Universidad de La Serena Laboratorio de Análisis de Alimentos
Facultad de Ciencia Semestre 1/2023
Departamento de Química Grupo 1 y 2
Guía 4
Determinación de proteína cruda
Método Kjeldahl
El método Kjeldahl se basa en una volumetría y se desarrolla en tres etapas:
a) Digestión ácida de una muestra en la que el nitrógeno proteico del alimento es
transformado en sulfato de amonio por acción del ácido sulfúrico concentrado
caliente, punto de ebullición 315ºC, temperatura que puede incrementar con la
adición de sulfato de potasio anhidro para favorecer la velocidad de mineralización.
Es posible emplear catalizadores que aumenta el punto de ebullición del ácido y
aceleran la reacción, los más usuales son: selenio, sulfato de cobre (II), óxido de
mercurio (II) y óxido de titanio (IV).,
b) Una vez mineralizado el nitrógeno al sulfato de amonio, se procede a una destilación
del amoniaco liberado en medio alcalino El amoniaco desprendido se recoge sobre
exceso de ácido bórico.
NH4+ + OH-→NH3↑
H3BO3 +2NH3→(NH4)3BO3
c) Por último, se realiza una titulación, cuantificándolo por volumetría ácido-base.
Obtenido el contenido de nitrógeno en la muestra, el cual es convertido en proteínas
multiplicando por un factor adecuado. Ver Tabla 1.
Por este método no se determina todo tipo de nitrógeno en la muestra, incluyendo bases
nitrogenadas no proteicas como: aminoácidos libres, úrea, óxido de trimetilamina,
trimetilamina, creatina, creatinina, ácidos nucleicos, péptidos; situación que exige en
algunos casos (peces cartilaginosos, moluscos, levadura) la determinación de “prótidos
puros” por separación antes de someter la muestra al método Kjeldahl.
Preparación de soluciones
Hidróxido de sodio 50 %: 500g de hidróxido de sodio en lentejas se disuelven en 1000mL
de agua destilada hervida fría en un vaso de precipitado, una vez disuelto se descarbonata
por la adición de 50mLde solución de hidróxido de bario al 50%.
Ácido sulfúrico 0,100 N: a un litro de agua se le adiciona 2,8mL de ácido sulfúrico
concentrado (d=1,84 g/mL). La disolución obtenida debe ser normalizada frente al patrón
primario carbonato de sodio. En un vidrio de reloj, se seca a 150ºC por una hora carbonato
de sodio p.a., una vez frío se mantiene en desecador hasta su empleo. Se pesan en balanza
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analítica porciones de 200mg a 250mg de la sal y se trasvasijan cuantitativamente a un
matraz de Erlenmeyer de 250mL y se disuelven en 25 a 50mL agua. Se añaden gotas de
indicador anaranjado de metilo 0,1% y se valora con la solución de ácido sulfúrico. La
solución almacenada en envase de vidrio pirex presenta buena estabilidad.
Hidróxido de sodio 0,100 N: se deben tomar 8g de una solución límpida de hidróxido de
sodio al 50%, y disolverlos en un litro de agua destilada previamente sometida a ebullición
por algunos minutos, el agua es enfriada a la temperatura ambiente antes de la introducción
de los 8g de la solución de hidróxido de sodio al 50%; de esta manera se obtiene una
solución exenta de carbonatos, la cual debe ser normalizada frente a patrón primario de
ftalato ácido de potasio (KHC8H4O4), peso equivalente 204,14. En un vidrio de reloj se
seca a 110ºC durante dos horas la sal p.a., una vez frío se mantiene en desecador hasta su
empleo. Se pesan en balanza analítica porciones de 500 a 900mg y se disuelven en 25 a
50mL de agua. Se añaden dos gotas de fenolftaleína 0,1% y se valora con la base hasta el
primer color rosa que persiste durante medio minuto. La solución debe almacenarse en
frasco de vidrio con tapón plástico o de goma, la estabilidad de las soluciones de hidróxido
de sodio 0,100 N es limitada, exigen renormalización después de un periodo de almacenaje.
Ácido bórico al 5%: 50g de ácido bórico p.a. se disuelven en 1000mL de agua destilada.
Se facilita la disolución por calentamiento.
Tabla 1 Factores de conversión de nitrógeno en proteínas.
Alimentos Nitrógeno en proteínas Factor
(%)
Harina de trigo, 17.54 5.70
cereales
Trigo entero, centeno, 17.15 5.83
cebada, avena
Arroz 16.81 5.95
Maní, nueces de Brasil 18.32 5.46
Almendras 19.31 5.18
Soja 17.51 5.71
Semillas oleaginosas 18.87 5.30
Leche y derivados 15.70 6.38
Carne y derivados 16.00 6.25
Clara de huevo 14.93 6.70
Yema de huevo 15.11 6.62
Huevo entero 14.97 6.68
Gelatina 18.02 5.55
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Procedimiento
Se pesan en balanza analítica porciones de muestra que posean entre 30 a 60 mg de
nitrógeno, de acuerdo con le probable % de proteínas. La Tabla 2 puede orientar sobre el
peso de muestra a tomar. La muestra pesada se coloca en un matraz de kjeldahl de 800mL,
se agregan entre 10-15g de sulfato de potasio anhidro y 25mL de ácido sulfúrico
concentrado. Si el catalizador a usar es selenio, se suspende 200mg se selenio en polvo en
1000mL de ácido sulfúrico, si se emplea sulfato de cobre (II) se adicionan 0,15g al matraz,
y si se emplea oxido de mercurio (II) se adiciona 0,7g.
Tabla 2 Porcentajes de nitrógeno en relación al contenido de proteínas.
% proteínas (N x 6.25) Nitrógeno en proteínas (%) Peso Muestra (g)
5.0 0.8 3.75 – 7.50
10.0 1.6 1.88 – 3.75
15.0 2.4 1.25 – 2.50
20.0 3.2 0.95 – 1.90
25.0 4.0 0.75 – 1.50
30.0 4.8 0.62 – 1.25
35.0 5.6 0.54 – 1.07
40.0 6.4 0.47 – 0.94
45.0 7.2 0.42 – 0.83
Se mezcla suavemente por rotación y se coloca el matraz con el cuello inclinado en 45º
sobre una batería de calefacción. Se calienta suavemente hasta que cese la formación de
espuma, posteriormente se aumenta la intensidad del calentamiento, debe agitarse de vez
en cuando con movimientos de rotación para arrastrar las partículas al seno del ácido. Una
vez obtenido un líquido claro después de la digestión completa de la muestra, se debe
continuar en ebullición por alrededor de una hora. La mineralización debe realizarse en
campana extractora de gases. Una vez frío el contenido del matraz de kjeldahl, debe
comprobarse que el residuo no ha cristalizado, pues esta situación puede indicar una posible
pérdida de nitrógeno. Se diluye el mineralizado, con 100-150mL de agua destilada y se
adiciona perlas de ebullición. Se conecta el matraz de Kjeldahl al equipo destilador y se
libera el amoniaco por adición de 100mL de hidróxido de sodio al 50%, la solución debe
quedar básica. El destilado se recoge en un matraz de Erlenmeyer de 500mL, el extremo
del refrigerante debe estar sumergido en la solución receptora, la cual puede estar
constituida por:
a.- 50mL de H2SO4 0,100 N más gotas de indicador mixto rojo de metilo-azul de metileno,
el cual vira de violeta a verde a pH 5,4. Se valora el exceso de ácido con hidróxido de sodio
0,100 N hasta la coloración original violeta.
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b.- 50mL de H3BO3 al 5% más gotas de indicador mixto. Se debe mantener el matraz en
un baño frío de hielo y agua, ya que el borato amónico que se forma es fácilmente volátil.
Finalizada la destilación se valora el borato de amonio directamente con H2SO4 0,100 N
hasta la coloración original violeta
Cálculos
Para el caso a, tenemos:
((50𝑚𝐿 × [𝑁𝐻2𝑆𝑂4 ]) − (𝑔𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑚𝐿 × [𝑁𝑁𝑎𝑂𝐻 ]) × 1.4
%𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 = × 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 (𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 2)
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑔
Para el caso b, tenemos:
1,4 × 𝑔𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑚𝐿 𝐻2𝑆𝑂4 × [𝑁𝐻2𝑆𝑂4 ]
%𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 = × 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 (𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 2)
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑔
Referencias
Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern.
Fresenius, Zeitschrift f. anal. Chemie 22, 366–382 (1883).
[Link]
