Informe de bioquímica

Práctica no. 3. extracción y cuantificación espectrofotométrica del ADN.

Elaborado por:
Jhon Jairo
Camila Rico
Laura Cristina Ocampo
Gabriela Rodríguez Arango
Liliana Carolina Rodríguez Huertas

Presentado a:
Jefferson Steve Aponte

Universidad nacional abierta y a distancia

UNAD
Escuela de ciencias agrícolas pecuarias y del medio ambiente
Programa zootecnia
2023
Introducción
 Objetivos

Generales
 Analizar el ácido nucleico ADN obtenido a partir de células vegetales.
Específicos
 Observar la formación de las hebras del ADN
 Realizar los cálculos para obtener la relación A260/A280 para cada muestra.
  Marco Teórico elaborado en un mapa conceptual

Extracción y cuantificación
espectrofotométrica del
ADN.

Es decir

el ADN está conformado por azúcar, El ARN es una molécula similar

llamado desoxirribosa, bases al ADN.
nitrogenadas adenina A, timina T,
citosina C o guanina G y un grupo
fosfato. Que

este
difiere en monocatenario, es
decir, presenta una hebra de
Se presenta una doble cadena,
ARN.
una hebra de ADN esta
conformada por unidades de
grupos fosfato y azúcar. tiene

un esqueleto formado por

además
grupos alternantes de azúcar
ribosa y fosfato
Las bases nitrogenadas, se
unen a la desoxirribosa y se
forma en dos hebras.

así mismo
Las cuatro bases

El genoma de las células

eucariotas son estructuras de
DNA relaciona con proteínas
son
las cuales se denomina
histonas

. guanina G.
adenina A, uracilo U citosina C

las histonas tienen carga positiva a pH

fisiológico y neutralizan las cargas
negativas del fosfato de los nucleótidos,
lo que confiere estabilidad y permite que
el DNA que mide casi 2 metros de
longitud se empaquete en un núcleo de
10 µm de diámetro.
 Procedimiento
practica 3

 Diagrama de flujo

Extracción y
Parte I. Extracción Parte II. Cuantificación
cuantificación
de ADN espectrofotométrica
espectrofotométrica del
ADN

Retire el botón de AND y

Se usará un vaso de Programe el rehidrátelo en 2 ml de agua
precipitado con una solución espectrofotómetro destilada en un tubo de ensayo,
de lisis, a partir de la mezcla Se debe pesar los g de para realizar la agite hasta no observar el botón
de 50 ml de agua destilada NaCl, adicionar agua y lectura a una de la muestra de ADN vegetal.
1ml de jabón líquido y 2 g de agitar. Hasta disolver el absorbancia de 260
cloruro de sodio. sólido. nm
Llene una cubeta para medición
con agua destilada, tenga en
cuenta que debe ser la misma
utilizada para la rehidratación
Ya preparada la Se adiciona el
del ADN.
solución lisis. Con jabón líquido y se
el bisturí pele y agita sin formar
corte el kiwi en burbujas hasta
pequeños trozos. Transfiera la Utilice como muestra
que se disuelva.
solución de ADN blanca, introdúzcala en el
a otra cubeta para espectrofotómetro y
medición realice el blanqueamiento
Realice este Filtre la del equipo.
espectrofotométric
procedimiento solución hasta
a
durante 10 obtener 5 ml de
Colocar trozos de kiwi en un minutos. filtrado en el
Retire la cubeta Realice la medición a la
mortero y macere el kiwi y tubo de ensayo.
con la muestra, y absorbancia de 260 nm,
adicionar la solución de lisis. registre los datos de
Macerar evitando la formación cambie la longitud
de onda de absorbancia.
de burbujas.
Transfiera 3mL del medición a
filtrado a otro tubo 280nm. Obtenga con sus
de ensayo y compañeros los
adicione 1mL de datos de 4
Incline el tubo a 45° y con Realice el blanqueamiento del muestras
zumo de piña.
ayuda de una pipeta Pasteur adicionales
espectrofotómetro y Retire la
adicione alcohol isopropílico muestra blanca e introduzca la
hasta formar una capa sobre Agite el tubo de ensayo, cubeta con la muestra de ADN
la muestra de 1.5 mL. evitando que las paredes y realice la lectura.
del tubo se impregnen
de la solución.
Observar la formación de Realice los cálculos sobre la relación
A260/A280 para cada muestra y
las hebras del ADN, las
consulte la relación A260/A280 e
cuales tienen un aspecto interprete los resultados obtenidos en
blanco. las 5 muestras.
  Descripción de la practica
La práctica realizada el viernes 17 de marzo, fue sobre la extracción de ácido

desoxirribonucleico de las células vegetales del kiwi, utilizando un método de extracción

químico, el cual nos arrojó los siguientes resultados y materiales.

 Recursos utilizados en la práctica (Equipos / instrumentos)

Materiales

 Vasos de precipitación de 250 y 100 Ml

 Probetas de 250, 100 y 50 mL.

 Mortero.

 Espátulas o cucharas de tamaño pequeño.

 Pipetas graduadas de 5, 10 mL.

 Pipetas Pasteur.

 Tubos de ensayo.

 Embudos

 Papel de filtro

 Bisturí

Materiales suministrados por el estudiante

 Kiwi

 Gasa

 Zumo de piña fresco

  Jabón líquido para lavar platos

Reactivos

 Cloruro de sodio

 Agua destilada

 Alcohol isopropílico frio (-20)

Equipos

 Espectrofotómetro UV-VIS

Procedimiento

1. En un vaso de precipitación prepare una solución de Lisis, a partir de la mezcla de

50ml de agua destilada 1ml de jabón líquido y 2 gramos de cloruro de sodio (NaCl),
Para ello debe pesar los gramos de NaCl, adicionar el agua y agitar con ayuda de la
varilla de agitación hasta disolver completamente el sólido. Luego adicione el jabón
líquido y agite sin formar burbujas hasta que se disuelva homogéneamente, Macerar
suavemente evitando la formación de burbujas, realice este procedimiento durante
10 minutos

Imagen
 2. Una vez preparada la solución de Lisis. Con el bisturí pele y corte el Kiwi en
pequeños trozos y Coloque los trozos del Kiwi en un mortero, y macere el Kiwi
adicionando poco a poco la solución de Lisis preparada anteriormente.

Imagen 1. Maceración del kiwi en un mortero

Imagen 2 y 3. Maceración del Kiwi adicionando poco a poco la solución de Lisis

preparada anteriormente.

3. Filtre la solución obtenida hasta obtener aproximadamente 5mL de filtrado en un

tubo de ensayo, y con la ayuda del embudo de filtración de gravedad y papel de
filtro.
Imagen 1 y 2. Embudo de filtración de gravedad y papel de filtro.

4. Transfiera 3mL del filtrado anterior a otro tubo de ensayo y adicione 1mL de zumo
de piña (recién obtenido y filtrado). Agite suavemente el tubo de ensayo, evitando
que las paredes del tubo se impregnen de la solución.

Imagen 1 y 2. Muestra el zumo de piña (recién obtenido y filtrado).

5. Incline el tubo de ensayo 45° y con ayuda de una pipeta Pasteur adicione lentamente
alcohol isopropílico frío hasta formar una capa sobre la muestra, aproximadamente
 1.5 mL. 20 k. Observar la formación de las hebras del ADN, las cuales tienen un
aspecto blanco.

Imagen 1. Muestra el alcohol isopropílico frio

Imagen 2 y 3. Muestra la inclinación del tubo de ensayo 45°y la pipeta Pasteur

adicionando alcohol isopropílico frío hasta formar una capa sobre la muestra,
aproximadamente 1.5 mL.
Imagen 4. Muestra la formación de las hebras del ADN

6. Retire el botón de ADN y rehidrátelo en 2mL de agua destilada en un tubo de ensayo, agite
suavemente hasta que no observe el botón obtenido de la muestra de ADN vegetal.
Programe el espectrofotómetro para realizar la lectura a una absorbancia de 260 nm

Imagen 1 y 2. Muestra programación el espectrofotómetro para realizar la lectura a una

absorbancia de 260 nm.

7. Llene una cubeta para medición espectrofotométrica con agua destilada, tenga en cuenta
que debe ser la misma utilizada para la rehidratación del ADN y Utilice esta muestra como
muestra blanco, introdúzcala en el espectrofotómetro y realice el blanqueamiento del
equipo.
Imagen 1. Muestra la cubeta para medición espectrofotométrica con agua destilada, Utilizando
esta muestra como muestra blanco, introduciéndola en el espectrofotómetro y realice el
blanqueamiento del equipo.

8. Transfiera la solución de ADN a otra cubeta para medición espectrofotométrica. Realice la

medición de la muestra a la absorbancia de 260 nm, registre los datos de absorbancia,
retire la cubeta con la muestra, y cambie la longitud de onda de medición a 280nm, realice
nuevamente el blanqueamiento del espectrofotómetro y Retire la muestra blanca e
introduzca la cubeta con la muestra de ADN y realice la lectura.
Imagen 1 y 2. Se observa la medición de la muestra a la absorbancia de 260 nm, registrando los
datos de absorbancia, y luego cambia la longitud de onda de medición a 280nm.

 Resultados obtenidos en el laboratorio:

La muestra de ADN se calculó considerando el valor de absorbancia obtenido a una

longitud de onda de 260nm y 280 nm en la cuantificación espectrofotométrica del ADN .

Observando los siguientes resultados de la muestra estudiada:

Técnica de análisis Análisis Absorbancia Muestra con ADN

del blanco
Espectrofotometría 260nm 2.71 3.000 ab

Espectrofotometría 280nm -0.00 0,72 ab

Resultados de nuestra muestra

0,359 ab

 Análisis y resultado.

Al analizar la muestra en el espectrómetro, se realizó la medición del ADN que presenta

absorbancia con un determinado tipo de luz uV a 260 nm de longitud, lo que nos indica que
esta muestra dio como resultado 3.000 ab, la cual presenta la máxima absorbancia, ya que
la cantidad de luz absorbida por la muestra depende de la concentración en la solución.

Sin embargo, al cambiar la longitud de onda de medición a 280 nm, presenta el siguiente
resultado 0,72, lo que se observa que tiene menor absorbancia, lo que indica una posible
contaminación por compuestos aromáticos con proteínas.
Preguntas

 ¿Cuál es la función de los componentes de la solución de Lisis?

La función de los componentes de la solución de lisis, es que, al contener un detergente,

estos rompen las membranas celulares y nuclear, dejando libre el ADN y mantiene el pH de
la solución de manera que el ADN permanezca estable.

 ¿Para qué se usa el zumo de piña, cuál es el compuesto clave y su función

durante el proceso de extracción de ADN?

El zumo de piña contiene un compuesto llamado bromelaína, que es una enzima capacitada
en hidrolizar las proteínas, por lo que es capaz de separar el ADN de las histonas, es decir,
que este proceso ayuda a que el ADN se desempaquete y sea más fácil su extracción.

 Explique las diferencias de solubilidad del ADN en medio salino y alcohólico.

El alcohol reduce la constante dieléctrica del solvente acuoso, induciendo una disminución
en la solubilidad del ADN¸ que, en presencia de altas concentraciones de sales, precipita.

 ¿Qué significa la relación A260/A280 en la cuantificación de muestras de

ADN?

El significado de la relación de A260/A280 es muy estables y se considera que un ADN de

pureza optima tiene un valor entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al
menos una relación A260/280 > 1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica una posible
contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas.
  ¿Qué procedimientos se pueden utilizar para purificar el ADN?

El ADN puede extraerse y purificarse de gran variedad de orígenes: como los tejidos
vegetales, células bacterianas y de mamíferos, tejidos fúngicos, sangre, plasma, suero,
virus, tejidos de mamíferos, hisopos bucales y nasales, matrices de gel, PCR y otras
reacciones enzimáticas.

Procedimiento de Purificar el ADN

 Extracción en fenol-cloroformo
 Cromatografía en celulosa de oligo dT
 Matriz de sílice
 Extracción alcalina
 Centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio (CsCl)

 Consulte dos métodos de extracción de ADN

Uso de resinas de intercambio iónico

Para la extracción del ADN se han creado resinas que son capaces de formar complejos con
el ADN. Al usar las resinas hidrocarbonadas con estructuras rígidas en tres dimensiones
permite que el área se encuentre cargada con alguna sustancia como el dietilaminoetilo que
puede protonarse en medio ácido y quedar cargado positivamente por lo que interacciona
con los grupos fosfatos del ADN. Es decir, que esto es un método directo, que puede
realizarse en un solo tubo y rápido, pero, sin embargo, tiene inconveniente que aíslan las
cadenas sencillas de ADN.

Incubación del lisado para su uso

Una forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperatura entre 90-
100°C y usarlo directamente. Mediante este método el ADN obtenido es de pureza baja y
con aplicación muy reducidas, por lo que no es útil para almacenar el ADN pues los
contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN.
Conclusiones:
Bibliografía:
https://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/noticias-wako/post/10-metodos-de-
extraccion-de-adn/
https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/applications/genomics/dna-and-rna-purification
https://www.bancoadn.org/docs/formulario-control-calidad-muestras.pdf
http://genetica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/Laura%20Mart%C3%ADnez
%20Mart%C3%ADn2015_4_19P21_19.pdf