Diseño de Primers
Biología Molecular.
Dayana Calderón Manrique MSc.
[email protected].
https://rb.gy/6p157
Reglas Generales para el Diseño de Primers
Parámetros Valores Óptimos
Secuencia 3´ es crítica para
1. Secuencia única
el anillaje.
2. G/C Clamp en el 3’ 1-2 G/C
3. No ¨self-complementarity¨ < 3 bases contiguas
4. No dímeros de primers < 3 bases contiguas
5. Composición en bases 45-55% del contenido G+C
6. Tamaño del primer 18-25 bases
7. Tm
8. Longitud y composición de 100-600 pb de distancia
la secuencia a amplificar
Secuencia Única
La secuencia del primer debe ser única en el
templado.
No debe haber anillaje en posibles contaminantes.
AND Templado
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’
TGCTAAGTTG CAGTCAACTGCTAC TGCT AGTTG
A
Primer Candidato 1 5’-TGCTAAGTTG-3’ NO ES UNICO
Primer Candidato 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’ UNICO
Secuencia Única
Secuencia 3´es crítica para el anillaje
Secuencias 5’ puede ser ¨alterada¨ - por ejemplo
para añadir sitios de restricción, codones de
inicio, señales de secreción etc.-
3’ 5’ Si
3’
5’
Dirección de la Síntesis
3’
5
5 ’ 3’ No
’
Reglas Generales para el Diseño de
Primers
Parámetros Valores Óptimos
1. Secuencia única Secuencia 3´es crítica para el
anillaje.
2. G/C Clamp en el 3’ 1-2 G/C
3. No ¨self-complementarity¨ < 3 bases contiguas
4. No dímeros de primers < 3 bases contiguas
5. Composición en bases 45-55% del contenido G+C
6. Tamaño del primer 18-25 bases
7. Tm
8. Longitud y composición de 100-600 pb de distancia
la secuencia a amplificar
Clamp de G/C en el extremo 3’
El extremo 3’ debe tener G/C
Probabilidad del correcto anillamiento en el
sitio en donde se añaden las bases
Si hay 5 – 10 nucleótidos de complementariedad
en el extremo 3’, usualmente servirán de primer
Reglas Generales para el Diseño de
Primers
Parámetros Valores Óptimos
1. Secuencia única Secuencia 3´es crítica para el
anillaje.
2. G/C Clamp en el 3’ 1-2 G/C
3. No ¨self-complementarity¨ < 3 bases contiguas
4. No dímeros de primers < 3 bases contiguas
5. Composición en bases 45-55% del contenido G+C
6. Tamaño del primer 18-25 bases
7. Tm
8. Longitud y composición de 100-600 pb de distancia
la secuencia a amplificar
Evitar la Formación de Estructuras Secundarias
Evitar la Formación de Estructuras
Secundarias
• Hairpin Loops
ACTGAAGCACTGAAGATACTTCAGT GAACTACCTACGAAGATACTTCAGT
Evitar la Formación de Estructuras Secundarias
• Self • Cross
Dimers Dimers
EJEMPLO
Reglas Generales para el Diseño de
Primers
Parámetros Valores Óptimos
1. Secuencia única Secuencia 3´es crítica para el
anillaje.
2. G/C Clamp en el 3’ 1-2 G/C
3. No ¨self-complementarity¨ < 3 bases contiguas
4. No dímeros de primers < 3 bases contiguas
5. Composición de los 45-55% del contenido G+C
primers
6. Tamaño del primer 18-25 bases
7. Tm
8. Longitud y composición de 100-600 pb de distancia
la secuencia a amplificar
Composición de los Primers
Composición de bases:
% GC debe ser similar pues afecta:
Especificidad de Hibridación
Tm y T anillaje
Si tienen diferentes Tm no anillaran a la misma Tº. Máxima
diferencia de 2 – 3ºC
Contenido en (G+C): 50-60% da buenas T de anillaje y
estabilidad de hibridación.
Reglas Generales para el Diseño de Primers
Distribución aleatoria de los nucleótidos
Se prefiere una composición al azar de bases evitando
regiones ricas en G/C o A/T
Si todos los nucleótidos en el 5’ son G o C y en el 3’ A o T,
el extremo 3’ no anillará a la temperatura predicha.
Reglas Generales para el Diseño de
Primers
Parámetros Valores Óptimos
1. Secuencia única Secuencia 3´es crítica para el
anillaje.
2. G/C Clamp en el 3’ 1-2 G/C
3. No ¨self-complementarity¨ < 3 bases contiguas
4. No dímeros de primers < 3 bases contiguas
5. Composición en bases 45-55% del contenido G+C
6. Longitud del primer 18-25 bases
7. Tm
8. Longitud y composición de 100-600 pb de distancia
la secuencia a amplificar
Longitud del Primer
Suficiente para asegurar que la secuencia a la que se anilla en el
templado sea ÚNICA
Pero no tan largo que afecte el Tm y el anillaje de forma radical
Longitud probabilidad de ser único
Tm y Ta más altas
Tamaño mínimo: 15 bases
Tamaño optimo: 18-25 bases
Reglas Generales para el Diseño de
Primers
Parámetros Valores Óptimos
1. Secuencia única Secuencia 3´es crítica para el
anillaje.
2. G/C Clamp en el 3’ 1-2 G/C
3. No ¨self-complementarity¨ < 3 bases contiguas
4. No dímeros de primers < 3 bases contiguas
5. Composición en bases 45-55% del contenido G+C
6. Tamaño del primer 18-25 bases
7. Tm
8. Longitud y composición de 100-600 pb de distancia
la secuencia a amplificar
Melting Temperature (Tm)
50% de la cadena forma una doble hélice estable y el otro
50 % está como cadena sencilla
Depende
Longitud molécula
Secuencia nts
• La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son doble
cadena y la mitad cadena sencilla
• Tm depende de la fuerza iónica de la solución y del tamaño y
composición del primer
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC
Temperatura de Anillaje (Ta)
Es la temperatura a la cual los primers se anillan con el
ADN templado
Ta = Tm_primer – 5°C
La Ta de ambos primers debe ser similar
Reglas Generales para el Diseño de
Primers
Parámetros Valores Óptimos
1. Secuencia única Secuencia 3´es crítica para el
anillaje.
2. G/C Clamp en el 3’ 1-2 G/C
3. No ¨self-complementarity¨ < 3 bases contiguas
4. No dímeros de primers < 3 bases contiguas
5. Composición en bases 45-55% del contenido G+C
6. Tamaño del primer 18-25 bases
7. Tm
8. Longitud y composición de 100-600 pb
la secuencia a amplificar
Tamaño del fragmento a amplificar
Los mejores resultados se obtienen cuando el
producto es de 100 – 600 pares de bases.
Depende del grado de procesividad de la Taq
polimerasa – diferentes tamaños óptimos
5 3
¿Cuándo un’ primer es un primer?
’
5
’ 3
’
5 3
’ ’
3
5 ’
’
En Resumen
Únicos asegura alta especificidad y reproducibilidad
Tamaño 15-25 bases.
Composición de bases promedio de contenido en (G+C)
50-60%; evite regiones largas ricas en (A+T) y (G+C).
Melting Tm entre 55-80 °C.
Diferencia de Tm entre primers 2 – 3 °C.
Minimizar estructuras secundarias internas hairpins y
dímeros.
Ejercicio
• Diseñe un par de primers para la siguiente secuencia. Tome en cuenta todas las sugerencias vistas hasta
el momento, pero trabaje con un longitud de primer de solo 10 pb. El producto final de su trabajo debe ser
los primers señalados sobre la secuencia y, a parte, escritos de 5´a 3´
GATAGATGAGGCCTAGACAGTTAAATCATTTTCTTAAGTGGTAGATGCAACACTAGAATCCTGTTC
CAGGTTTTAACTTTTATGGCTCATTCTGTAACCTTCAAAAAGCTAATTCTAAAATACAGTAGTATGC
CACACAATGGCATTTCTGTCAAGGATGGACCACATATATGACAGAGGTCCCACACTACTATAATG
GAGCTGAAAAATTCCTGTCACCCAGTGACATCATAGCAGTCATAATATTATACACAATGCATTACT
CATGTCTTCGTGGTGATGCTGGTGTAAACCTACTGAAATCCCACTTGTATAAAAGTCTAGCACAT
AGCATTATGTACACTACATAATACTTGATAATGATAATAAACAACTATGTTACTGGTTTATGTATTT
ACTATCTATATTTTATCATTATTTGTGGAGGTGGAAGACAATG
Programas para el Diseño de Primers
Gene Fisher (http://bibiserv.techfak.uni-
bielefeld.de/genefisher/)
GeneWalker (http://www.cybergene.se/primerdesign/)
Web Primer (http://genome-www2.stanford.edu/cgi-
bin/SGD/web-primer)
Primer 3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer/primer3_www.cgi)
Primer3Plus http://www.bioinformatics.nl/cgi-
bin/primer3plus/primer3plus.cgi
CODEHOP (http://www.blocks.fhcrc.org/codehop.html)
Net Primer
(http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/n
etprlaunch.html )
Ejercicio
• Diseñe un par de primers para la secuencia de
ERG11 de C. albicans que codifica para un gen de
resistencia con el programa primer 3 plus.
• Tener en cuenta que el fragmento amplificado no
sea mayor de 450pb y se encuentre al final de la
secuencia.
Búsqueda en NCBI con comandos booleanos
3 4
2
• Reporte y analice las Tm, longitudes de primer y
porcentajes de GC con alguna referencia que le pueda
ayudar a entender si son buenos parámetros para una
pareja de primer.
• El programa oligoanalyzer le permitirá entender la
formación de homodímeros y heterodímeros de la
pareja de primers que escogió.
Página principal de OligoAnalyzer
ANÁLISIS DE HAIRPINS LOOP
ANÁLISIS DE HOMODÍMEROS
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)
Tm = 4(0)+2(4)
Tm = 8°C
ANÁLISIS DE HETERODÍMEROS
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)
Tm = 4(1)+2(3)
Tm = 10°C
Primers
Entrecomo secuencia
a NCBI única.
y realice un primer blast de las
siguientes secuencias de primers.
a. F´ CCCATTAAGAATCCCTGAAACC
b. R´ CCCAAATGATTTCTGCTGGT
Página principal de BLAST de NCBI
INGRESE LAS SECUENCIAS
PRIMERS PROBLEMA EN EL
SENTIDO 5´- 3´
Preguntas de análisis
¿A qué organismo y gen corresponde esta secuencia?,
¿cuál es el tamaño del fragmento a amplificar?
Teniendo en cuenta los parámetros vistos en clase,
¿cree usted que es una buena pareja de primers?,
¿qué condiciones mejoraría?
