¿Qué es Cromatografía?
La cromatografía es un procedimiento químico utilizado en todas las ramas de la ciencia, que
permite la separación, identificación, cuantificación, cualificación y determinación de los
componentes químicos individuales de sustancias en mezclas complejas, de acuerdo con la
purificación de compuestos de una manera muy precisa. Estos procedimientos, abarcan varias
técnicas separativas basadas en propiedades físicas de ciertos materiales que, en interacción con
otras sustancias o mezclas de éstas, permite descomponer la mezcla y analizar sus constituyentes,
mediante una fase móvil que consta, según el procedimiento, de un líquido o gas que corre a
través de una superficie y de la fase estacionaria y una fase estacionaria de materia sólida o líquida
que se queda en la misma posición.
Cromatografía
De esta manera, los componentes en una muestra a analizar se van distribuyendo en estas dos
fases, cuando la fase móvil atraviesa la fase estacionaria es lo que se denomina proceso de
elución. La separación de los distintos componentes de la muestra es resultado de repetidos
procesos de sorción – desorción de estos componentes, para finalmente lograr su separación y
visualizarlos en una gráfica que se conoce como cromatograma.
Los procedimientos más importantes en cromatografía son la cromatografía en papel,
cromatografía en capa fina, cromatografía en columna y la cromatografía de gases.
Esta técnica es muy efectiva por lo que es utilizada tanto en el área de la investigación como en el
campo industrial.
Tipos de cromatografía
Existen diferentes criterios de clasificación de la cromatografía:
Por la naturaleza de sus fases:
Cromatografía líquido - líquido
Cromatografía gas - líquido
Cromatografía líquido -. sólido
Cromatografía gas - sólido
Atendiendo al proceso químico-físico que va a protagonizar el proceso de separación: siendo
este el
criterio más coherente de clasificación:
Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o cromatografía de fases normales).
Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en las características de solubilidad
relativa de los solutos entre la fase móvil y una fase estacionaria de un líquido no polar. La fase
líquida se impregna a un soporte inerte de sílice o, en el caso de cromatografía de fase
invertida, se une químicamente.
Cromatografía de Intercambio iónico.
Cromatografía de Exclusión.
Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:
Cromatografía plana:
Cromatografía en papel
Cromatografía en capa fina (TLC)
Cromatografía en columna:
Cromatografía de gases (GC)
Cromatografía líquida (LC)
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por tener una fase estacionaria
que se
encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro por la que se hace pasar
una fase móvil
líquida o gaseosa que estará en permanente movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la
fase móvil
o la estacionaria, éstas se separaran.
Después de cada cromatografía se puede obtener información del cromatograma tanto cualitativa
(para
identificar los distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa (para poder obtener la
cantidad y
composición de las sustancias separadas).
Las fases estacionarias pueden ser de materiales muy distintos, existen derivados de dextranos
(sefadex),
derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio, sílice, etc.
Existen distintos tipos de cromatografía en columna:
Cromatografía de intercambio iónico: se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios
de
polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria.
Cromatografía de exclusión: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para
separar los
componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas.
Cromatografía de afinidad: se fundamenta en la especificidad de algunas macromoléculas
biológicas. Éstas se
unen específicamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolécula, bastará con
variar el pH una
vez que la columna este limpia y sólo se encuentre de interés.
Cromatografía de adsorción: se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los
compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se
determinan casi
exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que la fase móvil.
Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra
vez, la fase
móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de
partición
gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la
fase
estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. La cromatografía de gases (GC) y
de alta
resolución (HPLC) son técnicas de partición ampliamente empleadas.
Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de interacciones
hidrofóbicas entre las
moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria.
La naturaleza
actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado
de un
efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la
cromatografía de
fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor
de las
moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico
inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de
organización de la
estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema
CROMATOGRAFÍA PLANA
La mayoría de los principios que se aplican para la cromatografía en columna se aplican también a
la
cromatografía en superficie plana.
Cromatografía en capa fina (TLC)
Para la cromatografía en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de partículas de unos
milímetros de
espesor, fijadas sobre un soporte sólido generalmente de aluminio, plástico o vidrio. Después de
aplicar el
analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separación.
La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultáneamente la muestra y el patrón, mientras
que en la
cromatografía en columna las muestras se analizan individualmente. Además, las muestras que
son difíciles de
separar, se pueden resolver utilizando dos disolventes diferentes por desarrollo de la placa en
direcciones
perpendiculares.
Otra ventaja es que, si los componentes no se pierden en los vapores que rodean la placa, todos
estarán en
algún lugar de la misma, mientras que en la cromatografía en columna algunos componentes no
eluyen y se
pierden. Y a esto se suma que la placa de TLC se usa una sola vez, por lo que se pueden utilizar
condiciones
severas de separación.
La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con relación a la
distancia recorrida
por la fase móvil. El grado de retención en cromatografía plana de superficie se expresa como el
factor de
retardación, o índice de retención Rf: ܴ݂ =
ݐݑ݈ݏ݈݁݀ݐ݊݁݅ ݉ܽݖ݈ܽݏ݁݀݅ܿ݊ܽݐݏ݅ܦ
݁݊݁ݐݒ݈ݏ݈݀݅݁݀ݐ݊݁݅ ݉ܽݖ݈ܽݏ݁݀݅ܿ݊ܽݐݏ݅ܦ
El “frente” del disolvente es el límite alcanzado por la fase móvil, en éste se mide la distancia en
que se ha
desplazado éste. El valor de Rf depende de las mismas condiciones experimentales que el valor de
K de la
cromatografía en columna: la composición de la fase móvil, el tipo de fase estacionaria, la
temperatura y el
tipo de compuestos separados.
También se puede definir el coeficiente de distribución, K, en términos de la concentración del
soluto en la
fase móvil, Cm, y en la fase estacionaria, Cs:
=ܭ
ݏܥ
݉ܥ
La detección y localización de las manchas en la placa de TLC se hace observando los cambios en la
fluorescencia, o absorción en el U.V., de un indicador que se incorporó a la fase estacionaria. Toda
la placa
fluoresce bajo luz UV cuando no hay solutos presentes. Los lugares en los que reside el soluto
aparecen como
manchas oscuras. También podemos observar el color de los compuestos después de reaccionar
con reactivos
específicos para grupos o metales, rociados sobre la placa, como la fluorescamina para aminas.
Existen instrumentos para determinar directamente la fluorescencia y/o color de las manchas en
la placa. Los
instrumentos deben ser capaces de cuantificar la medida sobre el área total de la mancha.
Cromatografía en papel
En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se utiliza es de
celulosa. La
celulosa es muy polar en el agua y se vuelve electronegativa. El papel tiene propiedades de
intercambio iónico
débiles, así como de adsorción.
La mayoría de las propiedades varían de papel a papel, lo que provoca variaciones en el Rf.
Actualmente
existen papeles modificados con resinas cambiadores de iones, alúmina, etc. El aparato que se usa
consta de
un soporte para el papel, un recipiente para el disolvente y una cámara hermética para desarrollar
el
cromatograma. La cámara hermética es necesaria para evitar la evaporación de los disolventes
volátiles
debido a la gran superficie del papel expuesta. Antes de sumergir el papel en el disolvente de
elución se aplica
la muestra en forma de punto diminuto con cualquier objeto que pueda transferir un pequeño
volumen.
El papel debe estar en equilibrio con los vapores del disolvente antes de empezar el desarrollo. La
cromatografía en papel se ha aplicado con buen éxito a problemas de química orgánica e
inorgánica y de
bioquímica.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de
moléculas de
soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se
basa en un
equilibrio de intercambio iónico. Muchos de los experimento de intercambio iónico se llevan a
cabo en cinco
etapas.
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las
condiciones
apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las moléculas de soluto. En este
estado inicial,
los grupos que se intercambiarán están asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente
aniones o
cationes simples, como cloruro o sodio).
En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la cual las
moléculas del
soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen
reversiblemente al
gel. Las substancias que no se unen son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer
inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de
elusión, al
desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra y la cama del
intercambiador. Esto
normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su pH.
En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas bajo las
condiciones
experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente
purificación.
La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen diferentes grados
interacción con el
intercambiador iónico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de
carga en su
superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza iónica
y el pH. Las
diferencias en propiedades de carga de compuestos biológicos son a menudo considerables, y
tomando en
cuenta que la cromatografía de intercambio iónico es capaz de separar especies con propiedades
poco
diferentes.
Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio iónico en una columna, mediante un
procedimiento en
lote o por adsorción en cama extendida.
La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de
forma
covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones móviles. Estos contra-
iones pueden
intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz.
La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los intercambiadores
cargados
positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser
intercambiados por
lo que son llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores cargados negativamente
tienen contraiones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como intercambiadores
catiónicos.
La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las
características
de la matriz determinan sus propiedades cromatográficas tales como su eficiencia, capacidad y
recuperación,
así como su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectará su
comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de la actividad biológica
Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un
intercambiador
iónico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador iónico; su número total y
disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden escogerse para
usarse en
intercambiadores iónicos; algunos de estos se muestran a continuación.
Se usan los grupos sulfónico y amino cuaternario para formar intercambiadores iónicos fuertes, los
otros
grupos formar intercambiadores iónicos débiles. Los términos fuertes y débiles se refieren a la
extensión de
variación de ionización con pH y no a la fuerza del enlace. Los intercambiadores iónicos fuertes
están
completamente ionizados en un amplio rango de pH mientras que con los intercambiadores
iónicos débiles, el
grado de disociación y la capacidad de intercambio varia más marcadamente con el pH.
CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Fundamentos y principios básicos
El proceso cromatográfico puede ser considerado como: un conjunto de fuerzas que compiten de
manera
selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una parte, fijarlo al relleno de la columna o
fase
estacionaria, o llevarlo disuelto en los líquidos que fluyen a través de la columna o fase móvil. Los
distintos
tipos de fuerzas entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografía.
En la cromatografía de reparto se utilizan fases estacionarias polares (sílice, alúmina,
hidroxiapatito) y fases
móviles apolares (ciclohexano, isooctano, tetracloruro de carbono, etc.), aplicándose a la
separación de
solutos apolares. El origen de la retención es, por tanto, la interacción de los grupos polares de los
analitos con
los grupos polares de la superficie del relleno.
En la de partición la fase estacionaria es líquida, es necesario ligarla o embeberla sobre partículas
inertes
(generalmente de sílice) para que permanezca fija en la columna. Hoy en día los grupos
funcionales se fijan
mediante enlace químico a las partículas de relleno, lo que permite a la fase estacionaria resistir
las altas
presiones aplicadas en HPLC.
Hay dos posibilidades en la cromatografía de partición: cromatografía en fase normal (cuando la
fase
estacionaria es polar, por ejemplo si contiene grupos ciano, diol, amino o dimetilamino) y
cromatografía en
fase inversa (cuando la fase estacionaria es apolar, por ejemplo con grupos C8 ó C18). La
cromatografía de
partición en fase inversa es la más utilizada de todas las técnicas HPLC, pues las fases móviles
polares
permiten separar una amplia variedad de compuestos de interés bioquímico, farmacológico o
químico. En fase
inversa la retención esta basada en una atracción primaria entre la fase estacionaria y la región no
polar del
analito. El orden de elución es de hidrofílico a hidrofóbico, de polar a no polar. Para aumentar la
retención de
un compuesto, es necesario aumentar la polaridad de la fase móvil. La fase estacionaria más
común es C18.
Las fases móviles más comunes son; acetonitrilo, metanol, tetrahidrofurano, etc. con agua como
componente
de la fase móvil.
En cromatografía de intercambio iónico la fase móvil compite con la estacionaria por los solutos
mediante
fuerzas iónicas. La limitación es que el soluto sea iónico (un anión o un catión). Se trata de una
técnica muy útil
para separar iones inorgánicos, proteínas, etc. Mediante supresión iónica se separan compuestos
iónicos,
suprimiendo (o reduciendo) su estado iónico en solución a través del control del pH, de manera
que quedan
más retenidos en rellenos de fase reversa. Se trata, por tanto, de adaptar la cromatografía de
partición en fase
reversa a la separación de mezclas que contienen uno o varios compuestos ionizables. Funciona
bien para
ácidos débiles y bases débiles. Otro tipo es la cromatografía de pares iónicos que se forma al pasar
una fase
móvil polar que contiene un contraión de carga contraria a la de los solutos, se suele añadir a la
fase móvil un
catión o un anión hidrofóbico, que interacciona con el analito formando el par iónico.
La cromatografía de exclusión molecular separa los solutos en función de su tamaño molecular. El
principal
inconveniente es que se trata de un método de baja resolución. No obstante, es muy útil para la
separación de
proteínas y otras moléculas de alto peso molecular. Es importante que no haya interacción entre
la fase
estacionaria y la muestra.
Las reglas básicas en HPLC son cuatro:
1. Fase móvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta.
2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase móvil (es decir, polaridad similar).
3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagación).
4. Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migración diferencial).
La elución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra
disuelta en la
fase móvil a través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La
porción de
muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se
distribuyen por sí
mismos entre las dos fases según la naturaleza química de éstos con respecto a las fases móvil y
estacionaria.
Adiciones posteriores del disolvente llevan a las moléculas de soluto hacia abajo en la columna,
hasta que
salen de ella en una tiempo determinado (tx).
La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fracción de tiempo que ha necesitado para
salir de la
columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad será pequeña para solutos
fuertemente
retenidos por la fase estacionaria, y será grande para solutos que tengan mayor afinidad por la
fase móvil.
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma en una gráfica en
función del
tiempo denominada cromatograma. El cromatograma discurre horizontalmente paralelo a la
escala de
tiempos (línea de base), zona que informa de las condiciones generales del sistema en ausencia de
solutos.
Luego se observa un brusco incremento sobre la línea base, seguido de un descenso más o menos
simétrico
que enlaza con la continuación de la misma (pico cromatográfico).
Idealmente el pico tiene apenas anchura: es estrecho, casi una línea vertical. Pero muchas veces
presenta una
anchura apreciable, tomando el aspecto habitual de una gaussiana. También se presenta una
primera banda
peculiar ascendente-descendente (frente del disolvente o frente de inyección), no siempre
observable, y que
suele hacerse coincidir con el tiempo muerto del sistema o tiempo necesario para que un fluido sin
retención
atraviese físicamente la columna, tubos, etc. del sistema.
Las moléculas de un mismo soluto, pese a hallarse sometido a las mismas fuerzas, no eluyen todas
al mismo
tiempo, sino obedeciendo a un modelo gaussiano.
Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posición en el
eje) como
cuantitativamente (área bajo los picos) los componentes de la muestra.
La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del área del pico de un
analito con el
de uno o más estándares. Ambos parámetros varían linealmente con la concentración. La
cromatografía
cualitativa se basa en la comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de
retención) con
cromatogramas estándares.
La efectividad de la columna cromatográfica para la separación de solutos depende de las
velocidades
relativas a las cuales las especies son eluídas. La eficiencia máxima para la cromatografía líquida
ocurre a muy
bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el
tamaño de la
partícula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase móvil o se incrementa la
temperatura.
En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con
diámetros de
1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partículas de la fase estacionaria no superaban las 150-
200 µm de
diámetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso así, los tiempos de separación eran
largos,
podían llevar varias horas.
La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid Chromatography) es el
método más
sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria para
el interior de
la columna con diámetros muy pequeños para aumentar la eficiencia, en torno a 3-10 µm. Así, se
ha
conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de diámetro en la
HPLC, y el
tiempo necesario para la separación.
