UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUÍMICA
LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA
CROMATOGRAFÍA
Ramirez,C.V.1, Gutierrez, J.D.2, Avila L.M.3
Programa de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ciencias básicas e ingeniería
Universidad de los llanos, Villavicencio, Colombia
RESUMEN Palabras clave: cromatografía en capa fina,
separación, fase móvil, fase estacionaria, distancia.
La cromatografía en capa fina es una técnica de
separación de mezclas que se utiliza comúnmente INTRODUCCIÓN
en los laboratorios químicos. Durante la práctica de
cromatografía en capa fina, se preparó una solución La cromatografía es una técnica de separación
de muestra y se aplicó en una placa de vidrio muy común en el laboratorio de química orgánica.
recubierta con una capa delgada de una sustancia Consiste en separar los componentes de una
adsorbente, (sílica gel). mezcla utilizando la diferencia en sus propiedades
La placa se colocó en una cámara de desarrollo físico-químicas, como la solubilidad en un solvente
que contiene una fase móvil, como un solvente o la afinidad por una fase estacionaria.
orgánico. A medida que la fase móvil se movía a
Existen distintos tipos de cromatografía, como la
través de la placa, los componentes de la muestra
cromatografía en capa fina, la cromatografía líquida
se separaron y se desplazaron hacia arriba con la
de alta resolución, la cromatografía de gases, entre
fase móvil, en diferentes velocidades, debido a sus
otras. En general, todas estas técnicas comparten
diferentes afinidades con la fase estacionaria. Una
el mismo principio básico: la muestra se coloca en
vez que la fase móvil se movió a una distancia
una fase móvil, que se mueve a través de una fase
adecuada, se retiró la placa de la cámara y se dejó
estacionaria. Los componentes de la muestra se
secar para luego ver la separación de los
separan a medida que interactúan de manera
componentes de la muestra mediante la técnica de
diferente con la fase móvil y la fase estacionaria.
visualización del cromatograma. Al obtener los
resultados se observó que estos se presentaron en En el laboratorio de química orgánica, la
forma de manchas o bandas en la placa. Cada cromatografía se utiliza para separar y purificar
mancha o banda representó un compuesto compuestos orgánicos, identificar mezclas
separado de la mezcla original. La posición de cada desconocidas, y determinar la pureza de los
mancha en la placa se relaciono con la afinidad del productos sintetizados. Además, es una técnica
compuesto por el material absorbente utilizado en la muy útil para la caracterización de compuestos, ya
placa y la polaridad del disolvente utilizado para la que permite obtener información sobre su
elución. estructura, polaridad y afinidad por distintos tipos
de fases estacionarias y móviles.
1
Esta práctica tiene como objetivo comprender los evitando que el disolvente toque las manchas. Se
principios de la cromatografía, aplicar la dejó ascender hasta 0,5 cm del borde superior,
cromatografía en capa delgada en la separación de luego se sacó y se dejó secar la placa; primero se
compuestos orgánicos, reconocer la relación entre reveló con luz natural y segundo con luz
la polaridad del disolvente, la polaridad de la ultravioleta.
muestra y la fase estacionaria y por último emplear
la cromatografía de adsorción en la identificación Se repitió el mismo procedimiento utilizando
de compuestos orgánicos. diferentes disolventes o mezclas de disolventes por
cada cámara de cromatografía, para obtener la
mejor separación de los componentes de la
MATERIALES Y MÉTODOS mezcla.
Los materiales utilizados en esta práctica fueron:
● Tubos de ensayo DISCUSIÓN DE RESULTADOS
● Gradilla para tubos de ensayo
● Capilares
● Placas de cromatografía Tabla 1. Cantidad de mL de fase móvil
● Cámara de cromatografía
● Cámara de luz U.V
Reactivos:
● Cámara de yodo
● Azul de bromotimol al 1% en etanol
● p- nitrofenol al 1 % en etanol Muestra 1= Nitrofenol
● Mezcla 1:1 azul de bromotimol y p-nitrofenol
● ácido benzoico Muestra 2= Azul de bromotil
● Azul de metileno
● Mezcla ácido benzoico y azul de metileno Muestra 3= Nitrofenol + azul de bromotil
● Acetato de etilo
Muestra 4= Azul de metileno
● Tolueno
● Hexano Muestra 5= Ácido benzoico
● Cloroformo
● éter etílico Muestra 6= Azul de metileno + Ácido benzoico
● éter de petróleo
La relación entre las distancias recorridas por el
● Metanol
soluto y por el eluyente desde el origen de la placa
se conoce como Rf, y tiene un valor constante para
Metodología
cada compuesto en unas condiciones
Sobre un papel cuadriculado se colocó la placa cromatográficas determinadas. Debido a que es
preparada y se tomó las medidas para la aplicación prácticamente imposible reproducir exactamente
de cada gota, luego se aplicó con un microcapilar las condiciones experimentales, la comparación de
una gota de la solución de alguno de los una muestra con otra debe realizarse eluyendo
componentes puros, después se dejó evaporando ambas en la misma placa.
el disolvente y se repitio la aplicación 5 veces más
Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresión:
con las demás muestras en la misma placa.
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐴
Después se dejó secar y se introdujo en la cámara 𝑅𝑓 = 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐵
de cromatografía que contiene el disolvente,
2
Ec. 1 𝑅𝑓 =
1,6 𝑐𝑚
= 0, 23 𝑐𝑚
7 𝑐𝑚
B: Distancia desde el punto de aplicación al frente
Existe una diferencia en la afinidad de cada
del disolvente
componente de la mezcla por la fase estacionaria y
A: Distancia desde el punto de aplicación al centro la fase móvil (el tolueno+cloroformo). En este caso,
de la mancha el nitrofenol+ azul de bromotil tiene una afinidad
mayor por la fase móvil, lo que lo hace desplazarse
El valor del Rf puede variar dependiendo de varios más rápido en la dirección de la corriente de la
factores, como por ejemplo el tipo de matriz de mezcla.
cromatografía, la composición del solvente, la
polaridad del compuesto, la temperatura, entre Ensayo 2: Asciende el ácido benzoico
otros. Es importante tener en cuenta que el Rf solo
B: 7 cm
es útil para comparar la movilidad relativa de
diferentes compuestos en una misma matriz de A: 4,5 cm
cromatografía
4,5 𝑐𝑚
𝑅𝑓 = 7 𝑐𝑚
= 0, 64 𝑐𝑚
● Grupo 1 El ácido benzoico se desplazó en una mezcla de
tolueno y cloroformo en cromatografía de capa fina
Teniendo en cuenta la Ec. 1 y la tabla 1 para el debido a las diferencias en las afinidades de sus
ensayo número 1 se tiene que: componentes por la fase móvil y la fase
estacionaria. En este caso la fase móvil fue la
Ensayo 1: Se desplazó la M1(Nitrofenol) y mezcla de tolueno y cloroformo, y la fase
M3(nitrofenol + azul de bromotil) estacionaria fue la capa fina de un material poroso
como la sílica gel.
M1
B: 7 cm
● Grupo 2
A: 2,1 cm
2,1 𝑐𝑚 Ensayo 3: Se desplazó la M2 (azul de bromotimol)
𝑅𝑓 = 7 𝑐𝑚
= 0, 3 𝑐𝑚
B: 5,5 cm
Esto se debe a que el nitrofenol es un compuesto
polar, lo que significa que tiene una carga parcial A: 2,7 cm
positiva y una carga parcial negativa en diferentes 2,7 𝑐𝑚
partes de su estructura molecular. La matriz de 𝑅𝑓 = 5,5 𝑐𝑚
= 0, 5 𝑐𝑚
cromatografía que se utiliza en este caso, como el
sílica gel, es polar y, por lo tanto, atrajo a los El azul de bromotil es un compuesto polar y soluble
compuestos polares. Por otro lado, el tolueno es un en solventes orgánicos como el cloroformo y el éter
solvente no polar, lo que significa que tiene una etílico. En este caso el azul de bromotimol se
baja polaridad y no interactúa fuertemente con los disolvió y se arrastró fácilmente a través de la fase
compuestos polares. estacionaria.
M3 Ensayo 4: Se desplazó la M1(Nitrofenol) y
M3(nitrofenol + azul de bromotil)
B: 7 cm
B: 5 cm
A: 1,6 cm
A: 2,5 cm
3
𝑅𝑓 =
2,5 𝑐𝑚
= 0, 5 𝑐𝑚 A: 6,9 cm
5 𝑐𝑚
6,9 𝑐𝑚
El cloroformo es un solvente altamente no polar, 𝑅𝑓 = 7 𝑐𝑚
= 0, 1 𝑐𝑚
mientras que el éter etílico es un solvente
moderadamente polar. Por lo tanto, los compuestos El azul de bromotil tiene una mayor afinidad por el
con mayores polaridades, como el nitrófenol y el metanol que por la fase estacionaria que se utiliza
nitrófenol más azul de bromotil, tendrán una mayor para separar los componentes de una muestra.
afinidad por la fase móvil (éter etílico) y se Como resultado, se mueve más fácilmente a través
desplazarán más hacia la zona de mayor polaridad del solvente y se separa más rápidamente en la
en la placa. cromatografía de capa fina.
M3(nitrofenol + azul de bromotil)
● Grupo 3 B: 7 cm
Ensayo 5: se desplazó la M5( Azul de metileno) A: 6,9 cm
6,9 𝑐𝑚
B: 7 cm 𝑅𝑓 = 7 𝑐𝑚
= 0, 1 𝑐𝑚
A: 1,3 cm Se desplazó debido a las diferentes afinidades
1,3 𝑐𝑚
químicas de los compuestos por el solvente y la
𝑅𝑓 = 7 𝑐𝑚
= 0, 2 𝑐𝑚 fase estacionaria utilizada en el experimento. El
nitrofenol es más polar y tiene una mayor afinidad
En una mezcla de tolueno y éter etílico, el azul de por la fase estacionaria que por el metanol,
metileno se desplazó hacia la parte superior de la mientras que el azul de bromotil es menos polar y
placa de TLC porque la polaridad de la mezcla de tiene una mayor afinidad por el metanol que por la
disolventes es intermedia, lo que permite una fase estacionaria.
pequeña polaridad de la capa estacionaria.
Ensayo 6: Se desplazó la M1(Nitrofenol), M2 (azul
de bromotimol) y M3(nitrofenol + azul de bromotil) ● Grupo 4
M1( Nitrofenol) Ensayo 7: ascendió la muestra 3(nitrofenol + azul
de bromotil) 5 (ácido benzoico) y 6 (azul de
B: 7 cm metileno + ácido benzoico)
A: 6,9 cm M3: nitrofenol + azul de bromotil
6,9 𝑐𝑚
𝑅𝑓 = 7 𝑐𝑚
= 0, 1 𝑐𝑚 B:7 cm
El metanol es un solvente polar que tiene una A: 3,5 cm
buena capacidad para disolver sustancias polares 3,5 𝑐𝑚
como el nitrofenol. En la cromatografía de capa 𝑅𝑓 = 7 𝑐𝑚
= 0, 5 𝑐𝑚
fina, la mezcla de muestra se colocó en el punto de
partida de la placa y se desplazó hacia arriba M5: ácido benzoico
mediante la acción capilar de los solventes móviles B: 0,2 cm
(como el metanol).
A: 0,1 cm
M2 (azul de bromotimol)
0,1 𝑐𝑚
𝑅𝑓 = = 0, 5 𝑐𝑚
B: 7 cm 0,2 𝑐𝑚
4
M6: Azul de metileno + ácido benzoico Ensayo 9: No hubo movimiento de ninguna
muestra
B: 0,1 cm
Ensayo 10: Se desplazaron todas las muestras
A: 0,05 cm con una misma distancia por ende el Rf de las 6
0,05 𝑐𝑚 muestras es igual
𝑅𝑓 = 0,1 𝑐𝑚
= 0, 5 𝑐𝑚
B: 5,3 cm
El nitrofenol más azul de bromotil, el ácido
benzoico y el azul de metileno son compuestos A: 5 cm
polares, lo que significa que tienen una tendencia a 5 𝑐𝑚
interactuar con los solventes polares como el 𝑅𝑓 = 5,3 𝑐𝑚
= 0, 94 𝑐𝑚
metanol y el acetato de etilo. En una mezcla de
solventes como esta, es posible que estos
compuestos polares se disuelven más fácilmente, Todas las muestras presentan una alta polaridad.
lo que podría contribuir a su desplazamiento.
Ensayo 8: se desplazó la muestra 1( Nitrofenol)
ASPECTOS COMPLEMENTARIOS
y Muestra 6 (Azul de metileno + Ácido benzoico)
➔ ¿Cuál es el disolvente o mezcla de
M1: Nitrofenol disolventes más adecuado para la
B: 6,8 cm separación de la mezcla azul de bromotimol
y p-nitrofenol?
A: 3,4 cm
En este caso, se puede utilizar una mezcla de
𝑅𝑓 =
3,4 𝑐𝑚
= 0, 5 𝑐𝑚 disolventes como cloroformo y metanol en
6,8 𝑐𝑚
proporciones adecuadas. El cloroformo es un
M2: Azul de metileno + Ácido benzoico disolvente no polar, mientras que el metanol es un
disolvente polar. La mezcla de ambos disolventes
B: 1,2 cm permite separar los compuestos de la mezcla en
función de sus polaridades y solubilidades.
A: 0,6 cm
0,6 𝑐𝑚
El bromotimol es un compuesto más polar y soluble
𝑅𝑓 = 1,2 𝑐𝑚
= 0, 5 𝑐𝑚 en metanol, mientras que el p-nitrofenol es menos
polar y soluble en cloroformo. Al mezclar ambos
La mezcla de acetato de etilo y éter de petróleo se disolventes, se puede obtener una separación
utiliza para separar y purificar compuestos adecuada de los compuestos.
orgánicos polar e intermedios debido a las
diferentes polaridades de los solventes y los ➔ ¿Cuál es el disolvente o mezcla de
compuestos. disolventes más adecuado para la
separación de la mezcla ácido benzoico y
En este caso el acetato de etilo es un solvente con azul de metileno?
polaridad intermedia, el nitrofenol es un compuesto
polar y la mezcla de azul de metileno y ácido En este caso, se puede utilizar una mezcla de
benzoico también es polar. disolventes como diclorometano y agua en
proporciones adecuadas. El diclorometano es un
disolvente orgánico no polar y el agua es un
disolvente polar. La mezcla de ambos disolventes
● Grupo 5
5
permite separar los compuestos de la mezcla en La cromatografía de interacción hidrofóbica es uno
función de sus polaridades y solubilidades. de los métodos de purificación de macromoléculas
biológicas más utilizado, especialmente para
El ácido benzoico es más polar y soluble en agua, proteínas terapéuticas.
mientras que el azul de metileno es menos polar y
soluble en diclorometano. Al mezclar ambos La cromatografía de fase reversa describe un tipo
disolventes, se puede obtener una separación de cromatografía en la cual la fase estacionaria es
adecuada de los compuestos. menos polar que la fase móvil.
➔ ¿Cuál es el comportamiento de la elución
de los diferentes compuestos con relación a CONCLUSIONES
los disolventes empleados?
● Por medio de esta práctica se logró
El comportamiento de la elución de los diferentes reconocer los principios de la
compuestos en una cromatografía depende en cromatografía, estos se basan
gran medida del disolvente o mezcla de disolventes principalmente en la separación de dos o
empleados como fase móvil. En general, los más compuestos los cuales tienen
compuestos con mayor polaridad y solubilidad en propiedades físicas diferentes, así que se
el disolvente son eluidos más lentamente, mientras dividen en 2 fases, una móvil y otra
que los compuestos con menor polaridad y estacionaria.
solubilidad son eluidos más rápidamente. ● Se realizó el procedimiento de
cromatografía en capa fina, identificando
➔ Si no se obtiene separación de la mezcla, que los componentes de la muestra se
explique posibles causas de dicho separaron y se movieron hacia arriba con la
comportamiento. fase móvil, en diferentes velocidades,
Las posibles causas de este son la elección debido a sus diferentes afinidades con la
inadecuada del método de separación,Carga de fase estacionaria.
muestra excesiva, Columna o placa de ● Se determinó que la cromatografía en capa
cromatografía defectuosas, alguna de las fases fina es una técnica útil y versátil para
inadecuadas o un mal procedimiento separar y analizar una amplia variedad de
cromatográfico. compuestos orgánicos. Esta técnica es fácil
de realizar, económica y proporciona
➔ Consultar otras aplicaciones de la resultados precisos y reproducibles.
cromatografía en su campo de estudio.
La cromatografía de exclusión molecular es el REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
nombre general para los procesos de separación
de biomoléculas de acuerdo a su tamaño cuando Rahman, N., Ullah, R., Rahman, N., & Khan, A.
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[Link]
sci_arttext&pid=S1665-2738201200030000
6
Imagen 3. Revelación de placas con luz ultra
violeta UV
ANEXOS
Imagen 1. Placas con las muestras introducidas en
la cámara de cromatografía.
Imagen 2. Placas en proceso de evaporación.
