Carolina Ramírez González Técnicas de inmunodiagnóstico

UNIDAD 2: TÉCNICAS BASADA EN

REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO
PRIMARIAS.
1. LAS TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES ANTÍGENO -ANTICUERPO
PRIMARIAS.

Las reacciones antígeno-anticuerpo primarias no producen manifestaciones visibles por

lo que se necesitan sistemas adicionales de revelado.

1.1. LOS MARCADORES.

Las características que deben reunir los marcadores son las siguientes:

- Deben poder unirse al Ag o al Ac complementario al que se desea determinar,

sin alterar la capacidad de unirse al Ag o al Ac de la muestra.
- De fácil detección y medición utilizando sistemas de amplificación de señales.

Dependiendo de las características de la molécula acoplada se aplican distintos tipos de

técnicas:

ENZIMOINMUNOENSAYOS: El marcador es una enzima que induce cambios de color

fácilmente detectables por colorimetría.

INMUNOCROMATOGRAFÍAS: Se utilizan nanopartículas coloreadas de metales pesados

principalmente. Se utilizan soportes sólidos donde se observan líneas coloreadas de
precipitación.

FLUOROINMUNOENSAYOS: Utilizan la propiedad que tienen ciertas sustancias de emitir

fluorescencia cuando son excitadas con energía radiante. El marcador son moléculas de
fluorocromo que convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más
corta) en luz de menor energía (longitud de onda más larga). Cada fluorocromo tiene un
espectro de emisión y excitación característico que se puede medir.

RADIOINMUNOENSAYOS: El marcador es un isotopo radiactivo. Se marca el Ag o el Ac

dependiendo de lo que queramos determinar.

El inconveniente de estas características es que radican en el uso de isótopos, ya que

estos son peligrosos y precisan de instalaciones adecuadas.

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1.2. CLASIFICACIÓN DE LOS INMUNOENSAYOS.

Otras características que diferencian a los inmunoensayos son:

- COMPETITIVOS: Para determinar un Ag

en una muestra problema, se añade el Ac
específico y una cantidad determinada de
Ag marcado (Ag*). Ambos antígenos
competirán por el Ac. Medimos la
cantidad de Ag* libre (no conjunto) que
será inversamente proporcional a la
cantidad de Ag en el suero problema. A
más Ag en la muestra menor cantidad de Ag* formará inmunocomplejos.
Se puede hacer al contrario para determinar el Ac en una muestra problema.
- NO COMPETITIVOS: Para determinar un Ag
en una muestra problema se añade un Ac
marcado (Ac*). Cuando mayor sea la
cantidad de Ag en la muestra mayor
cantidad de Ac* se unirán a él. La cantidad
de Ac* que forma inmunocomplejos es
directamente proporcional a la
concentración de Ag en la muestra
problema.
Se puede hacer al contrario para determinar el Ac en una muestra problema.
- HETEROGÉNEOS: Requieren la separación de los inmunocomplejos y las
moléculas no conjugadas. Para hacer la separación se utiliza un reactivo de fase
sólida donde quedan fijos los inmunocomplejos. Por diferentes lavados se realiza
la separación de las moléculas no conjugadas.
Técnicas usadas para determinar moléculas de alto peso molecular.
- HOMOGÉNEOS: Ensayos que no requieren la separación de las moléculas no
conjugadas o sobrantes. Son más sencillas y rápidas que las heterogéneas y no
necesitan un reactivo de fase sólida. Consisten en una inhibición o activación de
una reacción enzimática por parte del complejo Ag-Ac.
Se utilizan para determinar sustancias de bajo peso molecular y de concentración
elevada, por ejemplo, las drogas.

1.3. REPRESENTACIÓN DE DATOS Y OBTENCIÓN DE RESULTADOS.

Los resultados de los inmunoensayos se pueden obtener por dos medios:

Expresando el valor medido mediante un formato normalizado, ensayos protocolizados

donde están establecidos los criterios de obtención e interpretación de resultados.

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Obteniendo el resultado por extrapolación en una curva patrón. Es necesario elaborar

esa curva patrón a partir de sueros control (patrones). Estos patrones tienen unos
valores conocidos que establecen la relación entre la cantidad de señal producida en el
ensayo y la concentración de analito.

Es necesario que exista una normalización, es decir, todos los laboratorios deben aplicar
los mismos parámetros que permitan poder comparar los resultados, compartirlos,
realizar estudios y una correcta interpretación de los mismo.

Hay que simplificar todo lo posible los datos obtenidos en las pruebas diagnósticas para
que sean útiles y anotar con las unidades o datos complementarios para minimizar el
riesgo de error.

2. ENZIMOINUMOENSAYOS.

Emplean la capacidad catalítica de las enzimas como marcador inmunoquímico para la

valoración de la unión de Ag-Ac producida tras un periodo de incubación, con la adición
posterior de un sustrato. Tienen alta sensibilidad. La realización de los
enzimoinmunoensayos consta de dos etapas bien diferenciadas.

1) Unión entre el Ag y el Ac.

2) Se añade el sustrato y se determina la actividad enzimática del marcador.

Se clasifican:

INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS MULTIPLICADOS (EMIT)

Homogéneos competitivos.
ANÁLISIS DE INMUNOADSORCIÓN LIGADOS A ENZIMAS (ELISA)
ELISA directo para la detección de antígenos.
HETEROGÉNEOS NO ELISA indirecto para detección de anticuerpos.
COMPETITIVOS ELISA sándwich DAS para detección de antígenos.
ELISA sándwich HADAS para detección de antígenos.
ELISA de competición para detección de anticuerpos.
HETEROGÉNEOS ELISA de competición para detección de antígenos.
COMPETITIVOS ELISA de inhibición para detección de anticuerpos.
ELISA de inhibición para detección de antígenos.

2.1. INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS MULTIPLICADOS (EMIT)

Estos inmunoensayos utilizan una enzima conjugada con el analito de interés

(normalmente un antígeno) como marcador en una reacción enzimática.

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La reacción inmunológica se produce en medio líquido (ensayos homogéneos) y se basa

en una reacción de enlace competitivo entre el Ag de la muestra y el Ag marcado con la
enzima:

- Cuando el Ag marcado forma el inmunocomplejo, la enzima se inactiva debido a

un cambio de configuración.
- Cuando el Ag marcado no forma el inmunocomplejo, la enzima se mantiene
activa y reacciona con su sustrato, generando un producto coloreado.

Se basa en el marcaje de una enzima con el Ag a determinar.

La unión del Ac a este complejo inhibe la actividad catalítica
de la enzima, al impedir el acceso del sustrato al centro
activo. La competencia entre el Ag de la muestra y el Ag ligado
a enzima por el anticuerpo implica que, a mayor
concentración de Ag presente en la muestra, menor cantidad
de enzima será inactivada, por lo que la actividad es
directamente proporcional al Ag presente en la muestra.

PROCEDIMIENTO BÁSICO DE LOS EMIT.

Se usa principalmente para detectar drogas o algunas proteínas en suero y sangre.

I. Mezclar una muestra sospecha de contener la sustancia de interés (Ag) con

una solución con concentración conocida de Ac y el sustrato de la enzima.
II. Dejar un tiempo para que se formen los complejos Ag-Ac.
III. Añadir una concentración conocida del Ag marcado.
IV. Medir la velocidad de aparición del color.
V. La concentración de Ag se determina comparando la tasa observada con las
tasas producidas por concentración de Ag patrón.

Existen analizadores espectrofotométricos de mesa específicos para analizar

metabolitos de drogas de abuso, drogas terapéuticas o inmunosupresores empleando
la técnica de EMIT, con reactivos comerciales líquidos listos para su uso.

2.2. ENSAYO DE INMUNOADSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

Utilizan Ag o Ac conjugados con una enzima, de forma que, además de mantener su

actividad inmunológica, tengan actividad enzimática.

El uso de enzimas como marcadores ha provocado la aparición de numerosos métodos

inmunoenzimáticos que reemplazan a aquellos métodos inmunológicos que usan
marcadores como por ejemplo fluorocromos o isótopos.

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CARACTERÍSTICAS GENERALES.
Uno de los componentes de la reacción (Ag o Ac) está marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (técnica heterogénea). Debido a esto la reacción Ag-Ac
queda inmovilizada en el soporte y puede ser revelada mediante la adición de un
sustrato específico que después de la actuación de la enzima produce una coloración
visible a simple vista o cuantificable por espectrofotometría o colorimetría.

EL SOPORTE

El soporte debe ser inmunoadsorbente. Los más habituales son

las microplacas de poliestireno, que pueden ser estándares o de
lata captación que presentan grupos hidrofóbicos característicos
del material. Las de alta captación además tienen grupos
hidrofílicos capaces de establecer puentes de hidrógeno.

LAS ENZIMAS

Las más utilizadas para marcar Ag o Ac en las reacciones de ELISA son la fosfatasa
alcalina y la peroxidasa de rábano, y en menor grado, la β-galactosidasa.

Enzimas estables y pueden almacenarse a 4ºC durante más de seis meses. Disponemos
de ellas comercialmente en forma de enzima o conjugadas con Ag o Ac. Por tanto,
existen también diversos sustratos comercializados para cada una de ellas.

Hay dos propiedades de las enzimas que tenemos que tener en cuenta:

- IMPEDIMENTO ESTÉRICO: Cuando se produce la unión de la enzima al Ag o al

Ac, ambas moléculas deben conservar su actividad. El Ag o el Ac han de poder
formar inmunocomplejos y la enzima debe poder unirse a su sustrato. Si alguna
de las moléculas es muy grande o dos puntos de unión están muy próximos, se
produce un impedimento estérico que imposibilita alguna de las reacciones.
La β-galactosidasa por su tamaño produce a menudo impedimento estérico.
- RELACIÓN DE CONJUGACIÓN: Cuántas más moléculas de enzimas se puedan
conjugar con cada molécula de anticuerpo, mayor será la intensidad de la señal.
ENZIMA ESTABILIDAD PRECIO RELACIÓN DE IMPEDIMENTO OTRAS CARACTERÍISTICAS
CONJUGACIÓN ESTÉRICO
Fosfatasa Mayor: más Mayor: Menor: menos Mayor: menos - Se inactiva por agentes
ventajoso menos ventajoso ventajoso
alcalina quelantes, fosfatos orgánicos y pH
(FA) ventajoso ácido.
- Necesita tampones específicos.
Peroxidasa Menor: menos Menor: Mayor: más Menor: más - Es incompatible con bastantes
ventajoso más ventajoso ventajoso estabilizantes (azida sódica, etc.)
ventajoso - La peroxidasa endógena y
algunos metales interfieren en su
actividad.

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EL SUSTRATO

Se usan sustratos cromogénicos (cromógenos), que son

compuestos incoloros inicialmente y se colorean de forma
evidente después de la reacción enzimática. Para cuantificar la
reacción se mide la variación de densidad óptica que se produce.

Uno de los más utilizados en las técnicas de ELISA es la

ortofenilendiamina (OPD)

ENZIMAS SUSTRATOS CROMOGÉNICOS

Fosfatasa alcalina p-NPP (paranitrofenilfosfato) λ= 405-410 nm -> amarillo
TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) λ= 450 nm -> azul
Peroxidasa λ= 450 nm -> amarillo
ABTS (2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-ácido λ= 405-410 nm -> azul verdoso
sulfónico))
OPD (ortofenilendiamina) λ= 490 nm -> amarillo

OPERACIONES BÁSICAS DE LAS TÉCNICAS ELISA

Los pasos comunes de las distintas técnicas ELISA son:

EL TAPIZADO: Es la adsorción de los Ag o Ac, conjugados o no, en el soporte. El método

más común consiste en diluirlos en tampón carbonato a pH 9’6, colocar la dilución sobre
el soporte e incubar durante 3 horas a 37ºC o 16 horas a 4ºC. El pH utilizado favorece la
fijación de las proteínas al soporte.

EL BLOQUEO O POSTAPIZADO: Adición de una proteína irrelevante para evitar fijaciones

inespecíficas. Se puede usar BSA (albúmina sérica bovina)

LA CONJUGACIÓN: Unión de los Ag o Ac a la enzima que actúa como marcador. Hay Ac

o Ag unidos a enzimas ya preparada, pero también se pueden separar en el laboratorio.
Para ello se usa un agente puente, el glutaraldehído o el m-peryodato sódico.

LAS INCUBACIONES Y LOS LAVADOS: En distintas fases se adicionan Ac y/o Ag para

formar los inmunocomplejos. Los Ac y los Ag sobrantes se eliminan mediante lavados.
Como solución de lavado se usa una solución salina o PBS con Tween 20.

TIPOS DE ELISA
Todas son técnicas heterogéneas (requieren la separación de las moléculas no
conjugadas), y hay competitivas y no competitivas.

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NO COMPETITIVO

- ELISA DIRECTO PARA LA DETECCIÓN DE AG:

Queremos detectar si en una muestra
problema hay un antígeno específico.

- ELISA INDIRECTO PARA LA DETECCIÓN DE AC: Queremos saber si hay un Ac

específico en la muestra problema.

- ELISA SÁNDWICH DAS PARA DETECCIÓN DE AG:

- ELISA SÁNDWICH HADAS PARA DETECCIÓN DE AG:

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COMPETITIVOS:

- ELISA DE COMPETICIÓN PARA DETECCIÓN DE

AC: Si hay coloración el resultado es negativo.
Donde se produce la coloración no había Ac, y la
totalidad de Ac fijados son los marcados.
Si no aparece color la prueba es positiva. Los Ac
de la solución problema compiten y desplazan a
los Ac marcados. La intensidad de color es
inversamente proporcional a la cantidad de
anticuerpos presentes en la muestra problema.

- ELISA DE COMPETICIÓN PARA DETECCIÓN DE AG:

- ELISA DE INHIBICIÓN PARA LA DETECCIÓN DE AC:

- ELISA DE INHIBICIÓN PARA LA DETECCIÓN DE AG:

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3. FLUOROINMUNOENSAYOS.

Los fluoroinmunoensayos son inmunoensayos que utilizan como marcadores sustancias

capaces de emitir fluorescencia cuando son excitados con energía radiante.

3.1. TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA.

En esta técnica para visualizar el complejo Ag-Ac es necesario una sustancia fluorescente
acoplada a un Ac o a un Anti-Ac, y se conoce con el nombre de conjugado fluorescente.

Los Ag utilizados son formes o particulados (cortes de tejidos, bacterias, parásitos, etc.).
Hay dos tipos:

- Inmunofluorescencia directa (IFD): Se añade la solución del Ac fluoresceinado

sobre el Ag, el cual ha sido previamente fijado sobre un portaobjetos o placa, se
incuba y se leen los resultados.
- Inmunofluorescencia indirecta (IFI): El Ac o suero problema se aplica sobre el
Ag, se lava y luego se añade a un anti-Ac fluoresceinado contra las
inmunoglobulinas del primero, se lava y se leen los resultados.

En todos los casos los complejos Ag-Ac formados se ponen de manifiesto por
observación del portaobjetos en un microscopio de fluorescencia.

Para aplicar la microscopía de fluorescencia se requiere:

Una lámpara ultravioleta (luz intensa y de longitud de onda corta) y

filtros que permiten el paso de una determinada longitud de onda.

La luz ultravioleta se dirige a través del objetivo hacia donde está el

Ag, el cual está colocado en un portaobjetos de inmunofluorescencia.
A través de los oculares se observa un campo oscuro pero la zona
donde están los Ac fijados presenta fluorescencia verde.

El patrón de fluorescencia es típico de cada Ag.

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3.2. FLUOROENZIMOINMUNOENSAYOS (FEIA)

Los fluoroenzimoinmunoensayos se basan en la formación, a partir de especies no

fluorescentes, de un producto enzimático capaz de emitir fluorescencia que será
detectada en un equipo denominado fluorímetro.

Un ejemplo es la TÉCNICA ELFA, ensayo de fluorescencia ligado a enzima o como una

técnica de ELISA ligada a fluorescencia. Consiste en una técnica ELISA sándwich con
lectura final en fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de antígeno presente en
la muestra.

Algunos equipos permiten procesar hasta 12 muestras al mismo tiempo y varios

parámetros a la vez (Salmonella y Listeria monocytogenes).

Otro ejemplo es la técnica CAP que utiliza una matriz plástica recubierta de alérgenos.
Esta es la técnica que se utiliza para la detección de IgE específica contra diferentes
proteínas alergénicas.

ENZIMOINMUNOENSAYO MICROPARTICULADO (MEIA)

Se basa en el aislamiento de los complejos Ag-Ac sobre la superficie de fase sólida de
unas esferas de pequeño tamaño denominadas micropartículas.

La técnica tiene un formato sándwich no competitivo y produce resultados que son

directamente proporcionales a la concentración de analito presente en la muestra
problema.

La técnica MEIA está disponible de manera automatizada para medir moléculas grandes
como marcadores tumorales, hepáticos, etc.

COMPONENTES

- Fase sólida: Micropartículas de látex recubiertas de Ac específico para el analito.

- Conjugado: Ac específicos de molécula problema marcados con la enzima
fosfatasa alcalina.
- Sustrato: 4-metilumbeliferilfosfato.

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PROCEDIMIENTO

1. Las micropartículas de látex recubiertas de Ac específicos se incuban con la

muestra problema.
2. Se añade la mezcla sobre una matriz de fibra de vidrio, que sirve para fijar los
complejos Ag-Ac.
3. Se añade el conjugado (Ac marcado con fosfatasa alcalina (FA)) que se unirá al
complejo Ag-Ac si se han formado.
4. Se añade el sustrato (4-metilumbeliferilfosfato). La fosfatasa alcalina hidroliza el
sustrato produciendo 4-metilumbeliferona que es una molécula fluorescente
que emite a 450 nm.
5. Se mide el producto fluorescente.

4. RADIOINMUNOENSAYOS (RIA)

Los radioinmunoensayos son inmunoensayos que utilizan

isótopos radiactivos como marcadores; la molécula
marcada se denomina trazador.

Se basan en la inhibición competitiva de la unión de un antígeno radiactivo (trazador) a

su Ac específico por parte del antígeno no marcado:

La cantidad de Ag* libre es proporcional a la cantidad de Ag presente en la muestra. El

Ag* se mide en un contador de centello o en un contador gamma, que mide el tipo de
radiación emitida. Los isótopos más utilizados son los del yodo: 125I y 131I.

Técnica con una lata sensibilidad y especificidad. Es apta para determinar la

concentración de Ag en muestras complejas de fluidos biológicos.

Técnica que se utiliza para la detección de hormonas.

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4.1. TIPOS DE RADIOINMUNOENSAYOS.

Hay dos tipos, en fase líquida y en fase sólida.

RIA EN FASE LÍQUIDA

1. Titulación del antisuero: Consiste en incubar
diferentes concentraciones de anticuerpos con el
antígeno marcado y valorado (trazador). Se
elabora una curva patrón. Se selecciona la
concentración de Ac óptima para el desarrollo
posterior de la prueba.
2. Ensayo de desplazamiento: Consiste en la
incubación del Ag marcado y valorado (trazador),
el antisuero previamente titulado (Ac valorado) y
la muestra problema que contiene el Ag a
determinar.

Se produce una competición entre el Ag de la muestra problema y el trazador. A

mayor concentración de Ag en la muestra problema mayor concentración de
trazador libre.

Lo que se mide (Ag marcado) por lo que es necesario eliminar el trazador unido
mediante precipitación de los complejos Ag-Ac.

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RIA EN FASE SÓLIDA

1. Fijación del Ag sobre un soporte (tubo o placa de plástico) y posterior lavado para
eliminar el exceso de Ag.
2. Bloque o postapizado de la placa para evitar fijaciones inespecíficas.
3. Adición de la muestra problema donde queremos determinar los Ac, y lavado
para eliminar los Ac no unidos.
4. Adición de Anti-Ac radiomarcado (conjugado) y posterior lavado para eliminar
los anti-Ac no unidos.
5. Recuento de la radiactividad de la placa en un contador.

4.2. VARIANTES DE LOS RIA

Existen dos variantes de los RIA: los RIST y los RAST.

RIST
Se trata de radioinmunoanálisis de competición para
medir la IgE sérica total (similar al ELISA de
competición).

A mayor cantidad de IgE en el suero problema menos

IGE marcada se unirá.

Los resultados se obtienen interpolando en una curva

de patrón.

RAST
Se trata de radioinmunoensayo que mide la IgE Ag-específica (similar al ELISA indirecto)

Los pasos son iguales a los del RIA en fase sólida con la excepción de que el Ag se una a
un disco de celulosa. La disponibilidad de mucho más antígeno sobre el disco permite la
sensibilidad necesaria para unir pequeñas cantidades de IgE específica presente en el
suero problema.

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5. INMUNOENSAYOS QUIMIOLUMINISCENTES.

Se basan en la utilización de sustancias luminiscentes como marcadores para detectar

la formación del complejo antígeno-anticuerpo. Estas sustancias emiten luz cuando se
produce la reacción enzimática.

Es una técnica más sensible que las reacciones colorimétricas.

La emisión quimioluminiscente se mide con un espectrofotómetro de

quimioluminiscencia molecular o luminómetro.

Los marcadores quimioluminiscentes son compuestos químicos que emiten luz cuando
son oxidados por peróxidos en presencia de algunos catalizadores (peroxidasa, catalasa,
etc.) Algunos de los más habituales son, luminol, éster de acridinio o lucigenia.

Existen numerosos sustratos quimioluminiscentes comerciales que están formados por

dos componentes, solución de peróxido estable y una solución mejorada de luminol.
Estos componentes mezclados e incubados posteriormente con Ac marcados con la
enzima, producen una reacción química que produce luminicencia.

INMUNOENSAYOS MAGNÉTICO QUIMIOLUMINSCENTE (CMIA)

Se emplean micropartículas magnéticas (fase sólida) con anticuerpos de captura en su
superficie para ligar el Ag a determinar y anticuerpos marcados para el revelado de la
reacción, tratándose de un ensayo inmunométrico no competitivo (tipo sándwich)
similar al MEIA. Se trata de una técnica muy sensible.

La lectura se realiza con un tubo fotomultiplicador de quimioluminiscencia.

Se utiliza para la detección de factor

reumatoide y proteína C reactiva.
También para monitorizar las
concentraciones plasmáticas de
fármacos.

La concentración de señal medida es

directamente proporcional a la
concentración de analito en la
muestra.

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6. INMUNOCROMATOGRAFÍAS.

Son técnicas que se usan con frecuencia por su sencillo manejo e interpretación de los
resultados.

La inmunocromatografía, es una cromatografía de flujo lateral, prueba de un solo paso

o test rápido, es un tipo de inmunoensayo en que se usan como marcador
nanopartículas coloreadas.

Las nanopartículas pueden ser metales pesados. Dependiendo de la nanopartícula

utilizada la banda resultante es de un color u otro.

La reacción sirve para detectar Ag o Ac en una muestra problema y se lleva a cabo sobre
una tira de nitrocelulosa en la que hay 5 zonas:

1. Zona de siembra.
2. Zona del conjugado.
3. Zona de detección.
4. Zona de control.
5. Región absorbente.

6.1. INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS.

La muestra problema se coloca en la zona de siembra y por capilaridad avanza hasta la

zona absorbente.

6.2. INMUNOCROMATOGRAGÍA PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS.

SIEMBRA CONJUGADO DETECCIÓN CONTROL ABSORBENTE

Muestra Ag específico Ac Ac específico Ac
con Ac inmovilizado antiinmunoglobulinas para el
problema. y marcado de la especie animal conjugado (Ag
(conjugado) del problema marcado)
Ac-Ag* Anti-Ac-Ac-Ag* Capta el
exceso de Ag*
Ac-Ag*

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7. TÉCNICA WESTERN BLOT.

Esta técnica se engloba dentro de un grupo de técnicas diseñadas para la detección de

proteínas fijadas sobre nitrocelulosa.

La fijación puede ser a partir de proteínas separadas previamente por electroforesis y

transferidas a la membrana (inmunotransferencia, inmunoblotting o Western blot) o por
soluciones proteicas complejas (DOT-ELISA)

7.1. DOT-ELISA O MÉTODO DE LAS MANCHAS.

Técnica que detectar pequeñas cantidades de proteínas presentes en una mezcla

compleja.

DOT-ELISA PARA LA DETECCIÓN DE AC.

1. Depositar sobre una membrana de nitrocelulosa una pequeña gota de Ag y dejar
secar bajo una lámpara.
2. Bloquear la membrana para evitar reacciones inespecíficas y lavar.
3. Sumergir la membrana en una solución de la muestra problema sospechosa de
contener Ac. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana.
4. Sumergir la membrana en una solución de Ac marcado con una enzima. Incubar,
eliminar la solución y lavar la membrana.
5. Sumergir la membrana en una solución del sustrato apropiado capaz de dar un
producto final insoluble y coloreado que precipita en la membrana sobre el lugar
de la reacción.
6. Recuperar la membrana y realizar la lectura. Si en la
muestra había Ac en la zona de sembrado del Ag
aparece una coloración. En las zonas donde no había Ag
se observan de color blanco.

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DOT-ELISA PARA LA DETECCIÓN DE AG.

7.2. INMUNOTRANSFERENCIA, INMUNOBLOTTING O WESTERN BLOT.

Consta de tres fases:

1. Separación de las proteínas mediante electroforesis.

2. Transferencia de las proteínas separadas en un soporte, en la que tendrá lugar
la inmunorreacción.
3. Reconocimiento de las proteínas mediante una técnica inmunoenzimática.

SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS.

Se realiza por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-
PAGE) que separa las proteínas en función de su peso molecular.

1. La muestra se mezcla con SDS (detergente iónico que desnaturaliza las proteínas
y la carga negativamente de manera uniforme)
2. Se deposita la mezcla en los pocillos del gel PAGE.
3. Se aplica voltaje y las proteínas migran separándose en función de su peso
molecular.

El gel PAGE está compuesto de un polímero de poliacrilamida

constituido de la siguiente forma.

Una vez la muestra con SDS y el gel PAGE están listos se

siembra la muestra en los pocillos del gel, se aplica voltaje para
que las proteínas migren hacia el polo positivo.

Es necesario incorporar patrones de comparación de pesos moleculares conocidos para

determinar los pesos moleculares de las muestras.
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TRANSFERENCIA DE LAS PROTEÍNAS.

Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE
son transferidas, también
electroforéticamente, a un soporte sólido
(membrana). Este proceso se podría hacer por
simple difusión, pero habitualmente se realiza
mediante transferencia eléctrica, empleando
un equipo determinado.

Las membranas más comunes son las de nitrocelulosa, también se utilizan las de nailon,
de PVDF.

El método más utilizado para la transferencia a la membrana es la transferencia en

medio húmedo.

La carcasa preparada se introduce en la cubeta de electroforesis 1 hora a 100v.

Para comprobar la transferencia se tiñe la membrana con rojo Ponceau (tinción

reversible mediante lavado con agua)

Para evitar le pegado inespecífico de los anticuerpos a la membrana es necesario

incubarlos en una solución de bloqueo, por ejemplo, BSA o leche en polvo descremada
al 5% en PBS (tampón fosfato salino)

RECONOCIMIENTO DE LAS PROTEÍNAS.

Se hace directamente sobre la membrana de nitrocelulosa habitualmente mediante una
técnica inmunoenzimática, utilizando sustratos que dan productos insolubles y
coloreados. El revelado de los complejos Ag-Ac formados se hace similar a los RIA y
ELISA.

Dos de las enzimas más utilizadas son la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina,
cada uno utilizando sustratos correspondientes.

ENZIMA SUSTRATO CARACTERÍSTICAS

Peroxidasa de Diaminobencidina 4-cloro-1-naftol. Precipitado marrón
rábano Sustrato quimioluminiscente. oscuro
Precipitado azulado
Fosfatasa BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) Uso de Ac secundarios
alcalina NBT (nitroazul de tetrazolio) unidos a 125I y detección
por autorradiografía.
Sustrato quimiolumiscente
Sistema radioquímico de revelado.

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