PLÁSMIDO
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico generalmente circular que se
replican y transmiten independientes del ADN cromosómico.1 Están presentes
normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como
las levaduras. Su tamaño varía desde 3 a 10 kb. El número de plásmidos puede variar,
dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Los
vectores plasmídicos permiten clonar ligandos de ADN exógeno de hasta 4 kb ya que un
tamaño mayor a este dificulta la clonación en estos vectores. El término plásmido fue
presentado por primera vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en
1952.2 Los plásmidos solo pueden coexistir como una o más copias en cada bacteria,
debido a la división celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.3
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN que se replican de manera independiente
al cromosoma de la célula hospedera. De manera natural se encuentran en las bacterias.
No son infecciosos (patógenos). También se encuentra en levaduras y hongos parasitados
por bacterias.
A veces establecen relaciones de simbiosis con su célula huésped pero manteniendo su
independencia en la replicación. Pero en otras ocasiones pueden originar tumores. Portan
genes de resistencia a antibióticos.
Pueden ser introducidos en las células bacterianas por un proceso de transformación, por
eso se utilizan como vectores de clonación.
Todos los vectores de clonación deben al menos contener:
1. Un origen de replicación para poder tener más de una copia del mismo en la célula
infectada. (Si miráis en la teoría del Operón, mejor)
2. Dos genes que confieran resistencia a diferentes antibióticos, (cloranfenicol y ampicilina)
lo que permite la identificación de las células que portan a dicho vector.
Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que
el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se
han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal,
los plásmidos no tienen proteínas asociadas.4
En general, no contienen información esencial, sino que confieren ventajas al hospedador
en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo más común es el de los plásmidos
que contienen genes de resistencia a un determinado antibiótico, de manera que el
plásmido únicamente supondrá una ventaja en presencia de ese antibiótico.5
Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el
cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en su
interior, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido.
Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su
capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal así como
también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias
genéticas.
1
Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les
confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros
métodos de selección además de la resistencia a antibióticos, como los basados en
fluorescencia o en proteínas que destruyen las células sin uso de antibióticos. Estos
nuevos métodos de selección de plásmidos son de uso frecuente en agrobiotecnología,
debido a la fuerte crítica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de
antibióticos en los organismos modificados genéticamente.6
Algunos plásmidos incluyen un sistema de adición o “Sistema de Muerte
Postsegregacional” (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto
un veneno de larga vida y un antídoto de vida corta.78 Las células hija que retienen una
copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que falla al integrar el plásmido
muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo de la célula
padre. Este es un ejemplo de plásmidos como el ADN replicante.9
Episomas
Son conocidos como factores R, otorgan resistencia a ciertos antibióticos a los
huéspedes,16 contienen de manera singular genes que codifican enzimas capaces de
destruir o modificar antibióticos, normalmente no están integrados en el cromosoma de la
bacteria que lo contiene, se han encontrado en los plásmidos genes que codifican la
resistencia a antibióticos como la ampicilina, el cloranfenicol y la kanamicina, entre otros,
algunos plásmidos R contienen un solo gen de resistencia otros en cambio llegan a tener
hasta 8, con frecuencia los genes de resistencia se encuentran en un elemento de
transposición de forma que las cepas bacterianas se pueden desarrollar con rapidez
plásmido que codifican resistencias múltiples. Como muchos plásmidos de resistencia son
a su vez plásmidos de conjugación pueden propagarse por toda una población aunque con
menor rapidez que el plásmido de fertilidad. Con frecuencia, los factores R no conjugativos,
pasan de una bacteria a otra durante la conjugación promovida por otro plásmido, con este
método toda una población puede hacerse resistente a los antibióticos. De hecho el que
algunos de estos plásmidos se puedan transferir fácilmente entre especies, promueve aún
más la propagación de resistencias. Cuando el huésped consume grandes cantidades de
antibióticos se selecciona bacterias con factores R y se hacen más prevalentes, los
factores R pueden entonces ser transferidos a géneros más patógenos como Salmonella
entre otros producir mayores problemas de salud pública.
2
Col-plásmidos
Las bacterias también albergan plásmidos con genes que les proporcionan una ventaja
competitiva, en el mundo de los microbios, las bacteriocinas son proteínas que destruyen
otras bacterias, pueden actuar solamente contra cepas estrechamente relacionadas, o en
ocasiones destruyen las células generando poros en la membrana plasmática o
degenerando la pared celular, provocando de este modo que se incremente su
permeabilidad, otro proceso para destruir la célula es degradando el ADN Y ARN o
atacando al peptidoglicano, los plásmidos col17 contienen genes para la síntesis de
bacteriocinas conocidas como colicinas que están dirigidas contra la e coli, existen
plásmidos con características parecidas, las cuales contienen genes que codifican
bacteriocinas dirigidas contra otras especias por ejemplo producen cloacinas que
destruyen especies de enterobacter, el huésped no se ve afectado por las bacteriocinas
que produce. Algunos plásmidos Col son conjugativos y contienen genes de resistencia.
Plásmidos degradativos
Los cuales habilitan la digestión de sustancias inusuales como tolueno o ácido salicílico.
Plásmidos virulentos
Los cuales convierten la bacteria en un patógeno. Son capaces de producir dos tipos de
toxinas, una toxina termolábil (LT) que es una proteína de gran tamaño muy similar en
cuanto a estructura y a mecanismo de acción a la toxina del cólera, y una toxina
termoestable (ST),
Plásmidos metabólicos
Poseen genes para que algunas cepas de rizhobium induzcan a la nodulación de las
legumbres y lleven a cabo la fijación del nitrógeno.
Conformaciones
El ADN plásmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, las cuales (para un
tamaño dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante electroforesis. Las
conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad electroforética (velocidad para
un voltaje dado), del más lento al más rápido:
Mellado abierto circular
El ADN tiene un solo corte filamentario.
Lineal
El ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron cortados o porque el
ADN era linear in vivo. Usted puede modelar este como un cordón que no se ha conectado
a sí mismo.
Circular relajado
El ADN que interactúa completamente con ambos filamentos sin cortar, pero que ha sido
enzimáticamente “relajado”. Usted puede modelar este dejando un cordón relajado y luego
conectándolo a sí mismo.
Superespiral desnaturalizado
El ADN como el ADN superespiral o superenrollado, pero que tiene regiones sin unir que lo
hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva alcalinidad durante la
preparación del plásmido.
3
ADN superespiral
Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar, y con forma de remolino,
resultando en una forma compacta.
La tasa de migración de pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al
voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso de altos voltajes, grandes
fragmentos migran continuamente a diferentes tasas. Por lo tanto, la resolución del gel
decrece con el incremento del voltaje.
A un bajo voltaje determinado, la migración de un pequeño fragmento lineal de ADN está
en función de su longitud. Fragmentos lineales largos (de 20kb) migran a cierta tasa sin
importar la longitud. Esto es debido a que las moléculas “reptan” desde el centro de la
molécula siguiendo el sentido de la matriz de gel.
La digestión restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos purificados de
plásmidos. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas.
Aplicaciones
Un epísoma es un plásmido que puede integrarse por sí mismo al ADN cromosomal del
organismo huésped.10 Por esta razón, puede mantenerse en contacto por un largo tiempo,
ser duplicado en cada división celular del huésped y volverse parte básica de su mapa
genético. Este término no se usa más en plásmidos, debido a que ahora está claro que una
región homóloga con el cromosoma elabora un plásmido dentro de un epísoma.11
Los plásmidos usados en ingeniería genética son llamados “vectores”. Estos son usados
para transferir genes desde un organismo a otro y típicamente contienen un marcador
genético confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. 12 La
mayoría también contienen un polivinculador o sitio de clonado múltiple (MCS),13 el cual es
una pequeña región que contiene los sitios de restricción más comúnmente usados,
permitiendo una fácil inserción de fragmentos de ADN en ese lugar.14
Tipos
Una forma de agrupar plásmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria.15 Los
plásmidos conjugativos contienen “tra-genes”, los cuales ejecutan complejos procesos de
conjugación, como la transferencia sexual de plásmidos a otra bacteria. Los plásmidos no-
conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugación, de allí que ellos pueden
transferirse únicamente con la asistencia de los plásmidos conjugativos y lo hacen “por
accidente”. Una clase intermedia de plásmidos son los “movilizables” los cuales llevan solo
un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden “parasitar” un plásmido
conjugativo, transfiriéndose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plásmidos de diferentes tipos el coexistir en una célula simple.
Siete tipos diferentes de plásmidos han sido encontrados en E.Coli. Pero normalmente
plásmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos
sobrevive en la línea celular, debido a la regulación de las funciones vitales de los
plásmidos. Por lo tanto, los plásmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de
compatibilidad.
Otra forma de clasificar plásmidos es por función. Hay 5 clases principales:
Plásmidos de fertilidad
También son conocidos como factores F los cuales contienen tra-genes, son capaces de
conjugarse. Desempeña un importante papel con la conjugación de E. coli. además de
haber sido el primero en ser descrito tiene una longitud aproximada de 10 Kb. contiene
genes responsables de la unión a la célula, y de la transferencia del plásmido ubicado
entre cepas bacterianas específicas en el proceso de conjugación. Gran parte del conjunto
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de la información para la transferencia de plásmidos se encuentra ubicada en el operón tra,
el cual contiene menos de 28 genes. Estos genes dirigen la formación de pili sexuales que
unen a una célula donadora, a una receptora, otros genes en cambio colaboran en la
transferencia de ADN. También contienen segmentos denominados secuencias de
inserción, colaboran en la inserción del plásmido en el cromosoma y en la célula del
huésped, por lo que puede existir fuera del cromosoma bacteriano o estar integrado en él.
Plásmidos de resistencia
La clonación del ADN es una técnica fundamental para la obtención de grandes cantidades
de un fragmento de ADN concreto, este fragmento primero debe ser unido a un ADN vector
antes de ser clonado. El ADN vector es un vehículo que se utiliza para transportar ADN
extraño a una célula huésped, el vector contiene secuencias que le permiten duplicarse
dentro de esta célula huésped.
En una técnica el segmento de ADN que va a ser clonado es introducido a un plásmido y
luego unido a una célula bacteriana, en ese momento la bacteria capta el plásmido del
medio. En otra técnica alternativa el segmento de ADN se une a un fragmento del genoma
del virus bacteriano lambda, luego este virus infecta a un cultivo de células bacterianas,
obteniendo así una gran cantidad de virus, siendo cada virus contenedor del fragmento de
ADN extraño.
En cualquiera de las dos técnicas mencionadas, una vez el fragmento de ADN extraño se
encuentra en el interior de la bacteria será duplicado junto con el ADN bacteriano o viral, y
repartido a las células hijas. De este modo el número de moléculas de ADN
recombinante aumenta en proporción al número de células que se forman. De modo que si
iniciáramos con una sola célula en poco tiempo tendríamos millones de copias de ADN.
Cuando se alcanza la cantidad de copias necesarias se puede purificar el ADN
recombinante y este podrá ser utilizado en otros procesos. Además de proporcionar un
medio para amplificar la cantidad de secuencia de ADN particular la clonación también
puede ser utilizada como técnica para aislar en forma pura cualquier fragmento de ADN
específico en una población heterogénea de moléculas de ADN
Clonación de ADN eucariota en plásmidos bacterianos
El ADN extraño que debe clonarse es introducido en el plásmido para formar una molécula
de ADN recombinante, los plásmidos usado para la clonación de ADN son versiones
modificadas, de los que se pueden observar en las células bacterianas. De la misma
manera sus contrapartes naturales de las cuales derivan, poseen una origen de
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duplicación y uno o más genes que confieren a la célula receptora resistencia a
antibióticos, la resistencia los antibióticos permite selecciona las células que contienen el
plásmido recombinante.19
Las bacterias que pueden captar el ADN de un medio, constituyen una base para la
clonación de plásmidos en células bacterianas. En este procedimiento a un cultivo que ha
sido pretratado con iones de calcio se le adicionan plásmidos recombinantes. Cuando el
plásmido ha sido captado este se duplica de manera autónoma en el interior de la célula
receptora. Las células bacterianas que contienen el plásmido se pueden seleccionar
porque se desarrollan en presencia del antibiótico contra el cual deben ser resistentes.
Cuando se alcanza la cantidad de amplificación deseada se extrae el ADN, el cual puede
ser separado con facilidad del plásmido de ADN recombinante. Además pueden tratarse
plásmidos recombinantes aislados con la misma enzima restrictiva que se utilizó en su
síntesis, la cual libera los segmentos de ADN clonados del resto de ADN que sirvió como
Vector. Posteriormente el ADN clonado se puede separar del plásmido.20
Uno de los principales beneficios de la clonación del ADN es que además de producir
grandes cantidades un una parte específica de ADN permite separar diferentes ADN en
una mezcla. Inicialmente se notó que las bacterias que poseen plásmidos se pueden
separar con tratamientos con antibióticos, cuando se realiza este tratamiento se pueden
sedimentar a baja densidad en placas Petri de tal manera que la progenie de una célula
permanece separa de la progenie de otra célula. Como existe una gran cantidad de
plásmidos recombinantes, las diferentes células sobre el plato el plato de cultivo poseen
diversos fragmentos de ADN extraños.
En los platos de cultivos que poseen las colonias bacterianas se investiga la presencia de
una secuencia de ADN particular, empleando técnicas combinadas de duplicación de
placas e hibridación in situ. Esta duplicación permite la preparación de un gran número de
platos de cultivos que contienen colonias representativas de una misma célula bacteriana,
y están posicionadas de la misma manera en cada plato. Se utiliza una de las réplicas para
la localización de una secuencia de ADN, en este procedimiento se requiere lisar las
células y fijar el ADN sobre la superficie, de un filtro cuando el ADN se encuentra fijado el
ADN se desnaturaliza para la hibridación in situ, durante el cual el filtro es incubado con
una sonda de ADN marcado que posee la secuencia complementaria buscada,
posteriormente con la sonda no hibridad se lava y se determina la localización de los
híbridos marcados mediante autorradiografía, solo entonces se seleccionaran los
representativos identificados vivientes de la clonación.
Pese a que es fácil la búsqueda de un solo gen humano usando este procedimiento, no se
trata de un gen práctico debido a que se requiere de cientos de platos Petri preparados.
Genética
Los plásmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de genética e
ingeniería bioquímica, donde son comúnmente usados para multiplicar (hacer muchas
copias de) o como genes particulares expresos. Muchos plásmidos están disponibles
comercialmente para dichos usos.2122
El gen a ser replicado se inserta en copias de un plásmido el cual contiene genes que
hacen células resistentes a un antibiótico en particular. En el paso siguiente el plásmido es
insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformación. Luego, la
bacteria es expuesta a un antibiótico particular. Solo la bacteria que toma copias del
plásmido sobrevive al antibiótico debido a que el plásmido lo hace resistente.22 En
particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer proteína) y la proteína
expresada evita la acción del antibiótico. De esta forma, los antibióticos actúan como un
filtro que seleccionan únicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden
6
ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el plásmido de interés puede ser
aislado.
Otro uso importante de los plásmidos es fabricar grandes cantidades de proteínas. En este
se deja crecer la bacteria que contiene el plásmido que encierra al gen de interés. Solo
como la bacteria produce la proteína que le confiere si resistencia a los antibióticos, este
también puede ser usado para producir proteínas en grandes cantidades desde el gen
insertado. Esta es una forma barata y fácil de producir genes o proteínas que este codifica
de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive antibióticos.
Extracción del ADN plasmídico
En el maxiprep se cultivan volúmenes mucho más grandes de bacterias en suspensión.
Esencialmente, este es un escalado de la preparación mini-prep, el cual es seguido por
una purificación adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg)
de ADN plásmido muy puro.23
En los últimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la
extracción plasmídica a varias escalas, purezas y niveles de automatización.
Resistencia a los antibióticos
Los plásmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les confieren una
ventaja selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la bacteria resistente a uno o varios
antibióticos. Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como
un origen de replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual habilita
al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal.
La adquisición de genes necesarios para elaborar estos mecanismos de defensa se ve
favorecida por una variedad de sistemas en los que se transfiere genes de manera
mezclada, tales como plásmidos conjugativos bacterianos, elementos transponibles y
sistemas integrón, que mueven genes de un sistema de ADN a otro y de una célula
bacteriana a otra, sin necesidad de que exista una relación con el donante de los genes.24
Los plásmidos bacterianos sirven como el andamio sobre el cual están montados arreglos
de genes de resistencia a antibióticos, por transposición (elementos transponibles y
transposición mediada por ISCR) y mecanismos de recombinación específicos de sitio
(casetes de genes integrón).
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Provirus
Los provirus son ADN viral integrado en el genoma de una célula huésped. Este estado
puede ser una etapa de la replicación del virus, o un estado que persiste durante períodos
más largos de tiempo, ya sea como infecciones virales inactivas o un Elemento viral
endógeno.
Fueron descubiertos en 1951 por Barbara McClintock en el maíz, son fragmentos
de ADN móviles, que constituyen genes y pueden pasar de una célula a otra; no
producen enfermedades, sino solamente inducen pequeñas mutaciones en la célula.
Podrían considerarse como formas más autónomas de transposones.
Un provirus no se replica a sí mismo miles de veces dentro del huésped, sino que aunque
esté inactivo se seguirá replicando pasivamente conforme la célula huésped lo vaya
haciendo, durante generaciones, lo que viene siendo una infección latente, la cual puede
activarse en respuesta a ciertos factores ambientales.
