Nombre: Marcos García Nuño
SEMINARIO 3
TÉCNICAS Y CINÉTICA ENZIMÁTICA
1. Un investigador está realizando en paralelo el proceso de purificación de dos proteínas y realiza primero una
cromatografía de exclusión molecular. Sabiendo que el volumen de elución de las proteínas de interés fue de
138 ml para la proteína A y de 112 ml para la proteína B usando los valores de la tabla calcule el PM de las
proteínas:
Proteína PM (Kda) V elución (mL)
Citocromo C 13 210
Quimiotripsina 33.2 185
Ovoalbúmina 45 170
Aldolasa 160 120
Ferritina 440 80
Regresión lineal: log (PM) frente a V elución (mL):
4,000
3,500 y = -0,0114x + 3,575
R² = 0,9944
3,000
2,500
Log (PM)
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
0 50 100 150 200 250
Volumen de elución (mL)
Ecuación de la recta de regresión:
𝑦 = −0,0114 ∙ 𝑥 + 3,575 ⟺ 𝑙𝑜𝑔 𝑃𝑀 = −0,0114 ∙ 𝑉𝑒𝑙𝑢𝑐 + 3,575
Interpolando los valores de los volúmenes de elución de las proteínas A y B en la recta:
Proteína A: Veluc = 138 mL ⇔ log PMA = 2,0018 ⇔ PM (A) = 100,42 Kda
Proteína B: Veluc = 112 mL ⇔ log PMB = 2,2982 ⇔ PM (B) = 198,70 Kda
A continuación, realizó una electroforesis para analizar la pureza de la muestra. En la Figura 1 se indica el perfil
electroforético de las proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS en presencia y ausencia de β-
mercaptoetanol (βME).
a) Explique de forma razonada los resultados obtenidos en presencia y ausencia de β-mercaptoetanol.
¿Cuál sería la masa molecular de las proteínas A y B?
El β-mercaptoetanol es un agente reductor de los enlaces disulfuro, facilitando la desnaturalización completa
y el desplegado de las moléculas de proteína.
Proteína A. Se observan dos señales en presencia de βME (pocillo 2), mientras que solo una en su ausencia
(pocillo 3). Se deduce entonces que la proteína A presenta enlaces disulfuro entre las subunidades que la
conforman, y su masa molecular total es de 100 kDa.
Proteína B. Se observa una única señal tanto en presencia como en ausencia del βME, lo que indica que la
proteína A no presenta puentes disulfuro. La masa molecular de la proteína B es de 200 kDa.
b) Comparando los resultados obtenidos en la cromatografía de exclusión molecular y la electroforesis
¿Puede hacer alguna deducción acerca de su estructura?
La proteína A presenta enlaces disulfuro en su estructura, por lo que en su secuencia contiene restos
aminoacídicos de cisteina (con el grupo sulfhidrilo – SH). Dado que en presencia de βME se obtienen dos
señales de 20 y 30 kDa (pocillo 2), podemos deducir que la proteína A es un tetrámero formado por dos
subunidades de 30 kDa y 2 subunidades de 20 kDa, que interaccionan entre sí a través de enlaces disulfuro.
La proteína B, en cambio, no presenta en su estructura restos aminoacídicos de cisteína, pues no forma
puentes disulfuro.
c) Suponiendo que los puntos isoeléctricos
de las proteínas A y B son 4 y 8,
respectivamente, indique en el gráfico de
la Figura 2 cómo migrarían estas proteínas
en una electroforesis bidimensional
(primera dimensión enfoque isoeléctrico, y
segunda dimensión SDS-PAGE en
presencia de β-mercaptoetanol). Razone la
respuesta.
Proteína A
Proteína B
Primera dimensión (horizontal): enfoque isoeléctrico. Las proteínas se desplazan a través del gradiente de pH
en función de su carga, deteniéndose en el punto donde el pH se iguale a su pI.
Segunda dimensión (vertical): electroforesis SDS-PAGE en presencia de β-mercaptoetanol. Las proteínas
descienden a través del polímero de gel, quedando retenidas en función de su peso molecular, tal y como se
observó anteriormente en la Figura 1. Debido al reactivo βME, la proteína A generará dos señales,
correspondientes a los dos monómeros como consecuencia de la reducción de los puentes disulfuro que los
une.
2. Una mezcla contiene tres polipéptidos cuyas secuencias se muestran a continuación:
1. ATKNRASCLVPKHGALMFWRHKQLVSDPILQKRQHILLVCRNNAAG
2. GPYFGDEPLDVHDEPEEG
3. PHLLSAWKGMEGVGKSQSFAALIVILA
Teniendo en cuenta la secuencia de los péptidos, razone cuál de los 3 quedará retenido en la columna:
a) ¿durante una cromatografía de intercambio aniónico a pH 7?
pI (1) = 11,5 (calculado)
pI (2) < pH = 7, debido a la gran cantidad de residuos aminoacídicos ácidos en la secuencia.
pI (3) > pH = 7, debido a que los residuos aminoacídicos básicos son mayores que los ácidos.
En conclusión, en una cromatografía de intercambio aniónico a pH = 7 los péptidos 1 y 3 estarán cargados
positivamente (pI > pH), mientras que el péptido 2 estará cargado negativamente (pi > pH). Dado que la
cromatografía es de intercambio aniónico, es decir, la fase estacionaria es una resina cargada positivamente,
el péptido 2 será el que quede retenido en la columna, pues sus restos aminoacídicos ácidos cargados
negativamente presentarán mas afinidad por la fase estacionario. En cambio, los péptidos 1 y 3 eluirán en la
columna, pues sus grupos básicos cargados positivamente interaccionan con fuerzas repulsivas con la resina
y eluyen.
b) ¿Y durante una cromatografía de intercambio catiónico a pH 7?
Es el caso contrario al apartado a). La cromatografía de intercambio catiónico presenta una fase estacionaria
que consiste en una resina cargada negativamente, por lo que ambos péptidos 1 y 3 quedarán retenidos, al
interaccionar favorablemente sus grupos cargados positivamente con la resina, mientras que el péptido 2
eluirá.
c) ¿Y en una cromatografía de afinidad usando ATP como ligando, si el motivo de unión a ATP que se
muestra es el siguiente: [AG]-x(4)-G-K-[ST]?
Motivo de unión de ATP: se unirá a péptidos que presenten el patrón [AG]-x(4)-G-K-[ST] en su secuencia.
Desglose del patrón
[AG] : coincide con A ó con G
x(4) : 4 aminoácidos cualquiera
G : coincide con G
K : coincide con K
[ST] : coincide con S ó con T
El único péptido que presenta en su secuencia un patrón de unión del ATP es el péptido 3:
PHLLSAWKGMEGVGKSQSFAALIVILA
Una cromatografía de afinidad usando ATP como ligando consta de una fase estacionaria o matriz inerte que
lleva unida covalentemente ATP (ligando). En este caso, el péptido 3 interaccionará con la fase estacionaria
(se unirá al ATP en el sitio de su secuencia que coincida con el patrón de unión), quedando retenido en la
columna, mientras que los péptidos 1 y 2, al no tener secuencias de unión al ATP, eluirán.
3. Un bioquímico descubre y purifica un enzima nuevo. Antes de purificarlo hace un ensayo para calcular la
actividad enzimática del extracto crudo. Sabiendo que el tiempo de incubación del sustrato con la enzima fue
de 1 min y que el volumen del extracto enzimático utilizado fue de 0.5 mL. La cantidad de sustrato degradado
en dichas condiciones fue de 2 mmoles y la concentración de proteínas del extracto enzimático crudo diluido
100 veces fue de 20 mg/dL.
a) Calcular la actividad enzimática en (U/L) y la actividad enzimática específica (U/mg) del extracto crudo.
𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 2 ⋅ 103 𝜇𝑚𝑜𝑙
Cálculo de AE : 𝐴𝐸 = = = 𝟒 ⋅ 𝟏𝟎𝟔 𝝁𝒎𝒐𝒍 ⋅ 𝒎𝒊𝒏−𝟏 ⋅ 𝑳−𝟏
𝑚𝑖𝑛 ⋅ 𝑚𝐿 1 𝑚𝑖𝑛 ⋅ 0,5 · 10−3 𝐿
Cálculo de la concentración del extracto enzimático
100 𝑚𝐿 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 20 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
= ⟺ 𝑥 = 0,1 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡 𝑒𝑛 0,5 𝑚𝐿 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜
0,5 𝑚𝐿 𝑥 𝑚𝑔
Como está diluido 100 veces: 0,1 𝑚𝑔 ⋅ 100 = 10 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
Cálculo de AEE :
𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 2 ⋅ 103 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝐴𝐸𝐸 = = = 𝟐𝟎𝟎 𝝁𝒎𝒐𝒍 ⋅ 𝒎𝒊𝒏−𝟏 ⋅ 𝒎𝒈−𝟏
𝑚𝑖𝑛 ⋅ 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 1 𝑚𝑖𝑛 ⋅ 10 𝑚𝑔
A continuación, se realizó un protocolo de purificación y se fueron midiendo la concentración de proteína y la
actividad enzimática de los distintos pasos generando la siguiente tabla de purificación:
Procedimiento Proteína total (mg) Actividad (U/L)
1. Extracto crudo
2. Precipitación (sal) 5000 3000000
3. Precipitación (pH) 4000 1000000
4. Cromatografía de intercambio
200 800000
iónico
5. Cromatografía de afinidad 50 750000
6. Cromatografía de exclusión
45 675000
molecular
b) Sabiendo que partimos de 1L de extracto crudo de concentración 20 mg/mL, a partir de la información
de la tabla calcule la actividad específica, el rendimiento y la pureza para cada paso del procedimiento
de purificación.
Se parte de una cantidad de proteína total inicial:
20 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
1𝐿 = 1000 𝑚𝐿 ⋅ = 20.000 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑚𝐿 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜
La AEE del procedimiento 1 corresponde a la hallada anteriormente: AEE = 200 μmol·min-1·mL-1.
El rendimiento del procedimiento 1 (extracto crudo) será del 100%, pues al ser el paso inicial no se purifica
nada (es decir, la pureza es 1).
Para cada procedimiento sucesivo “n”, se calculan los parámetros AEE, rendimiento y pureza:
𝐴𝐸 (𝑛)
𝐴𝐸𝐸 (𝑛) =
𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝑛
𝐴𝐸 𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝑛
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑛 (%) = · 100
𝐴𝐸 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝑝𝑟𝑜𝑐. 1)
𝐴𝐸𝐸 𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝑛
𝐺𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑛 =
𝐴𝐸𝐸 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝑝𝑟𝑜𝑐. 1)
Tabla de resultados:
Actividad
Proteína Actividad (AE) Rendimiento Grado de
Proc. específica (AEE)
total (mg) (μmol/min·L) (%) purificación
(μmol/min·mg)
1 20.000 4.000.000 200 100,0 1
2 5.000 3.000.000 600 75,0 3
3 4.000 1.000.000 250 25,0 1,25
4 200 800.000 4.000 20,0 20
5 50 750.000 15.000 18,8 75
6 45 675.000 15.000 16,9 75
c) ¿Cuál de los procedimientos de purificación es el más efectivo? ¿Y cuál el menos?
El procedimiento 5, la cromatografía de afinidad, es el método de purificación más efectivo o potente, pues
se consigue alcanzar la máxima purificación (75 veces) con un rendimiento aceptable.
El procedimiento 2, precipitación con una sal, es el método menos efectivo, ya que se obtiene un grado de
purificación muy bajo, de 3 veces, con respecto a la proteína inicial.
d) ¿Cuál de los procedimientos de purificación tiene mayor rendimiento?
El procedimiento 2, ya que, como únicamente purifica 3 veces la proteína, recuperamos casi toda la proteína
objeto de purificación en el extracto original (75%).
e) ¿Hay alguna indicación en los resultados de la tabla de que el enzima ya sea puro? ¿Qué técnica usarías
para estimar la pureza de la muestra y por qué?
El procedimiento 4 y 5 obtienen el mismo grado de purificación (75 veces), lo que indica que el enzima
obtenido ya es puro. Para estimar la pureza de la muestra emplearía una electroforesis en gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE).
4. Un sustrato fue hidrolizado por una enzima y la velocidad inicial de desaparición fue medida para distintas
concentraciones del mismo.
a) Calcular la Km y la Vmáx mediante la representación de Lineweaver-Burk, a partir de los datos que se
resumen a continuación:
Sustrato [mM] Velocidad (μmoles/min)
1,0 0,3
3,0 0,8
5,0 1,1
10,0 1,5
25,0 2,0
60,0 2,3
80,0 2,4
90,0 2,4
Sustrato 1 / [S] Velocidad 1 / Vo
(mM) (mM-1) (μmoles/min) (min/μmoles)
1,0 1,000 0,3 3,333
3,0 0,333 0,8 1,250
5,0 0,200 1,1 0,909
10,0 0,100 1,5 0,667
25,0 0,040 2,0 0,500
60,0 0,0167 2,3 0,4348
80,0 0,0125 2,4 0,4167
90,0 0,0111 2,4 0,4167
1 / Vo (min/μmol) y = 2,9358x + 0,362
R² = 0,9981
3,0
2,0
1,0
0,0
-0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1
1 / [S] (mM-1)
-1,0
Ecuación de la recta de regresión lineal:
1 1
𝑦 = 2,9358 · 𝑥 + 0,362 ⟺ = 2,9358 · + 0,362
𝑉0 [𝑆]
Ecuación de linealización de Lineweaver-Burk:
1 𝑘𝑀 1 1
= · +
𝑉0 𝑣𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
Igualando términos en ambas expresiones:
1 1
0,362 𝑚𝑖𝑛/𝜇𝑚𝑜𝑙 = ⟹ 𝑽𝒎𝒂𝒙 = = 𝟐, 𝟕𝟔𝟐 𝝁𝒎𝒐𝒍/𝒎𝒊𝒏
𝑉𝑚𝑎𝑥 0,362
𝑚𝑀 · 𝑚𝑖𝑛 𝑘𝑀 𝑚𝑀 · 𝑚𝑖𝑛 𝑚𝑀 · 𝑚𝑖𝑛 𝜇𝑚𝑜𝑙
2,9358 (𝑝𝑡𝑒) = ⟹ 𝒌𝑴 = 2,9358 · 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 2,9358 · 2,762 = 𝟖, 𝟏𝟏 𝒎𝑴
𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛
b) ¿Cuál es el valor de V0 cuando la concentración de sustrato es de 15 mM?
Sustituyendo en la ecuación de regresión lineal y despejando:
1 1 1 1
= 2,9358 · + 0,362 = 2,9358 · + 0,362 = 0,55772 ⟹ 𝑽𝟎 = = 𝟏, 𝟕𝟗𝟑 𝝁𝒎𝒐𝒍/𝒎𝒊𝒏
𝑉0 [𝑆] 15 𝑚𝑀 0,55772
c) Calcular la concentración de producto formado en los 5 primeros minutos de la reacción si se utilizan
20 mL de sustrato 30 M.
[S] = 30 M >>> kM = 8,11 mM ⟹ 𝑉0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 2,762 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛
En un tiempo de reacción t = 5 minutos:
1,793 𝜇𝑚𝑜𝑙 1 𝑚𝑖𝑛
= ⟹ 𝑥 = 8,965 𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑥 𝑚𝑜𝑙 5 𝑚𝑖𝑛
Como se utilizan 20 mL de sustrato:
8,965 𝜇𝑚𝑜𝑙
[𝒑𝒓𝒐𝒅𝒖𝒄𝒕𝒐] = = 𝟒𝟒𝟖, 𝟐𝟓 𝝁𝑴
20 · 10−3 𝐿
5. La anhidrasa carbónica de los eritrocitos (PM = 30.000 g/mol) cataliza la hidratación reversible del CO2:
H2O + CO2 → H2CO3
Si 10 μg de anhidrasa carbónica pura (Km=12mM) catalizan la hidratación de 0,30 g de CO2 (PM= 44g/mol) en
1 min a 37ºC y a Vmax ¿Cuál es el número de recambio de la anhidrasa carbónica? ¿Y su eficiencia catalítica?
Número de recambio o constante catalítica, Kcat :
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑐𝑎𝑡 =
[𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 ]
Cálculo de moles de CO2 (sustrato):
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 0,30 𝑔
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐶𝑂2 = = = 0,00681 𝑚𝑜𝑙 = 6818,18 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑂2
𝑃𝑀 (𝐶𝑂2 ) 44 𝑔 · 𝑚𝑜𝑙 −1
Cálculo de moles de anhidrasa carbónica (enzima):
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 10 · 10−6 𝑔
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑎𝑛𝑑ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑠𝑎 = = = 3,33 · 10−10 𝑚𝑜𝑙 𝑎𝑛ℎ = 3,33 · 10−4 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑎𝑛ℎ
𝑃𝑀 (𝑎𝑛ℎ) 30000 𝑔 · 𝑚𝑜𝑙 −1
Cálculo del número de recambio:
𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜⁄ 𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑂2⁄ −1
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 · 1 𝑚𝑖𝑛 1 𝑚𝑖𝑛 = 6818,18 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑂2 · 𝑚𝑖𝑛
𝐾𝑐𝑎𝑡 = = =
[𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 ] 𝑚𝑜𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎⁄ 𝑚𝑜𝑙 𝑎𝑛ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑠𝑎 3,33 · 10−4 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑎𝑛ℎ
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛
𝑲𝒄𝒂𝒕 = 𝟐, 𝟎𝟒𝟖 · 𝟏𝟎𝟕 𝒎𝒊𝒏−𝟏
Cálculo de la eficiencia catalítica:
𝐾𝑐𝑎𝑡 2,048 · 107 𝑚𝑖𝑛−1
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 = = = 1,70625 · 106 𝑚𝑀−1 𝑚𝑖𝑛 −1 = 𝟏, 𝟕𝟎𝟔𝟐𝟓 · 𝟏𝟎𝟗 𝑴−𝟏 𝒎𝒊𝒏−𝟏
𝑘𝑀 12 𝑚𝑀
