Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Bioquímica y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio

INTEGRANTES: ▪ MURILLO MEDINA ANA JORLENY

No. de práctica Título de la práctica

3 INVESTIGACIÓN DE PRUEBAS REUMÁTICAS POR TÉCNICA
AGLUTINACIÓN
Objetivos de la práctica de laboratorio:
• Aprender el fundamento de la técnica de aglutinación o floculación.
• Conocer la reacción antígeno y anticuerpo
• Conocer la significación clínica de la prueba, que servirá como herramienta diagnóstica para el
tratamiento y curación de los pacientes afectados con la enfermedad
Instrucciones o consideraciones previas
• Revisar conceptos y definiciones sobre técnicas de aglutinación en reacciones química
• Investigar sobre los reactivos a emplear.
• Revisión e interpretación de la técnica
FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Las reacciones de aglutinación y de precipitación son la base de la mayor parte de las técnicas inmunológicas. Su
principio se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Para comprender lo anterior es necesario definir qué es un
antígeno y un anticuerpo. Antígeno es una sustancia de alto peso molecular, con cierta rigidez estructural y que tiene
la particularidad de ser parcialmente “metabolizado” por células especializadas llamadas macrófagos, por lo tanto, es
capaz de generar una respuesta inmune en un organismo que la detecte como un agente extraño. Mientras que un
anticuerpo es una glicoproteína, producida por linfocitos B activados, llamados células plasmáticas, como respuesta
a la presencia de un antígeno en el organismo, a su vez los anticuerpos pueden ser producidos por líneas celulares in
vitro, como es el caso de la producción de anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos llamados también
inmunoglobulinas, se presentan en cinco clases principales, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que se diferencian entre sí por
sus características físicas, químicas y biológicas.
La capacidad inmunogénica de distintas partículas es en orden decreciente la siguiente: proteínas, glicoproteínas,
polisacáridos, lípidos y azúcares. Las reacciones de precipitación son medibles en cantidad y son fáciles de ejecutar.
Las técnicas de aglutinación son sólo semicuantitativas y algo más difíciles. La aglutinación de los antígenos nativos
insolubles o de las partículas recubiertas por el antígeno puede evaluarse a simple vista con o sin la ayuda del
microscopio. Entre las ventajas de las reacciones de aglutinación están su alto grado de sensibilidad y la enorme
variedad de substancias identificables a través del uso de partículas que están recubiertas por antígeno o por
anticuerpo.
Según Coombs existen 3 requerimientos principales en las pruebas de aglutinación:
➢ Disponibilidad de una suspensión estable de células o de partículas.
➢ Presencia de uno o más antígenos cercanos a la superficie.
➢ Conocimiento de que los anticuerpos "incompletos" o no aglutinables no son localizables sin modificación
(reacciones antiglobulina).
 CLASIFICACIÓN DE LAS REACCIONES DE AGLUTINACIÓN
Aglutinación directa

Un antígeno celular o de partículas insolubles es aglutinado

directamente por el anticuerpo. Un ejemplo de esto es la
aglutinación de los eritrocitos del grupo A por antisueros antiA, la
aglutinación de los eritrocitos RH positivos por el antisuero anti-D
o la aglutinación del antígeno brucelar por anticuerpos anti-
Brucella. Gran cantidad de partículas como pueden ser eritrocitos,
bacterias, hongos y virus pueden ser aglutinados por anticuerpos séricos, algunas veces de manera inespecífica y otras
muy específica, siendo ésta última, respuesta a una previa inmunización del organismo productor de los anticuerpos
séricos. Las pruebas para identificar anticuerpos específicos son llevadas a cabo titulando seriadamente antisueros en
diluciones al doble en presencia de una cantidad constante de antígeno.
Aglutinación indirecta

Se refiere a la aglutinación de las células

recubiertas de antígeno o a las partículas
inertes que son portadoras pasivas de
antígenos solubles. Se tienen ejemplos de
lo anterior en la utilización de partículas de
gelatina en la búsqueda de anticuerpos
contra Treponema pallidum por
aglutinación pasiva (TPPA), la fijación del látex para VDRL en la sífilis y en la utilización de eritrocitos en la prueba
de hemaglutinación indirecta (HAI) en la búsqueda de anticuerpos contra Tripanosoma cruzi, agente causal de la
enfermedad de Chagas. De manera alterna, el antígeno puede ser localizado recubriendo partículas de látex o
eritrocitos con anticuerpo purificado y practicando la llamada aglutinación inversa.
Hemaglutinación viral

Otra categoría de aglutinación que involucra la

aglutinación espontánea de los eritrocitos por ciertos
virus es la reacción de hemaglutinación viral, la cual
puede inhibirse de manera específica en presencia de
anticuerpos antivirales. Por lo tanto, la
hemaglutinación viral puede emplearse para medir la
cantidad de virus o para determinar, por inhibición
homóloga, el título de los anticuerpos dirigidos en
contra de los virus hemaglutinantes.
 Inhibición de la aglutinación

La inhibición de la aglutinación, si se arregla de manera cuidadosa

con antígenos altamente purificados, puede ser usada como un
indicador sensible de la cantidad del antígeno en diversos líquidos
de los tejidos.

Hemaglutinación indirecta (pasiva)

Este tipo de aglutinación se lleva a cabo utilizando

eritrocitos recubiertos de antígenos, o anticuerpos
acoplados de manera espontánea (adsorción pasiva) o
mediante un acoplamiento químico, utilizando diversas
sustancias para este fin, tales como Acido tánico Bencidina
bisdiazoada (BDB), Cloruro crómico (CrCIs),
Glutaraldehído, clorurocianúrico entre otros
Algunas de las substancias que se absorben para la hemaglutinación:
• Antígenos de Escherichia coli.
• Antígenos de Yersinia.
• Lipopolisacáridos de Neisseria meningitidis.
• Antígenos de Toxoplasma.
• Derivado proteico purificado (DPP).
• Endotoxina de especies de Micoplasma.
• Virus.
• Antibióticos, especialmente penicilina.
• Ovalbúmina.
• Albúmina sérica bovina.
• Haptenos.
• Antígenos de polen.
• Gonadotrofina coriónica
Al realizar esta técnica se debe poner especial atención en la posible interferencia de anticuerpos heterófilos, los cuales
pueden aglutinar inespecíficamente a los eritrocitos. Estos son anticuerpos naturales, no adquiridos por inmunización
a los glóbulos rojos utilizados, pero capaces de aglutinarlos. Generalmente son del tipo IgM. Cuando dicha interferencia
se presenta, se deben absorber las muestras de suero a menudo con eritrocitos lavados no cubiertos por antígeno, para
eliminar los anticuerpos heterófilos o ser tratados con 2-Mercaptoetanol, el cual actúa sobre la cadena J de las IgM
inactivándolas.
 Capacidad de detección
La inhibición de la hemaglutinación empleando reacciones de hemaglutinación pasiva mediante placas de
microtitulación es sensible para medir antígenos a concentraciones de 0.2- 9 µg/ml. La hemaglutinación indirecta o
pasiva con células sensibilizadas a las proteínas puede identificar anticuerpos a concentraciones tan bajas como 0.03
µg/ml. En los antisueros con títulos muy altos de aglutinación un fenómeno de prozona puede obscurecer los resultados.
El fenómeno de prozona produce reacciones falsas negativas de aglutinación a concentraciones elevadas de anticuerpo
como resultante de la mala formación de estructuras de enrejado molecular y por el bloqueo estérico por el exceso de
anticuerpo, el uso de diluciones seriadas estándar elimina esta dificultad. Debido a que el anticuerpo IgM es
aproximadamente 750 veces más eficiente que la IgG en la aglutinación, la presencia de altas cantidades de IgM puede
influir notoriamente sobre los resultados de la prueba. En el banco de sangre la Hemaglutinación indirecta es
comúnmente usada para la detección de anticuerpos Anti-Tripanosoma cruzi
Inhibición de la hemaglutinación
La inhibición de la aglutinación de los eritrocitos recubiertos con antígeno por el antígeno homólogo es un método
sensible y específico para la identificación de pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre o en otros líquidos
de los tejidos. El principio de este análisis es que, el anticuerpo incubado previamente con antígenos homólogos
solubles o de reacción cruzada, es «inactivada» cuando se incuba con eritrocitos recubiertos de antígeno. Este método
de inhibición de la hemaglutinación ha resultado muy útil para la identificación de HBsAg en la hepatitis y para la
identificación del antígeno factor VIII en la hemofilia y trastornos afines de la coagulación.

Reactivos de laboratorio:
 Reactivo A: suspensión de partículas de látex-poliestireno sensibilizadas con anticuerpos anti-PCR
 Control Negativo: dilución de suero negativo
 Control Positivo: dilución de suero positivo
Materiales de laboratorio:
 Pipetas automáticas
 tubos de ensayo
 Puntas descartables para pipetas automáticas
 Placas de plástico o vidrio de fondo negro
Equipos de laboratorio:
 Microscopio
 Centrifuga
 Estufa

Método, técnica operatoria o procedimiento: (Diagrama de flujo)

Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar. Agitar el Reactivo A antes de usar,
vaciando previamente la pipeta del gotero.
RESULTADOS OBTENIDOS
Negativo: suspensión homogénea. Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica
de 1 a 4 +. Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible
macroscópicamente. La concentración aproximada de PCR en la muestra puede ser calculada por la
fórmula siguiente: PCR (mg/l) = Título x Sensibilidad de la reacción (6 mg/l) Ejemplo: la muestra presenta
un título de 1:2. Su concentración de PCR es de 2 x 6 = 12 mg/l. METODO DE CONTROL DE CALIDAD
Procesar simultáneamente el Control Negativo

CONCLUSIONES
Con esta práctica se utilizaron diferentes técnicas de aglutinación como (FR) (PCR) (PCR) (ASO) para el
estudio de anticuerpos específicos, se pudo visualizar cuantitativa y cualitativamente los diferentes
procedimientos y reacciones que tienen lugar en la placa.
Recomendaciones:
▪ Contar con su mandil y guantes para trabajar en el laboratorio.
▪ Seguir la técnica paso a paso, empleando las debidas medidas de bioseguridad.
▪ Manipular los reactivos con prolijidad, para evitar su contaminación

Bibliografía:

▪ Singer, J.M.; Plotz, C.M.; Parker, E. and Elster, S.K. - Am. J. Clin. Path. 28:611 (1957). - Nilson, L.A. - Acta
Pathol. Microbiol. Scand. 73:129 (1968). - Scherffarth, F.; Pérez-Miranda, M.; Goetz, H. - Blut. 20: 296 (197
▪ Engvall E, Perlmann, P. (1971). Immunochemistry 8:871