Cuaderno de prácticas: Métodos e Instrumentación de Laboratorio - 1º Grado en Biología

Área de Fisiología Vegetal

PRÁCTICA 9. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS HISTOLÓGICAS

ANIMALES Y VEGETALES (I).

Tejidos vivos, utilización de colorantes vitales y observación al microscopio óptico

1.- Introducción:
1

Se denominan técnicas histológicas al conjunto de procesos a los que se somete una muestra biológica
para su observación con el microscopio, bien sea óptico o electrónico.

Las técnicas histológicas se pueden clasificar en aquellas que se dirigen hacia la observación de células
vivas y aquellas que se dirigen a la observación de células muertas.

o La observación vital consiste en el estudio directo de las células vivas. Se utiliza para estudiar
microorganismos, cultivos celulares y células disociadas de un tejido blando. Estas muestras se
conservan en condiciones fisiológicas (Ej. suero salino fisiológico) y se utilizan microscopios
específicos para su observación. Para su observación en algunos tipos de microscopios ópticos se
utilizan colorantes vitales (soluciones muy diluidas que son capaces de teñir la célula y permitir su
supervivencia durante un cierto tiempo). Ej. Azul de Metileno o Rojo Neutro. Los colorantes vitales
se preparan con agua y/o alcohol.
o Las técnicas histológicas post-vitales son aquellas en las que las células mueren durante el proceso,
pero las características morfológicas y moleculares que poseían en estado vivo se conservan lo mejor
posible, lo que depende del tipo de técnica empleada. Estos procesos (Fijación, Inclusión, Microtomía,
Tinción y Montaje) se explican en la práctica nº 10 y en el tema 7.

2. Objetivos:

- Visualizar varios tipos de tejidos vivos.

- Utilización de colorantes vitales.
- Observación de preparaciones al microscopio óptico.

3. Material necesario:

- Tejidos animales y vegetales diferentes

- Vasos de precipitado
- Vidrios de reloj
- Pinzas de madera
- Mechero
- Bisturí o tijeras
- Pinzas
- Papel de filtro
- Frascos lavadores
- Portaobjetos limpios
- Cubreobjetos limpios
- Liquido de montaje
- Bandeja con soporte para tinción de varios portas
- Colorantes: Verde Janus, Rojo neutro, Orceína acética A y B
- Microscopio óptico
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4. Descripción del microscopio óptico:

En general, se llama microscopio (del griego mikros=pequeño y skopein=examinar) a todo instrumento

óptico capaz de producir imágenes ampliadas de objetos pequeños. El microscopio óptico consta de una
parte óptica (sistema de lentes), una parte mecánica y un sistema de iluminación.

- Parte mecánica del microscopio 2

Estativo: Es el conjunto de piezas que sostienen y estabilizan el resto de elementos. Se suele dividir en
tres partes: i) el pie o base, sobre el que se sitúa el sistema de iluminación, ii) brazo, que es la parte por
donde se coge el microscopio y iii) cabezal (o tubo de observación) donde se sitúan los oculares y el
revolver portaobjetivos.

Anillos de enfoque: Macrométrico, para un ajuste grosero del foco, y micrométrico, para un ajuste fino
del foco.

Revolver portaobjetivos: Estructura circular giratoria donde se sitúan los objetivos ordenados de menor
a mayor aumento. También puede llevar asociados huecos para colocar filtros.

Platina: Plataforma donde se encuentra el portaobjetos de la muestra. Es una pieza rectangular con un
orificio central para permitir el paso de la luz. Está provista de una pinza para la sujeción del portaobjetos.
Puede ser móvil en un plano (XY), por lo que puede tener asociado dos mandos que permitan el
movimiento (perillas coaxiales del movimiento de la platina). En la platina hay 2 escalas graduadas, para
facilitar la localización de posiciones determinadas de la preparación. La platina puede ser circular y tener
una graduación en grados, lo cual es muy útil cuando se trabaja con luz polarizada en microscopios
petrográficos.
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Partes del sistema de lentes:

Ocular: Parte del sistema de lentes que se encuentra acopladas en la parte superior del tubo del
microscopio, ampliando la imagen que ha sido previamente aumentada mediante el objetivo. Es a través
del ocular que el usuario observa la muestra. En función del número de oculares se puede distinguir entre
microscopios monoculares, binoculares e incluso trinoculares. La combinación de objetivo y ocular
determina el aumento total del microscopio. Los oculares pueden separarse o acercarse según sea la 3
distancia interpupilar del observador. Además, cada tubo porta ocular puede graduarse según la visión.

Objetivo: Es un cilindro que contiene una o más lentes de vidrio, cuya función es captar la luz procedente
de la muestra. Los objetivos de los microscopios se sitúan en el revólver y se caracterizan por dos
parámetros fundamentales: el número de aumentos (o magnificación) y la apertura numérica. Además
existen otros parámetros que deben tenerse en cuenta como se indican en la imagen de abajo.

Partes del sistema de iluminación:

Condensador: Se encuentra debajo de la platina y está formado por una o un conjunto de lentes que
condensan el haz luminoso sobre la muestra. En el condensador se colocan la mayoría de elementos que
se interponen o filtran la luz con el fin de conseguir un contraste de la muestra. Dependiendo de los
elementos que se interponen obtenemos los distintos tipos de microscopía óptica.

Diafragma: Se suele encontrar asociado al condensador y regula la entrada de luz a la muestra al cerrarse
o abrirse unas piezas móviles (iris), de tal manera que el haz luminoso tiene mayor o menor diámetro.
Este sistema permite modificar la profundidad de campo de la muestra, es decir que el grosor de enfoque
(eje Z) sea mayor o menor. También existe un diafragma en el cuerpo del estativo interpuesto a la fuente
de luz, con el que se controla la cantidad de luz que llega al diafragma.

Fuente de luz o lámpara.

5. Cómo utilizar un microscopio óptico. Normas de manejo.

1.- Quitar la funda y enchufar el microscopio a la red.

2.- Colocar la preparación en la platina con el cubreobjetos hacia arriba y situar la muestra sobre la
fuente de luz.

3.- Poner el objetivo de x4 aumentos.

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4. Subir la preparación hasta el máximo sin mirar aún por los oculares (usar el macrométrico).

5. Ir bajando poco a poco para conseguir enfocar. Primero con el tornillo macrométrico hasta
obtener una imagen borrosa y luego con el tornillo micrométrico hasta que se vea nítida.

4
6.- Calcular la distancia interpupilar. Para ello acercar o alejar con ambas manos los tubos porta
oculares hasta ver una sola imagen.

7.- Subir el condensador al máximo. Ajustar por medio del diafragma la abertura del condensador a
la abertura del objetivo. Esto se consigue cerrando el diafragma paulatinamente hasta que se aprecia
una disminución en la intensidad de la luz.

8.- Con el objetivo más pequeño recorrer la preparación y estudiar las distintas partes de la misma.

9.- Cambiar de objetivo para estudiar una estructura a más aumentos. Para cambiar de objetivo hay
que tener siempre enfocado en el objetivo anterior. Al pasar al siguiente objetivo bastará un pequeño
desplazamiento del tornillo micrométrico para que la imagen quede enfocada.

10.- Una vez estudiada la preparación con el objetivo de x10, pasamos al de x40, y luego al de x100,
para ello mover el revólver de modo que la preparación quede entre los objetivos de x40 y de x100.
Poner sobre la preparación una “gota de aceite de inmersión” y pasar directamente al objetivo de
x100. Moverlo ligeramente hacia uno y otro lado a fin de extender la gota y dejarlo en su sitio. El
objetivo no debe de tocar la preparación. Si la imagen aparece un poco borrosa, bastará con un
pequeño desplazamiento con el tornillo micrométrico y la imagen se observará nítida.

11.-Cuando se termine la observación, pasar directamente al objetivo de x4 y limpiar el objetivo de

inmersión y la preparación con un paño suave humedecido en alcohol.

12.- Para sacar una preparación siempre colocar el objetivo más pequeño. Si hay que observar otra
preparación empezar siempre por el objetivo de menor aumento.

13.- Mover el microscopio lo menos posible y no desplazar el soporte de binoculares. No tocar

nunca las lentes y si algo no funciona comunicarlo al profesor.

14.- Al terminar la práctica, el microscopio debe de dejarse limpio, con el objetivo más pequeño en
posición, la luz apagada, desenchufado y con la funda puesta.

6. Visualización a microscopio óptico de tejidos vivos

6.1 ESTUDIO DE MICROORGANISMOS EN AGUA ENCHARCADA

En un recipiente se depositan hojas, ramas y agua de una charca y se deja durante una semana a
temperatura ambiente (20-25ºC). Al cabo de este tiempo se desarrollan numerosos microorganismos que
podemos observar.
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Entre los protozoos, los más frecuentes son:

- Rizópodos: diferentes especies de amebas

- Ciliados: Paramecium, Colpoda, Stylonychia, Vorticella, Stentor, etc.
- Flagelados: Bodo, Monas, etc.

Además es probable que aparezcan crustáceos (Cyclops, Cypris, etc.), rotíferos, nematodos, larvas de 5
insectos, etc. Entre los vegetales suelen aparecer algas (Zignema, Closterium, Volvox, y Euglena).

a. Observación directa

Con una pipeta se toman muestras de agua en diferentes niveles y se deposita una gota en un portaobjetos
limpio. Se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio. Cerrar el diafragma para tener más
contraste. Observar con ayuda del guión de prácticas los distintos microorganismos. Observar su tipo de
movimiento, presencia de vacuolas, cloroplastos, etc.

b. Coloración vital

En un portaobjetos limpio se deposita una gota del agua encharcada y se coloca un cubreobjetos sobre
ella. En el borde del cubreobjetos se añade una gota de una solución de Rojo Neutro (10mg/100 ml de
agua) y se deja que se distribuya por toda la preparación durante 15 minutos. Observar al microscopio. El
rojo neutro se acumula en las vacuolas de los microorganismos.

Paramecium Rotíferos

Crustáceos microscópicos
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Alga Zignema Euglena

Closterium

6.2 EPIDERMIS FOLIARES: Células epiteliales de bulbo de cebolla

Las epidermis foliares de hojas verdes están constituidas por células planas, alargadas o lobuladas,
unidas entre sí a modo de un embaldosado. Entre las células epidérmicas se observan los estomas (por los
que se realiza el intercambio de gases y de vapor de agua). Los estomas suelen ser más abundantes en el
envés que en el haz de la hoja. Se tomarán algunas hojas de monocotiledóneas y dicotiledóneas y se hará
una observación directa con una gota de agua entre porta y cubre para observar células epidérmicas y
estomas así como las diferencias entre estomas de monocotiledóneas y dicotiledóneas.

Células epidérmicas de una hoja verde donde se Células epidérmicas de una hoja verde donde
observan los estomas de dicotiledóneas. se observan los estomas de monocotiledóneas.
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6.3. BRANQIA DE MOLUSCO

Los colorantes vitales permiten teñir las células animales o vegetales sin ocasionar la muerte y poder
observar su actividad

- Se abre el mejillón sobre un recipiente a fin de obtener una gota de agua de mar que encierra la
concha, para ello se utilizará la branquia de un mejillón. 7
- Sobre un porta se coloca una gota del colorante vital y con otro porta se hace un frotis de manera
que quede el colorante bien extendido sobre el porta. La composición del colorante vital es:
Rojo Neutro al 0,5% y Verde Janus al 0,1%, ambos mezclados en alcohol del 96º. La
solución de tinción se mezcla a partes iguales de cada componente.
- Se coloca encima una gota de agua de mar.
- Con una pinza se coloca un fragmento de la lámina branquial sobre la gota de agua y se coloca
un cubreobjetos.
- Se observan las células epiteliales provistas de cilios. Algunos orgánulos se observan teñidos
de rojo.

Branquia Cilios
ss

6.4 MITOSIS EN MERISTEMO DE RAÍZ DE CEBOLLA

Mediante el proceso de mitosis, el núcleo de las células eucarióticas se divide, repartiendo de forma
equitativa el material genético, previamente duplicado; así mismo, el citoplasma también se dividirá,
repartiendo los orgánulos celulares en dos células hijas. Estos procesos se conocen como mitosis y
citocinesis. Durante la mitosis se produce la condensación de la cromatina y los cromosomas se hacen
visibles. Al final de la mitosis cada célula hija recibe una copia idéntica del material genético previamente
duplicado. Durante la citocinesis un surco de segmentación divide a la célula en dos y se produce un
reparto más o menos equitativo de los orgánulos y componentes citoplásmicos entre las células hijas.

La observación y estudio de los cromosomas se realiza a partir de células que se encuentran en división
mitótica. Para obtener células en división colocaremos las cebollas en un vaso con agua durante 3 ó 4
días, de manera que las raíces estén siempre en contacto con el agua.
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Preparación de las muestras y tinción:

1) Cortar la punta de una raíz que tenga de 1 a 5 mm y quitarle la piloriza o cofia con mucho
cuidado.
2) Colocar la raíz en un vidrio de reloj que contenga orceína A (orceína acética clorhídrica).
3) Con la ayuda de un bisturí realizar cortes transversales muy finos de la punta de la raíz. En esta
región se encuentran las células meristemáticas que se dividen continuamente y están 8
relacionadas con el crecimiento longitudinal de la raíz.
4) Añadir un poco más de orceína A y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
5) Eliminar la orceína A y añadir orceína B (orceína acética) de forma que las secciones estén
completamente cubiertas.
6) Calentar suavemente el vidrio de reloj en el mechero de alcohol evitando la ebullición durante 30
segundos. Los cortes siempre deben de estar cubiertos por la orceína B. Dejar actuar el colorante
durante al menos 3 minutos.
7) Colocar los cortes de la raíz sobre un portaobjetos y limpiar con papel el exceso de colorante que
pueda rodear los cortes.
8) Cubrir los cortes con un cubreobjetos y con la ayuda de un papel de filtro apretar y aplastar los
cortes (técnica del “squash”), evitando que el cubreobjetos resbale. El papel de filtro entre la
preparación y el dedo debe colocarse para no mancharse de colorante ya que es algo tóxico y
conviene no tocarlo y no respirar sus vapores. Retirar el papel de filtro y observar la muestra al
microscopio óptico.

Observación al microscopio óptico:

El meristemo apical está formado por células más o menos rectangulares, con paredes finas, sin espacios
intercelulares entre ellas. Es una zona de división activa por lo que es posible encontrar células en
diferentes fases de la mitosis.

Interfase: El núcleo es voluminoso. La cromatina se presenta finamente filamentosa y el nucleolo es

evidente.
Fases de la mitosis:

1. Profase: No se observan nucleolos. Los cromosomas se empiezan a visualizar en forma de

gruesos filamentos entrelazados.

2. Metafase: La membrana nuclear ha desaparecido. Los cromosomas aparecen fuertemente

condensados, y cada uno de ellos constituido por dos cromátidas dispuestos en placa
ecuatorial.

3. Anafase: Las cromátidas, ahora ya cromosomas hijos, se separan hacia los polos y entre
ellas se visualiza el huso acromático.

4. Telofase: Los dos grupos de cromosomas hijos se encuentran dispuestos en los dos polos de
las células. Los cromosomas comienzan a descondensarse y en torno a ellos se constituye la
membrana nuclear. Desaparece el huso acromático y en el citoplasma aparece la membrana
plasmática que lo divide, dando lugar así a dos nuevas células hijas.
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Mitosis en raíz de cebolla

6.5 MITOSIS EN PREPARACIONES YA HECHAS

7. Bibliografía:
En el enlace [Link] perteneciente al Departamento de Biología Experimental, Área de Citología e
Histología Animal y Vegetal, se pueden observar un atlas interactivo y videos de histología animal y vegetal.

Olmos, G., Miralles, A. (2003). Prácticas de Citología e Histología. Universitat de les Illes Balears. Servei de
Publicacions i Intercanvi Científic. Cas Jai. Campus Universitari. Palma (Balears).

Pedrosa, J.A., Esteban, F.J., Moral, M.L., Hernández Raquel, Blanco, S., Peinado, M.A. (2004). Manual práctico de
Histología Animal y Vegetal. Servicio de Publicaciones. Universidad de Jaén.

Montuenga, L., Esteban, F.J., Calvo, A. (2009). 1º Edición. Técnicas en Histología y Biología Celular. Elsevier-Masson.

Megías M, Molist P, Pombal MA. (2019). Atlas de histología vegetal y animal. Técnicas histológicas. Recuperado (24-01-
2020) de: [Link]
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Cuestionario práctica 9. Fecha

Apellidos y Nombre: Grupo:

1) ¿Qué son técnicas histológicas y qué es la observación vital?

10

2) Enumera los componentes de la parte óptica (sistema de lentes) de un microscopio óptico y describe
cómo se calcula el aumento total que se obtiene.

3) Describe en qué consiste la técnica del squash.

4) Al observar la branquia de un molusco, ¿qué puedes distinguir en movimiento?

5) ¿Qué porcentaje de células observas en cada uno de los estadios de la mitosis (profase, metafase,
anafase y telofase) cuando utilizas el meristemo apical de raíz de cebolla?