TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

 INTRODUCCIÓN
• Técnicas de hibridación → Hibridación de los ácidos nucleicos con sondas
específicas marcadas.
• Southern blot, Northern blot, Hibridación in situ, Array-CGH, FICTION…
• La hibridación de AN es fundamental para técnicas de biología molecular
como PCR, MLPA…
• Se usa para:
- Localizar secuencias de ADN o genes relacionados con trastornos
cromosómicos submicroscópicos.
- Identificar m.o. patógenos en microbiología clínica.
- Estudio de perfiles de expresión génica.
- Comparación de especies hibridando su ADN.
 TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN DE AN
• Formación de moléculas bicatenarias con hebras de AN de distinto
origen.
• Las 2 hebras deben tener secuencias total o parcialmente
complementarias. A > proporción de bases complementarias y >
longitud de las secuencias apareadas, más estable es el dúplex
formado.
• Para detectar la secuencia diana, una de las cadenas debe estar
marcada.
• Sonda marcada → Hibridación estándar.
• Diana marcada → Hibridación reversa.
• SECUENCIA DIANA O “BLANCO” → Muestra de ácido nucleico que se
quiere identificar.
• SONDA → Fragmento corto de AN (ADN, ARN, oligonucleótidos
naturales o sintéticos) de secuencia conocida y complementaria a la
secuencia diana.
 ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN
• Hibridación en fase líquida: la hibridación se realiza en disolución.
Muestra + Sonda marcada con reactivo luminiscente
Se añade un álcali que inactiva el cromógeno cuando la sonda está
libre, pero no cuando la sonda ha hibridado con su secuencia.
La luminiscencia medida corresponde a la sonda hibridada.
• Hibridación in situ: la sonda se aplica sobre muestras en su ubicación
natural (cortes de tejido, células, núcleos aislados, cromosomas…). Cuando
la sonda se une a su ADN complementario, emite una señal que permite su
localización.
• Hibridación en soporte sólido: la muestra de ADN diana se inserta en una
matriz sólida. Se añade la sonda marcada. Finalizada la hibridación se lava
para eliminar la sonda no unida y se detecta la sonda fijada a través del
marcador.
 SONDAS
• Segmentos de ADN o ARN marcados con enzimas, sustratos
antigénicos, quimioluminiscencia o radioisótopos, que se pueden unir
con una alta especificidad a una secuencia complementaria de AN.
• Sondas de ADN → obtenidas por clonación de ADN o productos de
PCR.
• Sondas de ARN o ribosondas → obtenidas por transcripción de
fragmentos de ADN clonados en vectores especiales, en presencia de
una ARN polimerasa específica.
• Sondas sintéticas → oligonucleótidos obtenidos por síntesis química.
Hibridan más rápidamente a las moléculas diana y pueden detectar el
cambio de un nucleótido dentro de una secuencia de AN.
 MÉTODOS DE MARCAJE DE LAS SONDAS
• Marcadores no radiactivos: biotina, digoxigenina, peroxidasa…
• Marcado estable bajo diversas condiciones de Tª, detergentes y no
debe afectar a la reacción de hibridación.
 MÉTODOS DE
MARCAJE

POSTERIOR A LA DURANTE LA
SÍNTESIS SÍNTESIS

MARCAJE DE LOS
MARCAJE GLOBAL EXTREMOS (end-
labeling)

POR TRASLACIÓN POR CEBADO AL

DE MELLAS (nick- AZAR (random
translation) priming)
 MARCAJE DE SONDAS DURANTE SU SÍNTESIS
• El marcaje se realiza al mismo tiempo que se sintetiza la sonda.
• Para marcar sondas obtenidas por PCR y sondas sintéticas.
• Añadir ADN polimerasa y desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) o NTP
marcados con isótopos radiactivos o con fluorocromos.
• La ADN polimerasa va incorporando los nucleótidos marcados a
medida que va sintetizando la sonda.
 MARCAJE POR TRASLACIÓN DE MELLAS
(NICK-TRANSLATION)
• Enzima ADNasa I → cortes en el interior de la molécula de ADN.
• Corta los enlaces fosfodiéster en una de las 2 cadenas en puntos aleatorios,
dando mellas con grupos 3´-OH y 5´-P libres.
• Enzima ADN polimerasa I de [Link] que se introduce en la mella.
• Con actividad exonucleásica 5´→3´ elimina los dNTP del extremo 5´.
• Con su actividad polimerásica añade nucleótidos marcados y sin marcar en
el extremo OH 3´libre.
• Se deben añadir dNTP, sin marcar y marcados, en proporción 1:4.
• El proceso es igual en todas las mellas y en cada hebra ocurre en sentido
opuesto.
• Se obtiene ADN con regiones marcadas en ambas hebras.
 MARCAJE POR CEBADO AL AZAR
(RANDOM PRIMING)
• Desnaturalización por calor (↑ Tª a 94ºC) → cadenas simples.
• Añadir una mezcla de hexanucleótidos que actúan de cebadores o primers.
Algunos reconocerán una secuencia complementaria y se unirán a ella en
algún punto de las 2 cadenas. La unión es aleatoria.
• Se añaden dNTP marcados y sin marcar.
• Los extremos 3´OH de los hexanucleótidos hibridados actúan como
cebadores para la actividad ADN polimerasa del fragmento Klenow que
incorpora los nucleótidos.
• Así se sintetiza la sonda de ADN marcado (200-400 nucleótidos)
complementaria a las hebras del ADN inicial.
• Estas sondas tienen una elevada actividad específica.
 MARCAJE EN LOS EXTREMOS
(END-LABELING)
• Para marcar fragmentos de ADN muy pequeños (100-200 pb).
• Se emplea una fosfatasa que elimina el grupo ℗ de los extremos 5´.
• Se añaden nucleótidos (dATP) marcados con el isótopo radiactivo 32P.
• La E polinucleótido quinasa añadirá el grupo ℗ marcado a los
extremos 5´.
 PROCEDIMIENTO DE HIBRIDACIÓN
• Desnaturalización de la doble hélice para obtener ADN de cadena simple, con ↑ de Tª o
con tratamiento alcalino.
• Hibridación al mezclar la cadena de ADN diana con la cadena de ADN o ARN de la sonda
(ADN-ADN y ADN-ARN).
• Si el enfriamiento se hace lentamente, las secuencias complementarias de la diana y la
sonda pueden formar puentes de H formándose una cadena doble en esa zona.
• La calidad en la unión viene determinada por unos moduladores que condicionan la
fidelidad o perfección en que se produce la hibridación→ Astringencia de la hibridación.
• La astringencia es la medida de la capacidad de reconocimiento mutuo de las secuencias
sonda y diana.
• Una > astringencia exige una > complementariedad en la secuencia para que pueda
producirse la hibridación.
• Las condiciones de astringencia determinan la estabilidad de la doble cadena formada.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA HIBRIDACIÓN
• Concentración de la sonda → afecta a la tasa a la cual se forman los
primeros enlaces entre pares de bases. A > C > tasa de realineación.
• Composición de la sonda → Las sondas con una mayor proporción de
G-C tienden a formar uniones más estables, ya que estas dos bases
forman enlaces con tres hidrógenos, a diferencia de las bases A-T que
lo forman con dos.
• Complementariedad de las secuencias de bases → Si es < al 70% se
considera no homóloga y ocurre en condiciones de baja astringencia
(Tª baja o C alta de sales).
• Longitud de las sondas → A > longitud > nº de puentes de H y >
estabilidad.
 MODULADORES DE LA ASTRINGENCIA
• Temperatura: Generalmente se sostiene que la tasa máxima de renaturalización
(hibridación) del ADN es a 25ºC, pero pueden haber algunas variaciones.
Dependiendo de los reactivos empleados y demás condiciones de hibridación,
generalmente está entre 16-32ºC. A > Tª > astringencia.
• pH: Normalmente la tasa de renaturalización no se ve alterada por el pH, siempre
y cuando su valor esté entre 5 a 9. Generalmente se usan buffers con pH 6.5 – 7.5
pero se pueden usar pH mayores para producir condiciones más astringentes.
• Fuerza iónica: Los cationes (iones sodio) interactúan electrostáticamente con los
ácidos nucleicos (principalmente los grupos fosfato), por lo que la repulsión
electroestática entre el par de cadenas disminuye al incrementar la concentración
de sal (altas concentraciones de sal incrementan la estabilidad del híbrido). A > C
de sales < astringencia.
• Agentes químicos como urea y formamida: disminuyen la estabilidad porque
impiden la neutralización de los grupos ℗ por las sales de Na y Mg. ↑ la
astringencia.
 HIBRIDACIÓN IN SITU
• La sonda se hibrida directamente sobre la secuencia diana de un
tejido, células o cromosomas localizados sobre un soporte sólido,
generalmente un portaobjetos.
• La visualización de la hibridación se realiza por medios isotópicos,
fluorimétricos (FISH) o enzimáticos colorimétricos (marcaje
cromogénico CISH, SISH).
• Es evaluada en un microscopio de fluorescencia o de campo claro.
• Se utiliza en anomalías cromosómicas, patología molecular, para
detectar agentes virales y carcinógenos.
 HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU
(FISH)
• La sonda se marca con reactivos fluorescentes que permiten su visualización con luz UV.
• La FISH aplicada a la detección de anomalías cromosómicas es una técnica de
citogenética molecular.
• Permite detectar e identificar un gran nº de anomalías cromosómicas como
microdelecciones y microduplicaciones inferiores a 3-5 Mb. También reorganizaciones
cromosómicas y reorganizaciones crípticas (no se aprecian con el microscopio óptico).
• Esta técnica de hibridación se basa en la capacidad de una hebra sencilla de ADN (sonda)
para unirse o hibridar con su secuencia complementaria en la extensión metafásica o
interfásica. La sonda se conjuga con nucleótidos modificados que permitirán visualizarla
con luz ultravioleta una vez hibridada.
• La FISH es una técnica en la cual cromosomas enteros o porciones de éstos son marcados
con sondas fluorescentes que reconocen secuencias específicas en cromosomas
metafásicos o núcleos celulares fijados.
TIPOS DE SONDAS UTILIZADAS EN FISH
• Se distinguen cuatro tipos de sondas, en
función de las estructuras que son capaces
de detectar en el núcleo celular o en
metafase:
- Sondas específicas de gen o locus.
- Sondas centroméricas.
- Sondas subteloméricas
- Sondas de pintado cromósómico.
 SONDAS LOCUS ESPECÍFICO
(LSI)
• Hibridan con una secuencia única de ADN, es decir, son específicas para un locus
determinado.
• Permiten detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosómicas
concretas e identificar deleciones y duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Mb.
• Su aplicación requiere conocer a priori la región que se desea estudiar.
• Existen dos tipos de sondas LSI que permiten detectar reordenamientos estructurales:
- Sondas de fusión → cuando hay un reordenamiento, se obtiene un patrón de doble
fusión. Tras la translocación dan una señal amarilla.
- Sondas break apart → tienen un patrón normal de dos fusiones y, cuando reordena,
una de las fusiones “se rompe”, se separa. Estas sondas se utilizan principalmente en
hematología.
 SONDAS CENTROMÉRICAS O DE ADN
SATÉLITE O SONDAS CEP
• Identifican los centrómeros, los cuales, a pesar de ser prácticamente
idénticos para todos los cromosomas, se distinguen en un 2-3% de su
secuencia, lo que permite que la mayor parte de los centrómeros
individuales puedan ser distinguidos a excepción de los centrómeros
de los cromosomas 13 y 21, y de los centrómeros de los cromosomas
14 y 22.
• Permiten detectar cromosomas concretos e identificar alteraciones
de tipo numérico, especialmente monosomías, trisomías y otras
aneuploidías, tanto en metafase como en interfase.
 SONDAS SUBTELOMÉRICAS
• Son sondas de ADN que identifican regiones cromosómicas próximas
a los telómeros, que contienen secuencias únicas que son específicas
de cada cromosoma.
• Poseen una alta resolución y han demostrado ser una herramienta
muy útil para la detección de muchas anomalías cromosómicas que
implican las regiones teloméricas. Dicha identificación es importante
dado que estas regiones subteloméricas contienen gran cantidad de
genes.
FISH SUBTELOMÉRICA DE TODOS LOS CROMOSOMAS
 SONDAS DE PINTADO CROMOSÓMICO
• Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un determinado cromosoma se
consigue pintar sólo los cromosomas homólogos correspondientes, permitiendo así detectar de
forma rápida, alteraciones numéricas y estructurales intercromosómicas que afecten a ese
cromosoma específico.
• Son sondas complejas de ADN mediante las cuales, tras la hibridación, aparece pintado
uniformemente todo el cromosoma, por lo que son conocidas como sondas WCP (whole
chromosome painting)
• Sirven para detectar translocaciones difíciles de identificar con las técnicas de citogenética
convencional, así como para identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma
derivativo en pequeños marcadores supernumerarios. Si bien se pueden utilizar en interfase, se
aconseja su uso sobre metafase.
• Los principales inconvenientes de la utilización de estas sondas son la no detección de inversiones
paracéntricas y su baja resolución, que impide detectar pequeñas deleciones, duplicaciones y
translocaciones (< 2-3 Mb).
• Con el pintado cromosómico múltiple se consigue pintar de forma simultánea todos los
cromosomas, pero en metafases independientes.
Éste es un ejemplo de una célula en metafase que se ha
hibridado con la sonda diseñada para detectar el síndrome de
DiGeorge, llamado también velocardiofacial (VCFS), CATCH 22
o de Shprintzen, causado por una microdeleción en el
cromosoma 22. En este caso particular, se emplea una mezcla
bicolor de dos sondas distintas para el cromosoma 22. La señal
verde es un control interno que hibrida en 22q13. Permite
identificar rápidamente los dos cromosomas 22. La señal roja
está situada en la región DiGeorge, en 22q11.2. Puesto que
ambos cromosomas 22 tienen la señal roja, en esta célula no
hay microdeleción en la región DiGeorge y este paciente no
padecería el síndrome DiGeorge.
Esta otra metafase se ha hibridado con una sonda "de pintado"
para el cromosoma 4 (una colección de sondas que se unen a
lo largo de todo el cromosoma), lo que hace que el cromosoma
completo emita fluorescencia. Uno de los cromosomas 4 de
este paciente era anormal, pero era difícil determinar con la
citogenética de rutina si tenía una pequeña deleción terminal
en 4q o si era el resultado de una reordenación más compleja.
Puesto que ambos cromosomas 4 muestran fluorescencia en
toda su longitud y no hay material fluorescente en ningún otro
cromosoma, esto sugiere que la anomalía es una deleción
terminal pequeña. La metafase mostrada a continuación es del
mismo paciente y confirma este diagnóstico.
Esta metafase del mismo paciente anterior se ha hibridado con
una sonda diseñada para la parte terminal del cromosoma 4q.
Puesto que sólo hay una señal verde, se confirma que en uno
de los cromosomas 4 falta material del extremo terminal del
brazo q. Este caso es un buen ejemplo de cómo combinando la
citogenética de rutina con la FISH se pueden diagnosticar con
exactitud anomalías cromosómicas sutiles
Éste es un ejemplo de una célula en metafase que se ha
hibridado para detectar la deficiencia de esteroide-sulfatasa,
causada por una microdeleción en el cromosoma X. En este
caso particular, se emplea una mezcla de dos sondas
independientes para el cromosoma X, ambas con color rojo. La
señal de la sonda marcada con "X cen" es un control interno
localizado en el centrómero de X, que permite la identificación
rápida del (o los) cromosoma(s) X. La señal "Xp22.3" de la
sonda está localizada en la región de la esteroide-sulfatasa, en
Xp22.3. Puesto que hay dos cromosomas X y sólo uno tiene la
señal del gen de la esteroide-sulfatasa, este individuo es una
mujer portadora de la deficiencia genética de esteroide-
sulfatasa.
Éste es un ejemplo de la prueba de aneuploidía, donde a los
núcleos en interfase procedentes de células de fluido
amniótico se han añadido sondas de DNA diseñadas para los
cromosomas 13, 18, 21, X e Y. El núcleo de la izquierda se ha
hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21
(rojo). El núcleo de la derecha se ha hibridado con sondas para
los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que
hay dos señales correspondientes a las sondas de 13, 18 y 21, y
una sola señal de cromosomas X e Y, este feto es un varón y es
normal con respecto a la prueba de aneuploidía.
Esta otra prueba de aneuploidía muestra un feto femenino con
trisomía 21. El núcleo de la izquierda se ha hibridado con
sondas diseñadas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y
tiene claramente tres señales rojas. El núcleo de la derecha se
ha hibridado con sondas diseñadas para los cromosomas 18
(azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que muestra dos
señales verdes y ninguna roja, es femenino.
 TÉCNICAS DERIVADAS DE LA FISH
CONVENCIONAL
• Resuelven las carencias de las sondas “convencionales” y aportan una
mayor información que permite una completa caracterización del
cariotipo.
• Técnica de Hibridación Genómica Comparada (CGH, hoy prácticamente
sustituida por la técnica CGH-array), FISH-Multicolor (M-FISH), Spectral
Karyotyping (SKY) y Multibanding-FISH (M-BAND).
• Hay que tener en cuenta el elevado coste que supone realizar estos
análisis, la complejidad de la interpretación de los resultados, las
dificultades en la estandarización, el control de calidad y la necesidad de
personal especializado para el uso de unas técnicas que, en la mayoría de
los casos, no sustituyen a los estudios citogenéticos clásicos, sino que los
amplían y complementan.
 FISH MULTICOLOR
(M-FISH)
• Permite la visualización de todos los cromosomas de una misma metafase,
de forma simultánea, pintando cada pareja de cromosomas homólogos de
un color distinto, es decir, permite el análisis directo de todos los
cromosomas en un único experimento de FISH.
• Emplea simultáneamente un cóctel de 24 sondas de pintado cromosómico
que hibridan todos los cromosomas de una misma metafase, permitiendo
una rápida identificación de las 22 parejas homólogas de autosomas y los
cromosomas sexuales. Se obtiene un cariotipo en colores que permite
detectar y clasificar, de forma rápida, alteraciones numéricas y
estructurales intercromosómicas.
• Permite la rápida identificación de translocaciones e inserciones crípticas
y/o complejas, aneusomías y cromosomas marcadores.
 CARIOTIPO ESPECTRAL
• Es una técnica con una metodología similar a la M-FISH, teniendo ambas la misma resolución
(~1Mb). La diferencia entre ambas técnicas radica en el modo de adquisición y análisis de las
imágenes.
• Mientras la M-FISH utiliza filtros ópticos específicos para la captura de cada fluorocromo en
particular, el SKY, haciendo uso de un interferómetro, realiza una interpretación basándose en el
espectro píxel a píxel a lo largo de todo el cromosoma.
• La técnica de SKY requiere una única exposición a la luz fluorescente, la M-FISH requiere una
secuencia de imágenes, adquiridas mediante el cambio de los filtros ópticos específicos para cada
fluorocromo que, posteriormente, son alineadas de forma que coincidan en el espacio las
diferentes capturas.
• La principal desventaja del SKY, es que tras una única, pero larga exposición a la luz fluorescente
(aproximadamente 1 minuto), los fluorocromos pueden llegar a perder su intensidad.
• No permiten el reconocimiento de algunos puntos de rotura, como aquellos asociados con
deleciones, inserciones y translocaciones de pequeño tamaño (< 500-1.500 Kb), para los cuales es
necesario utilizar sondas locus específico (LSI).
FISH MULTIBANDAS
• El bandeo multicolor permite la diferenciación de
regiones cromosómicas específicas a nivel de
banda cromosómica.
• Se basa en ensayos individuales para cada par de
cromosomas homólogos, permitiendo detectar
inversiones y reorganizaciones intracromosómicas.
Cariotipo parcial: cromosoma 7 normal, dup
7p15 Múltiple BAND cromosoma 7. Se aprecia
que el cromosoma con la duplicación (derecha),
tiene repetidas las bandas verde y roja en su
brazo corto.
 OTRAS TÉCNICAS BASADAS EN LA FISH
• FISH multicolor centrómero específica (cenM-FISH) → utiliza una mezcla de sondas para visualizar
simultáneamente los centrómeros de cada pareja de cromosomas de un color distinto (excepto los de los
cromosomas 13 y 21). Detección de aneuploidías y para la identificación de cromosomas marcadores.
• FISH multicolor específica de brazos cromosómicos → se pintan de colores distintos los brazos p y q de los
cromosomas, a excepción del brazo p de los acrocéntricos y del cromosoma Y.
• FISH multicolor telómero específica (telM-FISH) → consigue el análisis simultáneo de todos los telómeros
tras una única hibridación multicolor.
• FISH multicolor específica de cromosomas acrocéntricos (AcroM-FISH) → Contiene una mezcla de sondas
centroméricas y de pintado cromosómico para todos los cromosomas acrocéntricos: 13/21, 14/22 y 15. Esta
técnica es capaz de identificar el 80% de los cromosomas marcadores.
• RX-FISH→ La técnica de “cross species color banding” (RxFISH) es similar a la M-FISH y al SKY, pero genera
un patrón de bandas de distintos colores para cada par de cromosomas homólogos. La ventaja que ofrece
respecto a la M-FISH y al SKY es que permite la identificación de alteraciones estructurales dentro de un
mismo cromosoma y que los puntos de rotura de los posibles reordenamientos pueden ser localizados con
mayor exactitud. Permite caracterizar cariotipos complejos y cromosomas marcadores no identificables
mediante citogenética convencional. Tiene la misma limitación que la M-FISH y el SKY, requiere la obtención
de células en división (metafases). Esta técnica no detecta alteraciones estructurales menores de 500-1.500
Kb.
 PROTOCOLO DE LA TÉCNICA DE FISH
• Varía dependiendo del tipo de muestra a procesar (sangre periférica,
médula ósea, líquido amniótico…), del tipo de sonda a utilizar y de si se
necesitan células en cultivo o se procesa la muestra directamente.
• El material celular que puede ser utilizado como diana depende de si es
una muestra postnatal, prenatal o preimplantacional.
• Las muestras postnatales incluyen: núcleos en metafase, núcleos en
interfase, sangre total, fibroblastos, médula ósea, espermatozoides,
raspado bucal, orina.
• Las muestras prenatales: amniocitos, vellosidades coriónicas, sangre de
cordón.
• Las muestras preimplantacionales: blastómeras.
 PROTOCOLO
• Preparación de las muestras.
• Sacrificio celular.
• Extensión.
• Preparación del portaobjetos.
• Hibridación.
• Lavado y montaje.
 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
• Se realizará un cultivo si necesitamos cromosomas metafásicos.
• Si la muestra no requiere haber pasado por un cultivo previo, se le
debe hacer un lavado previo con tampón de lavado o tampón de lisis
eritrocitaria o medio de lavado (medio basal con antibiótico), para
finalmente dejar la muestra resuspendida en PBS.
• Después se continuará directamente con el sacrificio celular.
 EXTENSIÓN
• Es importante conseguir una buena preparación, ya sea para estudiar
cromosomas (deben ser largos, bien extendidos y libres de restos
citoplasmáticos) o para estudiar interfases (densidad celular apropiada).
Por ello, y antes de realizar cualquier protocolo de hibridación, debe
evaluarse la calidad de la preparación observándola en el microscopio de
contraste de fases.
• Lavado adicional con fijador antes de la extensión, dejando el botón celular
en 1 ó 2 ml según la densidad del mismo.
• Extender 1 ó 2 gotas de la muestra con la micropipeta (si es para interfase)
o bien con pipeta Pasteur y a cierta distancia (si se necesitan metafases).
• Revisar a contraste de fases para mirar la calidad del extendido y densidad
celular, y hacer los ajustes apropiados.
PREPARACIÓN DEL PORTA
• Envejecer la preparación, ya que adquiere una
mayor resistencia a los tratamientos
enzimáticos. El envejecimiento se puede
realizar durante tres días a temperatura
ambiente, a 65°C durante 16-18 h. o a 90°C
durante 10´ (con el hibridizador).
• Lavado con 2xSSC (pH7,4) a 37°C durante 30-
60´.
• Se deshidrata la extensión en etanol 70%, 85%
y 100% durante un minuto en cada uno y se
deja secar la preparación.
• Si no se va a utilizar la preparación en ese
mismo momento se debe mantener a - 20°C
hasta su utilización.
• Si se va a utilizar en el momento se mete en el
hibridizador a 37°C durante 15 minutos.
 HIBRIDACIÓN
• Todo el proceso durante el cual se trabaja con la sonda debe realizarse en
oscuridad para no dañar la sonda.
• Dejar que la sonda y el tampón alcancen la temperatura ambiente y después dar
pulso en la microcentrífuga para recuperar todo el volumen.
• Se mezclan 1 µl de sonda, 7 µl de tampón y 2 µl de agua destilada. (El volumen
total de la sonda con la que se trabaja dependerá del tipo de sonda a utilizar).
• Se da un pulso en la microcentrífuga, para, de nuevo, recuperar todo el volumen.
• Se añade la sonda sobre el portaobjetos que contenga la muestra extendida. Se
debe sellar con un cubreobjetos y después con parafilm para colocar la
preparación en el hibridizador con un programa de hibridación: 75°C x 3 minutos
y 37°C x 24 horas (éste último paso puede hacerse en cámara húmeda en el
incubador).
 LAVADO Y MONTAJE
• Se retira con cuidado el parafilm y el cubreobjetos.
• Se realizan los lavados con el fin de eliminar la hibridación inespecífica y la
sonda sobrante:
- Lavar en solución 0.4xSSC/0.3% NP-40 a 73°C durante 2 minutos con
agitación.
- Lavado de 3 minutos en solución 2xSSC/0.1% NP-40 a Tª ambiente.
• Se deja secar la preparación, se añaden 10 µl de contratinción DAPI y se le
pone un cubreobjetos.
• Si no se va a analizar al microscopio en el momento se dejan las
preparaciones a -20°C.
• Analizar en microscopio de fluorescencia con los filtros recomendados.
 APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE FISH
• En pediatría: síndromes de microdeleción y microduplicación. Se conocen más de 100 de estos
síndromes.
• En diagnóstico prenatal: aneuploidías. Combinación de sondas locus específica de los
cromosomas 21,18,13, X e Y. Está siendo desplazada por la técnica QF-PCR que, además permite
descartar la contaminación materna.
• Diagnóstico preimplantacional: seleccionar embriones libres de una determinada anomalía
cromosómica.
• FISH de espermatozoides: detecta el porcentaje de espermatozoides con anomalías
cromosómicas.
• FISH en enfermedades oncohematológicas: detección de anomalías cromosómicas para el
diagnóstico y seguimiento de estas enfermedades.
• Inconvenientes: alto coste, inestabilidad de las sondas, necesario conocer previamente la región
alterada para utilizar las sondas correspondientes.
• La técnica de array-CGH aporta todas las ventajas de la FISH y no necesita saber qué región está
alterada.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN Y TRANSFERENCIA
DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN SOPORTE SÓLIDO
• La muestra de ADN diana se desnaturaliza por calor y se inserta en una
matriz sólida.
• Se añade la solución de hibridación con la sonda marcada.
• Finalizada la hibridación, se lava la membrana para eliminar la sonda no
unida y se detecta la sonda fijada a través del marcador.
• Técnicas:
- CGH (hibridación genómica comparada)
- Microarrays de ADN
- Southern blot.
- Northern blot.
CGH (HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA)
• Escanea el genoma completo, detecta cambios en el nº de copias del
ADN (ganancias y pérdidas) con una resolución de 5-20 Mb.
• Determinación del número de cromosomas y de fragmentos de los
mismos (ganancias/pérdidas) en tumores.
• Cromosomas metafásicos “normales” sobre los cuales hibrida el DNA
problema y un DNA de referencia, marcados ambos con fluoróforos
diferentes.
 CGH
• Normalmente se marca con rojo al ADN de referencia o control y con verde al ADN que
se está estudiando.
• Se realiza una hibridación competitiva entre los ADN de control y estudio sobre
metafases normales en presencia de ADN Cot 1 humano cuya función es suprimir las
secuencias repetitivas de ADN.
• Se realiza un análisis mediante un microscopio de fluorescencia cuantificando las
proporciones de colores verde y rojo en los cromosomas.
• En condiciones normales, como la cantidad de ADN rojo es igual a la cantidad de ADN
verde la reacción final será la obtención de cromosomas amarillos.
• Si se tiene una ganancia en el ADN de estudio, la proporción verde/rojo será mayor a 1
gracias a que la cantidad de ADN de estudio para hibridar supera a la de color rojo y por
lo tanto se expresa más el color verde.
• Si se tiene una pérdida ocurre lo contrario, teniendo una proporción menor a 1 y por
ésto se expresara más el color rojo.
Verde: Ganancia , Rojo: Pérdida, Amarillo : Normalidad
Ejemplo de idiograma CGH de un caso de DNA tumoral de un paciente. Los números en negrita
corresponden a cada uno de los cromosomas, y los números seguidos de la letra n corresponden al
número de veces que cada cromosoma específico ha sido analizado.
 TIPOS DE ARRAYS
• De diagnóstico genético → array-CGH, array-SNP, array CGH-SNP.
• De expresión → array de ARN.
• Proteínas → ISAC (Test de diagnóstico de la alergia).
• Oncohematológicos.
• Subtipos de array-CGH:
- Según su resolución → array-CGH 60 K, array-CGH 180K.
- Según su utilidad → prenatal, oncohematológico.
- Según el tipo de sondas → BAC (cromosoma artificial bacteriano),
oligonucleótidos…
 ARRAY-CGH
• Se basa en comparar el ADN del paciente con un ADN control (sin
alteraciones) con el objetivo de detectar ganancias (duplicaciones)
y/o pérdidas (deleciones) presentes en el paciente.
• Para ello tenemos un array en el que se disponen multitud de sondas
en una superficie sólida (porta). Dichas sondas son oligonucleótidos
de una longitud variable, cuya secuencia es complementaria a las
regiones de ADN que queremos estudiar.
• Como el array CGH “barre” todo el genoma, tendremos en ese porta
multitud de oligonucleótidos cada uno de ellos complementario a una
región del genoma, de tal forma que la suma de todos ellos nos dará
una idea de si existen ganancias/pérdidas en el genoma.
 ARRAY-CGH
• Marcaremos los ADN con sustancias fluorescentes: el ADN del paciente con
cianina Cy3 (verde) y el ADN control con cianina Cy5 (roja). De tal forma que al
añadir ambos ADN marcados (del paciente y del control) al array (que contiene
oligonucleótidos complementarios a ambos ADN), los ADN trataran de hibridar
competitivamente para unirse a su oligonucleótido complementario.
• Tras la hibridación veremos la intensidad de fluorescencia del ADN hibridado:
-Si la intensidad de color es amarilla (mezcla de verde y rojo)-> habrá la misma
intensidad de hibridación de ambos ADN -> NO HABRÁ ALTERACIÓN DEL
PACIENTE
-Si la intensidad de color es verde-> habrá más intensidad de hibridación del
ADN del paciente-> HABRÁ UNA GANANCIA EN EL PACIENTE (duplicación)
-Si la intensidad de color es roja-> habrá menos intensidad de hibridación del
ADN del paciente (más del ADN control) -> HABRÁ UNA PÉRDIDA EN EL
PACIENTE (deleción)
 PROTOCOLO ARRAY-CGH
• Extracción DNA muestra Sangre total-EDTA (400 µl)
• Amplificación de los ADN
• Marcaje de los ADN: el ADN del paciente con cianina Cy3 (verde) y el
ADN control con cianina Cy5 (roja).
• Hibridación competitiva de ambos ADN en el array
• Escaneado del array y medición de la intensidad de fluorescencia
• Transformación por el software del ordenador de la “foto” del array
con sus intensidades de fluorescencia, en los datos analizables por el
facultativo (mostrará las pérdidas/ganancias del paciente para
valoración por el facultativo).
 RESOLUCIÓN DEL ARRAY-CGH
• Cambio (ganancia/pérdida) más pequeño que se puede detectar.
• La capacidad o poder de resolución de un array para detectar la presencia de una
alteración en el número de copias de ADN en una muestra es directamente proporcional
al número de sondas que se incluyen en el microarray para la región del genoma que se
considere.
• En el diseño del array normalmente existe una gran densidad de sondas
(oligonucleótidos complementarios) para las regiones más específicas que se quieran
estudiar (zonas susceptibles de síndromes de microdeleción/microduplicación, genes
asociados a patología, etc) conocidas como Targeted regions y una menor densidad de
sondas para el resto de las regiones conocida como backbone.
• Las zonas con menor contenido en eucromatina tienen una menor presencia de sondas
(zonas pericentroméricas) y que los centrómeros y telómeros no tienen sondas.
• Según su resolución, los arrays pueden ser de 60K y 180K y pueden variar de unas casas
comerciales a otras.
 RESULTADOS ARRAY-CGH
• El análisis para mostrar si una región está alterada (duplicada o
delecionada) se basa en un análisis bioinformático con un software
dado por la casa comercial que se basa en una serie de condiciones
matemáticas, y que debe ser expresado en el informe.
• Posteriormente el facultativo responsable, de las alteraciones
mostradas por el programa, decidirá cuál debe informarse y cuál no,
así como su interpretación.
 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
• Las alteraciones detectadas se consideran variaciones en el nº de
copias y se clasifican según la ganancia o pérdida de material
cromosómico en duplicaciones o deleciones.
• Las CNV, según su interpretación clínica, se clasifican en:
-Benignas
-Inciertas: probablemente benignas, inciertas o probablemente
patológicas.
-Patológicas
 BASES DE DATOS PARA LA INTERPRETACIÓN
• ISCA Consortium: [Link]
• Database of Genetic Variants: [Link]/variation
• Decipher: [Link]
• ECARUCA:
[Link]
• UCSC Genome Browser: [Link]
• Ensembl: [Link]
• NCBI: [Link]
 Array CGH Pre-Natal (KaryoNIM 60K)

• Sistema de diagnóstico genético prenatal

diseñado para detectar, en una sola prueba, la
presencia o ausencia de alteraciones genéticas
y cromosómicas responsables de los 124
síndromes y enfermedades genéticas severos
y más frecuentes originados por trisomías,
aneuploidias, microdeleciones y
duplicaciones. Su resolución genética se sitúa
entre 50 y 100 veces mayor que el cariotipo de
bandas G. Se basa en un método de análisis
invasivo (amniocentesis, biopsia de
vellosidades coriales).
• El test KaryoNIM® Prenatal emplea una plataforma
que contiene 60.000 oligonucleótidos en un diseño
original propiedad de NIMGenetics. Esta
determinación se realiza a partir del ADN fetal de
amniocitos o vellosidades coriales, muestras
obtenidas mediante métodos de diagnótico
invasivo. KaryoNIM® Prenatal permite detectar
cualquier alteración genética que suponga una
pérdida (microdeleción, monosomía o nulisomía
cromosómica) o ganancia
(duplicación/amplificación, trisomía cromosómica)
de material genético con una resolución de, al
menos 275kb para todo el genoma y de 165kb en
regiones de especial interés clínico. Por tanto, este
test permite diagnosticar, en una sola prueba y en
aproximadamente 5 días, al menos 124 síndromes
genéticos severos que comprometen la salud fetal.
Entre los síndromes se incluyen, por supuesto, las
trisomías que afectan a todos los cromosomas
(Síndromes de Down, Edwards, Patau, Turner,
Klinefelter,etc…). Además el test KaryoNIM®
Prenatal incluye otros síndromes genéticos severos
conocidos relacionados, como microdeleciones y
duplicaciones (Digeorge, Cri-du-chat, etc…). Por su
diseño y su resolución, este test mejora entre 50 y
100 veces la resolución del cariotipo convencional y
supone una aproximación más amplia y completa
que las técnicas habituales como FISH y MLPA.
 VENTAJAS DEL ARRAY-CGH
• Mayor resolución que el cariotipo o la FISH.
• Empleo de ADN: sangre, saliva, otro tipo de fluidos, tejidos sólidos, cultivos
celulares, material fijado para estudios citogenéticos o parafinas, entre
otros muchos.
• Datos más objetivos.
• Reproducibilidad.
• Mayor rendimiento diagnóstico.
• No se necesita cultivo celular: mosaicismos (cuando se detectan) más
“reales” en cuanto a proporción.
• Obtención de gran cantidad de información en poco tiempo: 48-72 h
• Versatilidad: diseño según utilidad clínica.
 LIMITACIONES DEL ARRAY-CGH
• No se suelen detectar mosaicismos de bajo grado <20-30%.
• Solo detecta cambios de dosis génica y no detecta translocaciones cromosómicas
u otros reordenamientos equilibrados como las inversiones.
• No detecta poliploidías, ya que son cambios globales de material genético,
indetectables debido al sistema de normalización de sondas.
• La cantidad de ADN necesaria para realizar un array-CGH es superior a la
necesaria para otras técnicas moleculares (como PCR por ejemplo), y la calidad
del mismo debe ser adecuada (no contener proteínas ni fenoles, no estar
fragmentado,etc.)
• Pueden descubrir un gran número de CNV, sin impacto clínico claro, que pueden
dificultar el análisis y/o la interpretación de los resultados.
• No marca CE/IVD: los resultados deben ser confirmados.
• ↑Coste: aunque cada vez es menor.
 APLICACIÓN CLÍNICA DEL ARRAY-CGH
• Primera aproximación diagnóstica en:
• Niños con discapacidad intelectual
• Niños con anomalías congénitas múltiples, o cuadros
polimalformativos, o rasgos dismórficos
• Pacientes con talla baja
• Fetos con anormalidades ecográficas
• Restos abortivos
• Sospecha de síndrome genético concreto
• Trastornos Generalizados del Desarrollo
• Gran información en:
• Pacientes con trastornos de la fertilidad, esterilidad y/o con abortos
frecuentes
• Niños/as con trastorno del espectro autista y/o déficit de atención
(array CGH 180K)
• Oncohematología (array CGH oncohematología) en: síndromes
mielodisplásicos con cariotipo normal, pacientes jóvenes con linfomas
o leucemias, linfomas no filiados, etc.
• Otros tipos de cáncer (array CGH oncohematología)
• Diagnóstico preimplantacional (array DGP)
 SOUTHERN BLOT
• Se parte de ADN aislado del tejido de la > calidad posible.
• Consiste en localizar secuencias de ADN en fragmentos de restricción,
separados por electroforesis en geles de agarosa, desnaturalizados para
obtener fragmentos de cadena sencilla que puedan ser transferidos a una
membrana de nitrocelulosa sobre la que quedan inmovilizados.
• El ADN queda atrapado en la nitrocelulosa y así se puede hibridar con la
sonda radiactiva o colorimétrica.
• Cada secuencia complementaria da lugar a una banda marcada que
adquiere una posición determinada por el tamaño del fragmento de ADN.
• La reacción se puede detectar por autorradiografía.
 PASOS DE LA TÉCNICA DE SOUTHERN BLOT
• Digestión del ADN con E de restricción.
• Separación electroforética en gel de agarosa o poliacrilamida de los
fragmentos hidrolizados de ADN → migran hacia el polo + debido a las
cargas – de los grupos ℗. La v de migración depende de su tamaño.
• Desnaturalización → para obtener fragmentos de cadena sencilla que
puedan ser transferidos a una membrana y sean accesibles a la sonda (se
hidrolizan parcialmente, se desnaturaliza con una base fuerte como NaOH
y se trata con una solución de neutralización)
• Transferencia de los fragmentos de ADN a membrana → el ADN
monocatenario se transfiere a un soporte absorbente (nitrocelulosa o
membrana de nailon), realizando así una copia que conserva la distribución
espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel en la
electroforesis.
• Hibridación → se fija el ADN a la membrana por calor o por
exposición a luz UV. Se incuba en una disolución que contiene la
sonda radiactiva marcada con 14C o 32P. Se produce la hibridación. Se
lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad
sea la asociada al ADN diana.
• Detección → la membrana se coloca junto a una película de rayos X
dentro de una caja que la aísle de la luz. La película registra las
posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y
el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación se
conoce como autorradiografía.
La autorradiografía de la derecha muestra los resultados de un análisis
de huella dactilar de ADN, con una sonda de locus único, aplicado a un
varón, una mujer y sus cuatro hijos/as. ¿Cuál de los hijos/as es el que
con menor probabilidad desciende de esta pareja?
 Este era un problema delicado. Si el hijo/a
nº2 es descendiente de este varón y esta
mujer, debe tener una banda de cada uno de
ellos. Sin embargo, el hijo nº2 parece
compartir dos bandas con la madre y ninguna
con el "padre". Por supuesto, la madre no
puede haber aportado ambas bandas (alelos)
a un hijo/a suyo.

Cada hijo/a recibe una banda de su madre y otra de su

padre. El primer paso para interpretar esta autorradiografía
es identificar qué bandas proporcionó la madre. Luego se
pueden comparar las bandas restantes con las del supuesto
padre, para determinar si se le incluye o se le excluye.
Hay varias explicaciones posibles para este patrón de bandas:
- La banda aportada por el padre biológico coincide por casualidad con
una de las bandas de la madre.
- El hijo/a nº2 es en realidad hermano/a de la "madre".
- Se cometió un error al aplicar las muestras de ADN al gel, de modo
que en la calle 2 se cargó el ADN de la madre.
La figura muestra los resultados del análisis de huella dactilar
de ADN, con una sonda de locus único, para un varón y sus
cuatro hijos/as. ¿Qué calle contiene el ADN del padre?
 La calle 3 es la única que comparte una banda con
cada una de las otras calles.
Los 4 alelos que aparecen en esta autorradiografía se
han rotulado como A, B, C y D. Observe las bandas en
las calles 2 y 5. La calle 2 contiene los alelos C y D,
mientra que la calle 5 contiene los alelos A y B. Puesto
que ambas calles no comparten ninguna banda,
ninguna de ellas puede contener el ADN del padre.
Recuerde que cada hijo comparte una banda con el
padre y otra con la madre, cuyo ADN no está en esta
autorradiografía.

Observe las bandas de las calles 1 y 4. De nuevo, no tienen alelos

correspondientes, por lo que estas calles no pueden contener el ADN del padre.
Tenga en cuenta que los hermanos/as no heredan necesariamente los mismos
alelos de sus progenitores y habitualmente tendrán perfiles de ADN diferentes
entre sí.
 NORTHERN BLOT
• Variante del southern blot, aplicado a ARN.
• No necesita tratamiento con E de restricción porque los ARN tienen
un tamaño pequeño.
• El ARN se degrada fácilmente, todas las manipulaciones se deben
realizar rápidamente y evitando el contacto de la muestra con
ARNasas (manos).
• Se detecta amplificación de expresión génica y es parcialmente
cuantitativa.
 FICTION
• Combina el marcado inmunofenotípico fluorescente y la técnica de FISH.
• Selecciona una determinada población celular tumoral de acuerdo con un
marcador inmunofenotípico y estudia sus alteraciones genéticas.
• Primero se realiza una detección inmunofenotípica usando una cascada de 3 Ac
secundarios marcados con un mismo fluorocromo para detectar la unión de un
Ac primario.
• Fijación para que no se elimine el marcado durante la hibridación de la sonda.
• Se realiza la técnica de FISH.
• Con el m.o de fluorescencia se seleccionan las células + y se analizan en ellas las
señales de hibridación comparándolas con las células -, en las que el patrón de
hibridación debe ser normal.
• Estudio de biopsias tumorales con baja concentración de células neoplásicas. Las
células tumorales son seleccionadas con los Ac y estudiadas con FISH.