Vitaminas (biotina, folato, ácido nicotínico, piridoxal,
pH 7 piridoxamina, piridoxina, riboflavina, tiamina,
pantotenato, PABA) 0,01-1mg/cada
Elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo)
Medio complejo tanto para 2-10 µg de cada
E. coli como para L. Mesenteroides Agua destilada
pH 7
Glucosa 15g
Extracto de levadura 5g
Peptona 5g
KH2PO4 2g
Agua destilada 1000 ml
pH 7
Tipos de medios de cultivo según su función
MEDIOS SELECTIVOS
Tiene algún componente que inhibe el crecimiento de ciertos
microorganismos y favorece el de las especies deseadas.
Ej: Crecimiento de Levaduras en medio con cloranfenicol que inhibe a
la mayoría de las bacterias.

MEDIOS DIFERENCIALES
Permite distinguir entre distintos tipos de bacterias en base a
algún rasgo observable en el patrón de crecimiento.
Ej: Crecimiento de Staphylococcus aureus en presencia de manitol,
lo fermenta y acidifica el medio dando un color amarillo;
Staphylococcus epidermidis no utiliza manitol, no halo.

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
Permite aislar un tipo particular de microorganismo presente a
baja concentración en una población mixta.
Ej: bacterias fijadoras de nitrógeno a partir de muestra de suelo: sin
fuente de nitrógeno en el suelo 15
2. 2 Medios de cultivo

16
Ejemplo de medio químicamente definido para crecimiento de una bacteria
heterotrófica (Bacillus megaterium).
Fuente de carbono y energía: compuestos orgánicos

Componente Cantidad Función del componente

Sacarosa 10.0g Fuente de C y energía

K2HPO4 2.5g Tampón pH, fuente de P y K

KH2PO4 2.5g Tampón pH, fuente de P y K

(NH4)2HPO4 1.0g Tampón pH, fuente de P y N

MgSO47H2O 0.2g Fuente de S y Mg

FeSO47H2O 0.01g Fuente de Fe
MnSO4H2O 0.007g Fuente de Mn
H2O 985ml
pH7.0

17
Ejemplo de medio químicamente definido y de enriquecimiento para
crecimiento de bacteria litoautotrofa, como Thiobacillus thiooxidans.
Fuente de energía: compuestos inorgánicos, Fuente de Carbono: CO2

Componente Cantidad Función del componente

NH4Cl 0.52g Fuente de N

KH2PO4 0.28g Tampón pH, fuente de P y K

MgSO47H2O 0.25g Fuente de S y Mg

CaCl22H2O 0.07g Fuente de Ca

So 1.56g Fuente de energía

CO2* 5% Fuente de C

H2 O 1000ml

pH3.0

* medio aireado intermitentemente con aire que contiene 5% CO2

18
Ejemplo de medio complejo para crecimiento de bacteria exigente.

Componente Cantidad Función del componente

Fuente de vitaminas, minerales, N

Extracto de ternera 1.5g
y otros factores de crecimiento

Fuente de vitaminas grupo B, N y

Extracto de levadura 3.0g
otros factores de crecimiento

Peptona 6.0g Fuente de aminoácidos, N, S y P

Glucosa 1.0g Fuente de C y energía

Agar 15.0g Agente solidificante inerte

H2 O 1000ml
pH 6.6

19
20
21
22
23
24
25
2.3 Condiciones ambientales de cultivo
Reproducir las condiciones ambientales para el cultivo en el laboratorio

TEMPERATURA

Incubación a Tª óptima de crecimiento.

• Agitadores (medios líquidos)
• Estufas

pH pH

pH óptimo de crecimiento.
Se añade al medio agentes con poder
tampón: Fosfatos, carbonatos..etc
 2.3 Condiciones ambientales de cultivo
OXÍGENO
Tipos microbianos en función del oxígeno

TIPO DE MICROORGANISMO RELACIÓN CON EL O2

Microorganismos AEROBIOS

Aerobio Estricto (a) Necesario

No necesario, pero
Anaerobio Facultativo (c)
crecen mejor con O2
requieren bajas
Microaerófilo (d) concentraciones de O2

Microorganismos ANAEROBIOS

Anaerobio Estrictos (b) Letal

a b c d e
No necesario pero lo
Anaerobio Aerotolerante (e) toleran
Funciones del oxígeno en la nutrición
Los organismos que dependen de la respiración aerobia para obtener
energía, son los microorganismos AEROBIOS ESTRICTOS Ej.
Bacillus sp.

Dentro de este grupo, algunos crecen mejor a presiones parciales de

oxígeno considerablemente más bajas (0,2 atmósferas) que las
presentes en el aire, son los microorganismos MICROAERÓFILOS
Ej. Campylobacter

Además hay microorganismos aerobios que en ausencia de O2 pueden variar su

metabolismo (fermentación, respiración anaerobia), son los ANAEROBIOS FACULTATIVOS
Ej. [Link]

Los microorganismos que obtienen energía mediante otras vías que no implica la utilización
del oxígeno molecular se denominan ANAEROBIOS, para muchos de estos microorganismo
el oxígeno molecular es una sustancia tóxica que, o bien los mata o inhibe el crecimiento,
son los ANAEROBIOS ESTRICTOS Ej. Clostridium spp.
Otros son capaces de tolerar el oxígeno molecular y se les denomina ANAEROBIOS
AEROTOLERANTES Ej. BAL
CONTROL DEL OXÍGENO

• Los microorganismos aerobios se cultivan en

Agitación (cultivos líquidos) o se Gasea con una
atmosféra de [O2] conocida

•Los microorganismos anaerobios (proceden de

Ambientes naturales sin O2: fangos, zonas pantanosas, estomago
de mamíferos..etc) se cultivan en ausencia de O2

v Se Adicionan sustancias reductoras a medios

de cultivo sólidos: tioglicolato, cisteína,….
v Uso de Cámaras anaeróbicas
v Uso de Jarras anaeróbicas: Ej. Sistema Gaspack: al
introducirse en la jarra produce H2 + CO2 . El H2 en
presencia de un catalizador se combina con el O2 formando
H2O H2+O2 ➨ H2O
Siembra de microorganismos: Cultivos puros
Instrumentos de siembra

aguja

Asa

Placa Petri caldo

Estría
Picadura
Técnicas de Aislamiento
Aislamiento de una célula única

Una COLONIA es una población de células que proceden de la multiplicación de

una sola célula o espora” y dará lugar a un cultivo puro.

Una colonia puede tener aproximadamente 109 células

Técnicas de siembra por estria (en superficie)

Incubación…
Una célula viable Una colonia pura
…divisiones celulares

En la Práctica la colonia dará lugar al cultivo puro

Técnica de aislamiento por dilución y siembra en placa

Diluciones seriadas previas a la siembra en placa

Inóculo 9 ml/tubo
original

Diluciones
Siembra por extensión homogénea (en superficie)
Placa con
colonias en
superficie
Inóculo sobre Extensión en superficie
medio estéril

Incubación

Siembra por vertido en placa (en profundidad)

Colonias incluidas en el
seno del medio

Inóculo en placa
estéril
Incubación

Añadir medio estéril y

mezclar con inóculo

Placa crecida
 Conservación de cultivos puros

Mantener replicas de microorganismos è Cul3vos de colección

Colecciones de cul3vos 3po: ATCC, ECCO, DSMZ,...

Colección Española de Cul3vos Tipos (CECT)

[Link]
Técnicas de mantenimiento
Ø Resiembras periódicas
Ø Desecación. Alta mortalidad
Ø Liofilización: Congelación y desecación
Ø Ultracongelación: requiere crioprotectores (DMSO, glicerol,..)
Conservación a -80ºC (-150ºC en el CECT)
TEMA 3. Técnicas microbiológicas
• Necesidad de técnicas asép-cas en el laboratorio
3. Control de microorganismos • Control de patógenos

Esterilización: Eliminación de toda forma viva en un sustrato (inc. Virus)

Concepto estadís-co: Tratamiento que garan-za que “la probabilidad de que
exista un solo superviviente, vivo y con capacidad de reproducción en el objeto
tratado es infinitamente pequeña”

(células vegeta-vas, esporas , virus)

Técnicas de Esterilización usadas en Laboratorio

A. Métodos Físicos:
1-Temperatura (Calor Seco, Calor húmedo)
2- Radiación
3- Filtración
B. Compuestos Químicos
Métodos Físicos: Calor

Figura. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano

La destrucción por calor de los microorganismos sigue una cinética de primer
orden. La velocidad de muerte celular es proporcional al número de células y a la temperatura

“La muerte de una población microbiana es

generalmente exponencial o logarítmica”

-dN N
_____ = kdN Ln o
_____
= Kdt
dt N

Una medida de la eficacia del

tratamiento es el “Tiempo de
reducción decimal (D)”: Tiempo
requerido para destruir el 90% de los
microorganismos o esporas de una
Tiempo (minutos)
muestra a una temperatura determinada
Relación entre la temperatura y la velocidad
de muerte térmica para células vegetativas
Esterilización por calor húmedo
El calor húmedo destruye fácilmente microorganismos, el
calentamiento es rápido y tiene alto poder de penetración. Es
mucho mas eficaz que el calor seco: El vapor de agua posee un
coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el
aire.

Los efectos sobre los microorganismos son :

vdesnaturalización de las proteínas

valteración de membranas celulares

vDegradación de ácidos nucleicos

USOS: soluciones y materiales termorresistentes. Es el

método más usado en un laboratorio de microbiología para la
esterilización de medios de cultivo.
Esterilización por calor húmedo: El Autoclave
Dispositivo sellado que regula la presión interna y el tiempo

Calor en forma de vapor de agua a saturación y a presión:

Temperaturas > a 100ºC

CONDICIONES ESTANDAR
PRESIÓN: 1 ATM
TEMPERATURA: 121° C
TIEMPO: 20 MINUTOS

El tiempo de esterilización depende del volumen del líquido:

• volúmenes pequeños (< 3 litros) condiciones estándar
• volúmenes mayores > tiempos de tratamiento.
 Autoclave: Esterilización estándar 121ºC, 20 min, 1atm
Válvula de salida de vapor Válvula de salida
Vapor hacia Válvula de Indicador
después de esterilización seguridad de presión del vapor
la cámara

Vapor Puerta
Cámara
de vapor

Aire

Termómetro

Válvula de entrada de vapor

Salida del aire Entrada de vapor

Uso de ampollas de esporas de Bacillus stearothermophilus como bioindicador

en validación de procesos de esterilización
 Ciclo típico de un autoclave

Tiempo de autoclave

Se detiene el vapor
Temperatura (ºC)

Sube Tiempo de esterilización

la presión
Temperatura
Entra Temperatura del autoclave
vapor del objeto

Tiempo total del ciclo (min)

En el diseño del proceso de esterilización hay que tener en cuenta

los tiempos de calentamiento y enfriamiento del autoclave
 Otros tratamientos por calor húmedo

Tindalización
Tratamiento de esterilización. < 100° C. Tratamientos
de calor con sucesivos períodos de incubación. Las
esporas germinan durante los períodos de incubación y
en la siguiente exposición al calor las células vegetativas
son destruidas. DESTRUYE ENDOSPORAS

Pasteurización
Tratamiento de calor controlado (<100ºC) (desinfección),
se utiliza para alimentos como leche, nata, ciertas
bebidas alcohólicas etc.

ej. Tratamiento LTLT: 62,8 °C / 30 minutos

Esterilización por calor seco: Horno Pasteur

Se requiere mayor temperatura y tiempo de

exposición que el autoclave el aire es peor
conductor del calor que el vapor de agua.
Útil para esterilizar materiales termoresistentes
no adecuados para autoclave como material de
vidrio y otros materiales sólidos estables al
calor, productos en polvo, aceites etc..

CONDICIONES ESTANDAR: 2 horas a 160° C

MODO DE ACCIÓN: Oxida compuestos intracelulares

y desnaturaliza proteínas

VENTAJAS: No es corrosivo para metales e instrumentos.

Permite la esterilización de sustancias en polvo y no
acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.
Otros tratamientos por calor seco: Incineración

La incineración se utiliza para destruir material

descartable contaminado.

La acción directa de la llama elimina a los

microorganismos cuando se lleva al rojo el
material de metal como asas y agujas de
siembra.

Es un tratamiento de esterilización
Métodos físicos de control: Radiación y filtración
Radiación Ionizante (rayos X, gamma, haces de electrones)
Excelente agente esterilizante, penetra profundamente en los objetos.

Radiación no ionizante (UV) ( l = 220-300 nm)

Es letal, pero no penetra muy eficazmente en ciertas sustancias como vidrio y
suciedad, se utiliza como desinfectante de aire y superficies y para tratamiento
de agua potable
Radiación Ionizante
(rayos X, gamma, haces de electrones)
Es un excelente agente esterilizante, penetra profundamente en los objetos. Puede
destruir endosporas bacterianas y células vegetativas, aunque no siempre es
eficaz contra virus. Produce electrones y radicales libres que degradan y alteran
ácidos nucleicos y proteínas, rotura del ADN. Requiere instalaciones especiales.
USOS: material de plástico de laboratorio (tubos, placas de Petri,…), material
quirúrgico. Algunos alimentos también se irradian habitualmente
Radiación no ionizante (UV) ( l = 220-300 nm):
Es letal pero no penetra muy eficazmente ciertas sustancias como vidrio y suciedad,
se utiliza como desinfectante de aire y superficies y para tratamiento de agua
potable. Causa rotura y alteración del ADN

Ejemplo de esterilización por radiación U.V.

Campana de flujo laminar con fuente de rayos UV, para descontaminar superficies
 Sensibilidad a la radiación de algunos microorganismos
representativos
Tipo de microorganismo Características D10 (Gy)
Bacterias
Anaerobio Grampositivo,
Clostridium botulinum forma endosporas 3300

Coco Gramnegativo resistente a las

Deinococcus radiodurans radiaciones 2200

Lactobacillus brevis Bacilo, Grampositivo 1200

Aerobio Grampositivo,
Bacillus subtilis forma endosporas 600

Escherichia coli Bacilo, Gramnegativo 300

Salmonella typhimurium Bacilo, Gramnegativo 200
Hongos
Aspergillus niger Moho común 500
Saccharomyces cerevisiae Levadura 500

Virus
Glosopeda Patógeno de animales 13000
Coxsackie Patógeno humano 4500
D10: cantidad de radiación necesaria para reducir la población inicial a la décima parte.
Gy: grays: la dosis letal para humanos es 10Gy
 Filtración
La esterilización por filtración se utiliza para
eliminar microorganismos de los medios
líquidos que sean susceptibles al calor
(termolábiles). Ej. soluciones de antibióticos
o vitaminas. La esterilización se efectúa
pasando la muestra líquida a través de un
filtro con un tamaño de poro de 0.42 μm (o
menor). Los microorganismos quedan
retenidos en el filtro y el líquido se esteriliza.
También se utiliza para la esterilización de
gases.
Hay que tener presente que este sistema
no elimina los virus ya que son de menor
tamaño que el poro.
 Tipos de Filtros

Filtros de profundidad: Fibras

de papel o vidrio. Poros grandes e
irregulares (prefiltros). No esterilizan

Filtros de membrana: Acetato o

nitrato de celulosa. Poros pequeños,
constantes y numerosos (0,20-
0,45µm Ø). Esterilizan, uso en
microbiología

Filtros de nucleación:
Policarbonato tratado con radiación.
Poros muy uniformes. Uso en MEB
Bacterias y algas sobre filtro de
nucleación. Tamaño de poro 5 µm
 Filtros HEPA
Filtración de gases. filtros de alta eficacia de retención de partículas del AIRE

Eliminan el 99.97% de partículas de 0.3µm

Diagrama de flujo del aire

en una campana de seguridad
Campana de flujo laminar
con filtros HEPA
Técnicas de Control Microbiano usadas en Laboratorio
Compuestos Químicos

Agente Antimicrobiano:
Producto Químico que mata o inhibe el crecimiento de microorganismos

Causan muerte Microbicidas o germicidas

(bactericidas, fungicidas, viricidas)

Inhiben crecimiento Microbiostáticos

(bacteriostáticos, fungistáticos, viristáticos)

No todos se pueden usar in vivo

Toxicidad selectiva:
efecto tóxico sobre los microorganismos y
no sobre los organismos superiores (animales, hombre…)
 Agentes Antimicrobiano: Clasificación según su uso
-Desinfectante: Antimicrobiano que elimina prácticamente todos los
microorganismos patógeno, pero no todos los microorganismos. Tiene baja
toxicidad selectiva, sólo puede ser aplicado a superficies inanimadas

-Antiséptico: Agente antimicrobiano lo suficientemente poco tóxico para

ser aplicado en piel y mucosas.

-Esterilizante: Agente antimicrobiano que ataca a todas las formas de vida

(virus, esporas)

-Quimioterapéutico: Agente antimicrobiano con elevada toxicidad

selectiva, puede ser ingerido y se usa para control de enfermedades sin dañar
al hospedador.

A veces su acción depende de la concentración a la que se usen

 Antisépticos, desinfectantes y esterilizantes

Alcoholes: Antisépticos y desinfectantesàetanol, isopropanol…

Compuestos Halogenados: Antisépticos y desinfectantesà cloro, yodo

Metales pesados: Antisépticos y desinfectantes à Ag, Cu, Hg… ej. AgNO31%

Detergentes aniónicos y catiónicos: Desinfectantes à cloruro de benzalconio

Compuestos fenólicos: Antisépticos y desinfectantesàParabenos

Aldehídos: Esporicidas, esterilizantes químicosà Formaldehído, glutaraldehído

Gases: esterilizantes à óxido de etileno, peróxido de hidrógeno vaporizado

Algunos agentes antimicrobianos pueden actuar como ANTISÉPTICOS,

DESINFECTANTES y ESTERILIZANTES dependiendo de:

v Concentración/ Tiempo de exposición/ Forma de aplicación

 Antisépticos y desinfectantes comunes
Agente Modo de acción Aplicación
Etanol, Isopropanol Desnaturaliza proteínas Antiséptico en piel
(50-70%) solubiliza lípidos, Desinfectante

Antiséptico en piel (betadine).

Inactiva proteínas, agente
Derivados yodados Esporicida a altas
oxidante
concentraciones

fuertes oxidantes. Desinfectantes de agua,

Compuestos clorados no actuan bien en presencia desinfectantes habituales en
de materia orgánica laboratorio (lejía).

Antiséptico en gral,
Nitrato plata Inactiva proteinas
ojos recién nacidos

Antiséptico en piel,
Detergentes catiónicos Altera membranas celulares
Desinfectante

Eliminan físicamente a los

Jabónes y detergentes Antiséptico en piel
Microorganismos

Desnaturalizan proteínas.
Antisépticos a baja
Alteran membranas
Compuestos fenólicos concentración; desinfectantes a
persistentes y activos en
alta concentración
presencia de [Link]ánica
 Esterilizantes más comunes

Modo de
Agente Aplicación
acción
Inactivan ácidos Desinfectante(3-8%)
Formaldehido nucleicos y proteínas. Esporicida (37%)
Agente alquilante Esterilizante

Inactivan ácidos Desinfectante o

Glutaraldehido (2%) nucleicos y proteínas. Esterilizante en
Agente alquilante solución al 2%

óxido de etileno Agente alquilante Esterilizante para

(Gaseoso) inactiva enzimas material termosensible

Antiséptico (3%),
H2O2 Agente oxidante
Esterilizante (6-30%)
Agentes Antimicrobianos: QUIMIOTERAPÉUTICOS

ANÁLOGOS DE FACTORES DE CRECIMIENTO, son sustancias

sintéticas (Ej: sulfamidas)

ANTIBIÓTICOS, compuestos químicos producidos por microorganismos,

que inhiben o matan a otros microorganismos (Ej: penicilina)

Tienen alta toxicidad

selectiva
Dianas de los principales quimioterapéutico antimicrobianos

Síntesis de pared celular Elongación de ARN DNA girasa

Cicloserina Actinomicina Ácido nalidíxico (quinolonas)
Vancomicina Ciprofloxacino
Bacitracina Novobiocina
Penicilina
Cefalosporinas
Monobactamas
Carbapenos

Metabolismo ácido fólico RNA polimerasa dependiente de RNA

Rifampicina
Trimetroprim Estreptovaricinas
Sulfonamidas Tetrahidrofólico
Síntesis de proteínas
Ribosomas (inhibidores de subunidad 50S)
Dihidrofólico
Eritromicina (macrólidos)
Cloramfenicol
Clindamicina
Lincomicina

Síntesis de proteínas
(inhibidores de subunidad 30S)
Membrana citoplasmática
Tetraciclinas
PABA Espectinomicina
Estreptomicina
Gentamicina, tobramicina
Pared celular Kanamicina (aminoglicósidos)
Estructura de la membrana citoplasmática Amikacina
Nitrofuranos
Polimixina

Síntesis de proteínas (tRNA)

Mupirocina
Puromicina
 Resistencia a antibióticos
La Resistencia a antibióticos es la capacidad adquirida de un organismo para
resistir los efectos de un agente quimioterapeútico al que es sensible habitualmente

Mecanismos de resistencia (asociados o no a plásmidos)

v Permeabilidad reducida
v Inactivación del antibiótico
v Alteración de la diana
v Desarrollo de una ruta bioquímica resistente
v Bombeo hacia el exterior de la célula

Usos no médicos de los antibióticos:

v Alimentación animal como promotores del crecimiento
v Aplicación externa en frutas y verduras
“Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda
la suspensión del uso de antibióticos con fines no médicos”
 KAHOOT
1. ¿Qué agente antimicrobiano utilizarías para esterilizar material de laboratorio?
- Óxido de etileno
2. ¿Cuál de estos agentes antimicrobianos tiene mayor toxicidad selectiva?
- Agentes quimioterapéuticos
3. El peróxido de hidrógeno:
- Su acción depende de su concentración y tiempo de exposición
4. Para esterilizar un objeto utilizarías un agente microbiostatico o microbicida
- Microbicida
5. ¿Qué método utilizarías para esterilizar un medio de cultivo en el laboratorio?
- Autoclave
6. Se inocula un matraz que contiene 4950ml de medio con 50ml de un inóculo con 10^4 cel/ml y se incuba 4h.
Calcular No.
- 10^2 cel/ml
7. Se inocula un matraz con un inóculo en el mismo medio y conservado a 4ºC y se incuba a 28ºC. ¿Habrá fase
de latencia?
- Sí
8. La expresión matemática del crecimiento microbiano se puede aplicar en un cultivo en las fases:
- Exponencial y muerte
9. Un microorganismo: g=1 / a los 20 días N=10^3 células. ¿Número de células a los 23 días?
- 8x10^3
TEST
1. Los medios de cultivo se clasifican atendiendo a su composición química en:
- Definidos y complejos
2. En microscopía electrónica de barrido, para aumentar el contraste, la muestra se recubre con una fina capa
de:
- Sales de plomo
3. ¿Cuál de los siguientes métodos no se considera un método físico de control del crecimiento?
- Antisépticos
4. La ultraestructura del cromosoma procariota se puede observar únicamente por medio de microscopía
- Electrónica de transmisión
5. El ácido fólico, la biotina o la arginina son compuestos orgánicos necesarios para el crecimiento de algunos
tipos de microorganismos en bajas cantidades por lo que se consideran:
- Factores de crecimiento
6. La esterilización de una solución termosensible requiere la utilización de un mecanismo de filtración con un
tamaño de poro mínimo de:
- 0,2 µm
7. ¿Cuál es la forma de metabolismo encontrado solo en procariotas?
- Quimiolitoautotrofa
8. Calcular el poder de resolución de un microscopio que utiliza luz viable (longitud de onda = 500nm) y su
objetivo tiene una apertura numérica de 1
- 250
9. El tiempo de reducción decimal (D) es un parámetro aplicable al control del crecimiento microbiano por
temperatura y corresponde:
- Al tiempo en el que la población microbiana se reduce en un 90% a una temperatura determinada
10. ¿Qué diferencia a un organismo fotoheterotrofo de un fotoautótrofo?
- Su fuente de carbono
11. Una ruta metabólica que cataboliza completamente una fuente de energía orgánica hasta CO2 mediante la
ruta glucolítica y el ciclo del ácido tricarboxílico y en la que participa el O2 como aceptor final de la cadena
de transporte de electrones se denomina:
- Respiración aerobia
12. ¿Qué compuesto es el aceptor de electrones en la fermentación alcohólica?
- Acetaldehído