Práctica de laboratorio 4.
SerialCloner.
Programa de Biotecnología.
Materia: Ingeniería Genética.
Facilitador: Carlos Vergara C. Esp. MSc, PhD (c)
Requerimientos:
Paquete SerialCloner V 2-6-1 instalado.
Conexión a internet.
1. Ingrese al NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) e introduzca el número de
referencia L78833.1
a. ¿Qué gen le arroja el resultado? BRCA-1
b. ¿Cuál es la función de este gen? Este gen codifica una fosfoproteína nuclear
de 190 kB que desempeña un papel en el mantenimiento de la estabilidad
genómica y también actúa como supresor de tumores.
c. ¿Qué longitud en pb tiene este gen? 117,143 bp
2. En el menú a la derecha, vaya al apartado de “información relacionada” y vaya al
link “gene”.
a. ¿Qué información encuentra dentro? El nombre, la ubicación, la descripción,
los alias, MIM.
3. En el listado de genes, abajo encontrará un link para nuestro gen de interés BRCA1,
¿Que función esta descrita para este gen? Reparador de ADN asociado al Homo
sapiens.
4. Ingrese a este link BRCA1
a. ¿Qué información encuentra dentro?
b. Describa la función detallada de este gen.
La proteína codificada se asocia con otros supresores de tumores, sensores
de daños en el ADN y transductores de señales para formar un gran complejo
proteico de múltiples subunidades conocido como complejo de vigilancia
genómica asociado a BRCA1 (BASC). Este producto génico está asociado con
la ARN polimerasa II y también interactúa con el complejo histona deacetilasa
a través de su dominio C-terminal. Por lo tanto, esta proteína desempeña un
papel en la transcripción, la reparación de roturas de doble cadena del ADN y
la recombinación. Las mutaciones en este gen son responsables de
aproximadamente el 40 % de los cánceres de mama hereditarios y de más del
80 % de los cánceres de mama y de ovario hereditarios. El empalme
alternativo juega un papel en la regulación de la localización subcelular y la
función fisiológica de este gen.
c. ¿En qué cromosoma se encuentra?
En el cromosoma 7
5. Regrese a la página inicial del gen.
6. Seleccione el exón No. 11 y anote la posición nucleotídica donde comienza y donde
termina dicho exón.
(33,872 - 37,297)
7. Descargue este gen BRCA1 completo en formato FASTA y guárdelo en su escritorio.
8. Abra SerialCloner e importe la secuencia FASTA que acaba de descargar.
9. Ubique el exón 11 dentro de la secuencia del gen BRCA1 completo.
a. ¿Qué longitud en pb tiene el exón 11? 3,426
10. Copie la secuencia del exón 11 dando clic derecho sobre el área sombreada en azul.
11. Vaya al menú principal de SerialCloner y en “File” cree un nuevo archivo, copiando
la secuencia del exón 11.
12. Guarde este archivo.
13. En la parte inferior vaya a “Graphic map”.
a. ¿Que le muestra esta herramienta? Mapa gráfico del exón 11 con todos sus
componentes.
b. Guarde este mapa y anéxelo a su informe.
14. Regrese al menú anterior y de clic en Sequence Map.
a. ¿Que le muestra esta herramienta?
El mapa de restricción del exón 11, nos muestra los cortes en los sitios de
restricción uno a la vez.
b. Guarde este mapa y anéxelo a su informe.
15. En el menú superior, vaya a la herramienta “Virtual cut”
a. ¿De que se trata esta herramienta?
Análisis de restricción del exón 11 con la generación de fragmentos en sitios
correspondientes y sus descripciones.
16. En el menú desplegable, seleccione el archivo que acaba de crear (exón 11).
17. Realice cortes independientes con las enzimas AluI, EcoRI, Hind III y PstI.
a. ¿Cuantos fragmentos se generaron con cada una de estas enzimas?
à AluI – 11 fragmentos
à EcoRI – 2 fragmentos
à HindIII – 0 fragmentos
à Pstl – 3 fragmentos
b. ¿Cuál fue el fragmento más grande y el más pequeño generado con cada una
de estas enzimas?
AluI à 1,022 bp - From AluI [1426] To AluI [2448]
à 82 bp - From AluI [89] To AluI [171]
EcoRI à 3,189 bp - From EcoRI [237]
à 237 bp - From --- To EcoRI [237]
HinIII à no generó fragmentos
Pstl à 2,107 bp - From --- To PstI [2107]
à 289 bp - From PstI[3137] To ---
c. Guarde el listado de cortes de la izquierda y el corrido electroforético virtual
de la derecha y anéxelo a su informe.
18. Realice cortes con todas las enzimas al mismo tiempo.
a. ¿En que cambia la electroforesis virtual?
Existe un aumento de la cantidad de fragmentos, bandas y cortes debido a
que todos se agruparon en un solo gel de electroforesis.
b. ¿En que cambia el listado de cortes?
Se aíslan los fragmentos de distintos tamaños en el gel y a medida que se
agregan más enzimas, se tienen más bandas y los fragmentos se fragmentan
aún más.
c. Explique la razón de estos cambios
Debido al aumento de enzimas de diferentes concentración, sus actividades
catalíticas y tamaño por lo que es necesario su fragmentación para que su
desplazamiento en el gel sea efectivo.
19. En el menú desplegable de la derecha, cambie el DNA ladder por cualquiera de su
preferencia
a. Explique los cambios en la electroforesis virtual.
Lo que cambia es la cantidad de pares de bases y la posición de cada uno de
los fragmentos.
20. Regrese al menú principal y abra la herramienta “Site usage”
a. Revise el informe generado.
b. ¿Para que es útil esta herramienta?
Para ver la cantidad de pares de bases que hay por encima de restricción,
también nos muestra las enzimas utilizadas y las que no.
21. Regrese al menú principal y abra la herramienta Seq.Map.
a. Revise el informe generado.
b. ¿Para que es útil esta herramienta?
Los tres marcos de lectura de la secuencia actual. Me muestran los sitios de
restricción que tienes para cada uno de los segmentos de tu fragmento. En
pocas palabras, se tienen enzimas de restricción con la localización de cada
una, tres diferentes marcos de lecturas con sus aminoácidos.
c. ¿Que significan las 3 líneas de letras que aparecen debajo de la secuencia?
Son los aminoácidos para los que codifica el codón. Hay 3 filas porque son los
distintos marcos de lectura.
d. ¿Que significan los asteriscos (*) que se encuentran en medio de las
secuencias de letras?
Debido a que si la habilidad de la encima de restricción para adherirse al sitio
de restricción es variable, impar o bloqueada.
e. ¿Cuál es la secuencia de letras que corresponde a su secuencia original del
GeneBank?, ¿La secuencia número 1, 2 o 3?
Secuencia número 2
f. ¿Que otra información encuentra relevante en este informe?
g. Copie este informe y anéxelo a su reporte.
22. ¿Que es el código IUPAC?
Los códigos IUPAC son códigos de 16 dígitos que permiten la designación inequívoca
de ácidos nucleicos (Tabla 1). Los códigos pueden representar estados con
especificaciones únicas de ácidos nucleicos (A, G, C, T/U) o permitir la ambigüedad
entre 2, 3 o 4 posibles estados de ácidos nucleicos.
a. Anexe la asignación IUPAC para cada uno de los aminoácidos.
23. FIN DEL TALLER
