TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO

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UD.2 TÉCNICAS BASADAS EN

REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO
PRIMARIAS

-Las técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo primarias

-Enzimoinmunoensayos
-Fluoroinmunoensayos
-Radioinmunoensayos
-Inmunoensayos quimioluminiscentes
-Inmunocromatografías
-Técnica western blot
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1. LAS TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO

PRIMARIAS

Las reacciones antígeno-anticuerpo primarias no producen

manifestaciones visibles por lo que se necesitan sistemas adicionales de
revelado.

1.1 LOS MARCADORES

Las características que deben reunir los marcadores son las

siguientes:
• Deben poder unirse al Ag o al Ac complementario al que se
desea determinar, sin alterar la capacidad de unirse al Ag o al Ac
de la muestra.
• De fácil detección y medición utilizando sistemas de
amplificación de señales.

Dependiendo de las características de la molécula acoplada se aplican

distintos tipos técnicas:
Enzimoinmunoensayos: el marcador es una enzima que induce
cambios de color fácilmente detectables por colorimetría.
Inmunocromatografías: se utilizan nanopartículas coloreadas de
metales pesados principalmente. Se utilizan soportes sólidos donde se
observan líneas coloreadas de precipitación.
Fluoroinmunoensayos: utiliza la propiedad que tienen ciertas
sustancias de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía
radiante. El marcador son moléculas de fluorocromo que convierten la luz
absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en luz de menor
energía (longitud de onda más larga). Cada fluorocromo tiene un espectro
de emisión y excitación característico que se puede medir.
Radioinmunoensayos: el marcador es un isotopo radiactivo. Se marca
el Ag o el Ac dependiendo de lo que queramos determinar.
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El inconveniente de estas técnicas radica en el uso de isótopos, ya que
estos son peligros y precisan de instalaciones adecuadas.

1.2 CLASIFICACIÓN DE LOS INMUNOENSAYOS

Otras características que diferencian a los inmunoensayos son:

Competitivos:
Para determinar un Ag en una muestra problema, se añade el Ac
específico y una cantidad determinada de Ag marcado (Ag*). Ambos
antígenos competirán por el Ac. Medimos la cantidad de Ag* libre (no
conjugado) que será inversamente proporcional a la cantidad de Ag en el
suero problema. A más Ag en la muestra menor cantidad de Ag* formará
inmunocomplejos.
Se puede hacer al contrario para determinar el Ac en una muestra
problema.
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No Competitivos

Para determinar un Ag en una muestra problema se añade un Ac

marcado (Ac*). Cuanto mayor sea la cantidad de Ag en la muestra mayor
cantidad de Ac* se unirán al él. La cantidad de Ac* que forma
inmunocomplejos es directamente proporcional a la concentración de Ag
en la muestra problema.
Se puede hacer al contrario para determinar el Ac en una muestra
problema.

Heterogéneos

Requieren la separación de los inmunocomplejos y las moléculas no

conjugadas. Para hacer la separación se utiliza un reactivo de fase sólida
donde quedan fijados los inmunocomplejos. Por diferentes lavados se
realiza la separación de las moléculas no conjugadas.
Técnicas usadas para determinar moléculas de alto peso molecular.

Homogéneos

Ensayos que no requieren la separación de las moléculas no

conjugadas o sobrantes. Son más sencillas y rápidas que las heterogéneas
y no necesitan un reactivo de fase sólida. Consisten en una inhibición o
activación de una reacción enzimática por parte del complejo Ag-Ac.
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Se utilizan para determinar sustancias de bajo peso molecular y de
concentración elevada, por ejemplo, las drogas.

1.3 REPRESENTACIÓN DE DATOS Y OBTENCIÓN DE RESULTADOS

Los resultados de los inmunoensayos se pueden obtener por dos

medios:
Expresando el valor medido mediante un formato normalizado,
ensayos protocolizados donde están establecidos los criterios de obtención
e interpretación de resultados.

Obteniendo el resultado por extrapolación en una curva patrón. Es

necesario elaborar esa curva patrón a partir de sueros control (patrones).
Estos patrones tienen unos valores conocidos que establecen la relación
entre la cantidad de señal producida en el ensayo y la concentración de
analito.

Es necesario que exista una normalización, es decir, todos los

laboratorios deben aplicar los mismos parámetros que permitan poder
comparar los resultados, compartirlos, realizar estudios y una correcta
interpretación de los mismos.
Hay que simplificar todo lo posible los datos obtenidos en las pruebas
diagnósticas para que sean útiles y anotar con las unidades o datos
complementarios para minimizar el riesgo de error.
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2. ENZIMOINMUNOENSAYOS

Emplean la capacidad catalítica de las enzimas como marcador

inmunoquímico para la valoración de la unión Ag-Ac producida tras un
periodo de incubación, con la adición posterior de un sustrato. Tienen alta
sensibilidad. La realización de los enzimoinmunoensayos consta de dos
etapas bien diferenciadas.
1) Unión entre el Ag y el Ac,
2) Se añade el sustrato y se determina la actividad enzimática del
marcador.

Se clasifican:

2.1 INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS MULTIPLICADOS (EMIT)

Estos inmunoensayos utilizan una enzima conjugada con el analito de

interés (normalmente un antígeno) como marcador en una reacción
enzimática.
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La reacción inmunológica se produce en medio líquido (ensayos
homogéneos) y se basa en una reacción de enlace competitivo entre el Ag
de la muestra y el Ag marcado con la enzima:
*Cuando el Ag marcado forma el inmunocomplejo, la enzima se
inactiva debido a un cambio de configuración.
*Cuando el Ag marcado no forma el inmunocomplejo, la enzima se
mantiene activa y reacciona con su sustrato, generando un producto
coloreado.
Se basa en el marcaje de una enzima con el Ag a determinar. La unión
del Ac a este complejo inhibe la actividad catalítica de la enzima, al impedir
el acceso del sustrato al centro activo. La competencia entre el Ag de la
muestra y el Ag ligado a enzima por el anticuerpo implica que, a mayor
concentración de Ag presente en la muestra, menor cantidad de enzima
será inactivada, por lo que la actividad es directamente proporcional al Ag
presente en la muestra.
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Procedimiento básico de los EMIT

Se usa principalmente para detectar drogas o algunas proteínas en

suero y sangre.
1. Mezclar una muestra sospechosa de contener la sustancia de interés
(Ag) con una solución con concentración conocida de Ac y el sustrato
de la enzima.
2. Dejar un tiempo para que se formen los complejos Ag-Ac.
3. Añadir una concentración conocida del Ag marcado.
4. Medir la velocidad de aparición del color.
5. La concentración de Ag se determina comparando la tasa observada
con las tasas producidas por concentración de Ag patrón.

Existen analizadores espectrofotométricos de mesa específicos para

analizar metabolitos de drogas de abuso, drogas terapéuticas o
inmunosupresores empleando la técnica de EMIT, con reactivos
comerciales líquidos listos para su uso.

2.2 ENSAYO DE INMUNOADSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

Utilizan Ag o Ac conjugados con una enzima, de forma que, además

de mantener su actividad inmunológica, tengan actividad enzimática.
El uso de enzimas como marcadores ha provocado la aparición de
numerosos métodos inmunoenzimáticos que reemplazan a aquellos que
métodos inmunológicos que usan marcadores como por ejemplo
fluorocromos o isótopos.

Características generales

Uno de los componentes de la reacción (el Ag o el Ac) está marcado

con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (técnica heterogénea).
Debido a esto la reacción Ag-Ac queda inmovilizada en el soporte y puede
ser revelada mediante la adición de un sustrato específico que después de
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la actuación de la enzima produce una coloración visible a simple vista o
cuantificable por espectrofotometría o colorimetría.

El soporte
El soporte debe ser inmunoadsorbente. Los más habituales son las
microplacas de poliestireno, que pueden ser estándares o de alta captación
que presentan grupos hidrofóbicos característicos del material. Las de alta
captación además tienen grupos hidrofílicos capaces de establecer puentes
de hidrógeno.

Las enzimas
Las más utilizadas para marcar Ag o Ac en las reacciones de ELISA son
la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano, y en menor grado, la β-
galactosidasa.
Enzimas estables y pueden almacenarse a 4ºC durante más de seis
meses. Disponemos de ellas comercialmente en forma de enzima o
conjugadas con Ag o Ac. Por tanto, existen también diversos sustratos
comercializados para cada una de ellas.
Hay dos propiedades de las enzimas que tenemos que tener en
cuenta:
El impedimento estérico. Cuando se produce la unión de la enzima al
Ag o al Ac, ambas moléculas deben conservar su actividad. El Ag o el Ac han
de poder formar inmunocomplejos y la enzima debe poder unirse a su
sustrato. Si alguna de las moléculas es muy grande o dos puntos de unión
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están muy próximos, se produce un impedimento estérico que imposibilita
alguna de las reacciones.
La β-galactosidasa por su tamaño produce a menudo impedimento
estérico.
La relación de conjugación. Cuantas más moléculas de enzimas se
puedan conjugar con cada molécula de anticuerpo, mayor será la
intensidad de la señal.

El sustrato
Se usan sustratos cromogénicos (cromógenos), que son compuestos
incoloros inicialmente y se colorean de forma evidente después de la
reacción enzimática. Para cuantificar la reacción se mide la variación de
densidad óptica que se produce.
Uno de los más utilizados en las técnicas de ELISA es la
ortofenilendiamina (OPD).
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Operaciones básicas de las técnicas ELISA

Los pasos comunes de las distintas técnicas de ELISA son:

El tapizado. Es la adsorción de los Ag o Ac, conjugados o no, en el

soporte.
El método más común consiste en diluirlos en tampón carbonato a pH 9,6,
colocar la dilución sobre el soporte e incubar durante 3h a 37ºC o 16h a
4ºC. El pH utilizado favorece la fijación de las proteínas al soporte.

El bloqueo o postapizado. Adición de una proteína irrelevante para

evitar fijaciones inespecíficas. Se puede usar BSA (albúmina sérica bovina).

La conjugación. Unión de los Ag o Ac a la enzima que actúa como

marcador. Hay Ac o Ag unidos a enzimas ya preparadas, pero también se
pueden preparar en el laboratorio. Para ello se usa un agente puente, el
glutaraldehído o el m-peryodato sódico.

Las incubaciones y los lavados. En distintas fases se adicionan Ac y/o

Ag para formar los inmunocomplejos. Los Ac y lo Ag sobrantes se eliminan
mediante lavados. Como solución de lavado se usa una solución salina o
PBS con Tween 20.
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Tipos de ELISA

Todas son técnicas heterogéneas (requieren la separación de las

moléculas no conjugadas), y hay competitivas y no competitivas.

No competitivos: ELISA directo para la detección de Ag

Queremos detectar si en una muestra problema hay un antígeno

específico.
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No competitivos: ELISA indirecto para la detección de Ac

Queremos saber si hay un Ac específico en la muestra problema.

No competitivos: ELISA sándwich DAS para detección de Ag

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No competitivos: ELISA sándwich HADAS para detección de Ag

Competitivos: ELISA de competición para detección de Ac

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Si hay coloración el resultado es negativo. Donde se produce la
coloración no había Ac, y la totalidad de Ac fijados son los marcados.
Si no aparece color la prueba es positiva. Los Ac de la solución
problema compiten y desplazan a los Ac marcados. La intensidad de color
es inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en la
muestra problema.

Competitivos: ELISA de competición para detección de Ag

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Competitivos: ELISA de inhibición para la detección de Ac

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Competitivos: ELISA de inhibición para la detección de Ag

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3. FLUOROINMUNOENSAYOS

Son inmunoensayos que utilizan como marcadores sustancias

capaces de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía radiante.

3.1 TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA

En esta técnica para visualizar el complejo Ag-Ac es necesario una

sustancia fluorescente acoplada a un Ac o a un Anti-Ac, y se conoce con el
nombre de conjugado fluorescente.
Los Ag utilizados son formes o particulados (cortes de tejidos,
bacterias, parásitos,…).
Hay dos tipos:
Inmunofluorescencia directa (IFD): Se añade la solución del Ac
fluoresceinado sobre el Ag, el cual ha sido previamente fijado sobre un
portaobjetos o placa, se incuba y se leen los resultados.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI): El Ac o suero problema se aplica
sobre el Ag, se lava y luego se añade un anti-Ac fluoresceinado contra las
inmunoglobulinas del primero, se lava y se leen los resultados.

En todos los casos los complejos Ag-Ac formados se ponen de

manifiesto por observación del portaobjetos en un microscopio de
fluorescencia.
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Para aplicar la microscopía de fluorescencia se requiere:
Una lámpara ultravioleta (luz intensa y de longitud de onda
corta) y filtros que permiten el paso de una determinada longitud de onda.
La luz ultravioleta se dirige a través del objetivo hacía donde está el
Ag, el cual está colocado en un porta de inmunofluorescencia. A través de
los oculares se observa un campo oscuro pero la zona donde están los Ac
fijados presenta fluorescencia verde.
El patrón de fluorescencia es típico de cada Ag.

a) Portaobjetos; b) Adición de conjugado

Microscopio de fluorescencia
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3.2 FLUOROENZIMOINMUNOENSAYOS (FEIA)

Los fluoroenzimoinmunoensayos se basan en la formación, a partir de

especies no fluorescentes, de un producto enzimático capaz de emitir
fluorescencia que será detectada en un equipo denominado fluorímetro.
Un ejemplo es la Técnica ELFA, ensayo de fluorescencia ligado a
enzima o como una técnica de ELISA ligada a fluorescencia. Consiste en una
técnica ELISA sándwich con lectura final en fluorescencia, que es
proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.
Algunos equipos permiten procesar hasta 12 muestras al mismo
tiempo y varios parámetros a la vez (Salmonella y Listeria monocytogenes).
Otro ejemplo es la técnica CAP que utiliza una matriz plástica
recubierta de alérgenos. Esta es la técnica que se utiliza para la detección
de IgE específica contra diferentes proteínas alergénicas.

• Enzimoinmunoensayo microparticulado (MEIA)

Se basa en el aislamiento de los complejos Ag-Ac sobre la superficie

de fase sólida de unas esferas de pequeño tamaño denominadas
micropartículas.
La técnica tiene un formato sándwich no competitivo y produce
resultados que son directamente proporcionales a la concentración de
analito presente en la muestra problema.
La técnica MEIA está disponible de manera automatizada para medir
moléculas grandes como marcadores tumorales, hepáticos,…
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Componentes de la técnica MEIA

Fase sólida: micropartículas de látex recubiertas de Ac específico para

el analito.
Conjugado: Ac específicos de molécula problema marcados con la
enzima fosfatasa alcalina.
Sustrato: 4-metilumbeliferilfosfato.

Procedimiento

1. Las micropartículas de látex recubiertas de Ac específicos se

incuban con la muestra problema.
2. Se añade la mezcla sobre una matriz de fibra de vidrio, que sirve
para fijar los complejos Ag-Ac.
3. Se añade el conjugado (Ac marcado con fosfatasa alcalina (FA)) que
se unirá al complejo Ag-Ac si se han formado.
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4. Se añade el sustrato (4-metilumbeliferilfosfato). La fosfatasa
alcalina hidroliza el sustrato produciendo 4-metilumbeliferona que
es una molécula fluorescente que emite a 450 nm.
5. Se mide el producto fluorescente.

4. RADIOINMUNOENSAYOS (RIA)

Son inmunoensayos que utilizan isótopos radiactivos como

marcadores; la molécula marcada se denomina trazador.
Se basan en la inhibición competitiva de la unión de un antígeno
radiactivo (trazador) a su Ac específico por parte del antígeno no marcado:

Ag Ac-Ag
Ac +
Ag* Ac-Ag*

La cantidad de Ag* libre es proporcional a la cantidad de Ag presente

en la muestra. El Ag* se mide en un contador de centello o en un contador
gamma, que mide el tipo de radiación emitida. Isótopos más utilizados son
los del yodo 125I y 131I.
Técnica con una alta sensibilidad y especificidad. Es apta para la
determinar la concentración de Ag en muestras complejas de fluidos
biológicos.
Técnica que se utiliza para la detección de hormonas.

4.1 TIPOS DE RADIOINMUNOENSAYOS

Hay dos tipos, en fase líquida y en fase sólida.

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RIA EN FASE LÍQUIDA

1. Titulación del antisuero: consiste en incubar diferentes

concentraciones de anticuerpos con el antígeno marcado y
valorado (trazador). Se elabora una curva patrón. Se selecciona la
concentración de Ac óptima para el desarrollo posterior de la
prueba.
2. Ensayo de desplazamiento: consiste en la incubación del Ag
marcado y valorado (trazador), el antisuero previamente titulado
(Ac valorado) y la muestra problema que contiene el Ag a
determinar.

Se produce una competición entre el Ag de la muestra problema y el

trazador. A mayor concentración de Ag en la muestra problema mayor
concentración de trazador libre.
Lo que se mide es el trazador libre (Ag marcado) por lo que es
necesario eliminar el trazador unido mediante precipitación de los
complejos Ag-Ac.
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RIA EN FASE SÓLIDA

1. Fijación del Ag sobre un soporte (tubo o placa de plástico) y

posterior lavado para eliminar el exceso de Ag.
2. Bloque o postapizado de la placa para evitar fijaciones
inespecíficas.
3. Adición de la muestra problema donde queremos determinar los
Ac, y lavado para eliminar los Ac no unidos.
4. Adición de Anti-Ac radiomarcado (conjugado) y posterior lavado
para eliminar los anti-Ac no unidos.
5. Recuento de la radiactividad de la placa en un contador.
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4.2 VARIANTES DE LOS RIA

RIST
Radioinmunoanálisis de competición para medir la IgE sérica total
(similar al ELISA de competición).

A mayor cantidad de IgE en el suero problema menos IgE marcada se

unirá.
Los resultados se obtienen interpolando en una curva patrón.
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RAST

Radioinmunoensayo que mide la IgE Ag-específica (similar al ELISA

indirecto).
Los pasos son iguales a los del RIA en fase sólida con la excepción de
que el Ag se une a un disco de celulosa. La disponibilidad de mucho más
antígeno sobre el disco permite la sensibilidad necesaria para unir
pequeñas cantidades de IgE específica presenten en el suero problema.

5. INMUNOENSAYOS QUIMIOLUMINISCENTES

Se basan en la utilización de sustancias luminiscentes como

marcadores para detectar la formación del complejo antígeno-anticuerpo.
Estas sustancias emiten luz cuando se produce la reacción enzimática.
Técnica más sensible que las reacciones colorimétricas.
La emisión quimioluminiscente se mide con un espectrofotómetro de
quimioluminiscencia molecular o luminómetro.
Los marcadores quimioluminiscentes son compuestos químicos que
emiten luz cuando son oxidados por peróxidos en presencia de algunos
catalizadors (peroxidasas, catalasas,…). Algunos de los más habituales son:
Luminol, éster de acridinio, Lucigenina.
Existen numerosos sustratos quimioluminiscentes comerciales que
están formados por dos componentes, solución de peróxido estable y una
solución mejorada de luminol. Estos componentes mezclados y posterior
incubación con Ac marcados con la enzima, se produce una reacción
química que produce luminicencia.
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Inmunoensayo magnético quimioluminiscente (CMIA)

Se emplean micropartículas magnéticas (fase sólida) con anticuerpos

de captura en su superficie para ligar el Ag a determinar y anticuerpos
marcados para el revelado de la reacción, tratándose de un ensayo
inmunométrico no competitivo (tipo sándwich) similar al MEIA.
Técnica muy sensible.
La lectura se realiza con un tubo fotomultiplicador de
quimioluminiscencia.
Se utiliza para la detección de factor reumatoide y proteína C reactiva.
También para monitorizar las concentraciones plasmáticas de fármacos.

La concentración de señal medida es directamente proporcional

a la concentración de analito en la muestra.
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6. INMUNOCROMATOGRAFÍAS

Técnicas que se usan con frecuencia por su sencillo en el manejo y en

la interpretación de los resultados.
La inmunocromatografía, cromatografía de flujo lateral, prueba de un
solo paso o test rápido es un tipo de inmunoensayo en que se usan como
marcador nanopartículas coloreadas.
Las nanopartículas pueden ser metales pesados. Dependiendo de la
nanopartícula utilizada la banda resultante es de un color u otro.
La reacción sirve para detectar Ag o Ac en una muestra problema y se
lleva a cabo sobre una tira de nitrocelulosa en la que hay 5 zonas:
1. Zona de siembra
2. Zona del conjugado
3. Zona de detección
4. Zona de control
5. Región absorbente

6.1 INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS

La muestra problema se coloca en la zona de siembra y por

capilaridad avanza hasta la zona absorbente.
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6.2 INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

Siembra Conjugado Detección Control Absorbente

Muesta con Ag específico Ac Ac específico

Ac problema inmovilizado y antiinmunoglobulinas para el
marcado de la especie animal conjugado (Ag Ac
(conjugado) del Ac problema marcado)
Ac-Ag* Anti-Ac-Ac-Ag* Capta el
exceso de Ag*
Ac-Ag*

7. TÉCNICA WESTERN BLOT

Esta técnica se engloba dentro de un grupo de técnicas diseñadas

para la detección de proteínas fijadas sobre nitrocelulosa.
La fijación puede ser a partir de proteínas separadas previamente por
electroforesis y transferidas a las membranas (Inmunotransferencia,
inmunoblotting o Western Blot) o por soluciones proteicas complejas (DOT-
ELISA).
Las proteínas se fijan sobre una membrana
(fundamentalmente de nitrocelulosa)

Revelado se consigue por adición de Ac marcados con enzimas formando

complejos

Adición sustrato específico que reacciona con la enzima y produce un

producto coloreado insoluble que precipita

Visualización mediante:
Películas radiográficas incubadas con las membranas
Imagen digital de la quimioluminiscencia
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7.1 DOT-ELISA O MÉTODO DE LAS MANCHAS

Técnica que detecta pequeñas cantidades de proteínas presentes en

una mezcla compleja.

DOT-ELISA para la detección de Ac

1. Depositar sobre una membrana de nitrocelulosa una pequeña gota
de Ag y dejar secar bajo una lámpara.
2. Bloquear la membrana para evitar reacciones inespecíficas y lavar.
3. Sumergir la membrana en una solución de la muestra problema
sospechosa de contener Ac. Incubar, eliminar la solución y lavar la
membrana.
4. Sumergir la membrana en una solución de Ac marcado con una
enzima. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana.
5. Sumergir la membrana en una solución del sustrato apropiado
capaz de dar un producto final insoluble y coloreado que precipita
en la membrana sobre el lugar de la reacción.
6. Recuperar la membrana y realizar la lectura. Si en la muestra había
Ac en la zona de sembrado del Ag aparece una coloración. En las
zonas donde no había Ag se observan de color blanco.
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DOT-ELISA para la detección de Ag

Membrana de
nitrocelulosa

7.2 INMUNOTRANSFERENCIA, INMUNOBLOTTING O WESTERN BLOT

Consta de 3 fases:
1. Separación de las proteínas mediante electroforesis.
2. Transferencia de las proteínas separadas en un soporte, en la que
tendrá lugar la inmunorreacción.
3. Reconocimiento de las proteínas mediante una técnica
inmunoenzimática.

Separación de las proteínas

Se realiza por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil
sulfato sódico (SDS-PAGE) que separa las proteínas en función del su peso
molecular.
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1. La muestra se mezcla con SDS (detergente iónico que desnaturaliza

las proteínas y la carga negativamente de manera uniforme).
2. Se deposita la mezcla en los pocillos del gel PAGE
3. Se aplica voltaje y las proteínas migran separándose en función de su
peso molecular.

El gel PAGE está compuesto de un polímero de poliacrilamida

constituido de la siguiente forma.

Una vez la muestra con SDS y el gel PAGE están listos se siembra la
muestra en los pocillos del gel, se aplica voltaje para que las proteínas
migren hacia el polo positivo.
Es necesario incorporar patrones de comparación de pesos
moleculares conocidos para determinar los pesos moleculares de las
muestras.
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Transferencia de las proteínas

Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE son transferidas,

también electroforéticamente, a un soporte sólido (membrana). Este
proceso se podría hacer por simple difusión, pero habitualmente se realiza
mediante transferencia eléctrica, empleando un equipo determinado.
Las membranas más comunes son las de nitrocelulosa, también se
utilizan las de nailon, de PVDF.
El método más utilizado para la transferencia a la membrana es la
transferencia en medio húmedo.

Carcasa:
Gel y membrana protegidos por papel
de filtro y esponjas empapados en
tampón de transferencia.

La carcasa preparada se introduce en la cubeta de electroforesis 1h a

100v.
Para comprobar la transferencia se tiñe la membrana con rojo
Ponceau (tinción reversible mediante lavado con agua).
Para evitar el pegado inespecífico de los anticuerpos a la membrana
es necesario incubarlos en una solución de bloqueo, por ejemplo, BSA o
leche en polvo descremada al 5% en PBS (tampón fosfato salino).
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Reconocimiento de las proteínas

Se hace directamente sobre la membrana de nitrocelulosa,

habitualmente mediante una técnica inmunoenzimática, utilizando
sustratos que dan productos insolubles y coloreados. El revelado de los
complejos Ag-Ac formados se hace similar a los RIA y ELISA.
Dos de las enzimas más utilizadas son la peroxidasa de rábano y la
fosfatasa alcalina,
cada uno utilizando sus sustratos correspondientes.

Enzima Sustrato Características

Peroxidasa Diaminobencidina Precipitado marrón oscuro
de rábano 4-cloro-1-naftol Precipitado azulado
Sustrato quimioluminiscente

Fosfatasa BCIP (5-bromo-4-cloro-3-

alcalina indolil fofato
NBT (nitroazul de tetrazolio)
Sustrato quimioluminiscente
Sistema radioquímico de Uso de Ac secundarios unidos a 125I y
revelado detección por autorradiografía