TEMA 6: LAS TÉCNICAS DE PCR
6.1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERSA (PCR)
• Es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales
de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.
• Se diseño en 1983 por Kary Mullis, un bioquímico norteamericano.
• Se han desarrollado diferentes variantes:
- Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción.
- Amplificar fragmentos de ARN.
- Cuantificar la concentración de una molécula concreta de acido nucleico presente en una
muestra.
6.2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR
• Dos problemas para solucionar:
- Conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie el fragmento que nos
interese.
- Conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la temperatura
elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde.
• La principal ventaja de la PCR es su gran sensibilidad. Pero el principal inconveniente es el
problema de la contaminación ambiental. Para minimizarlo, hay que tener un buen diseño de
laboratorio y de la técnica.
6.2.1. LOS CEBADORES O PRIMERS
• Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que
flanquean el fragmento que se quiere amplificar.
• Son dos que se tienen que unir a la cadena del ADN:
- El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´-> 5´ se denomina
cebador F o forward.
- El cebador que se va a unir a la hebra molde en sentido 5´->3´se denomina cebador R o
reverse.
• Un juego de cebadores define y delimita la región diana de una molécula de ADN que se va a
amplificar.
6.2.2. ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES
• Para que la ADN polimerasa puede sintetizar cadenas nuevas de ADN es necesario que el ADN
molde sea monocatenario. Cada ciclo de la PCR tenga que comenzar por una fase de
desnaturalización por calor, para las ADN polimerasas convencionales (se desnaturalizan
también) se inactivan a temperaturas elevadas.
• Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de un grupo especial de
arqueobacterias extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas,
pudiendo replicar su ADN sin desnaturalizarse.
• Las ADN polimerasa termoestable se nombran de acuerdo con el organismo en el que se han
aislado, con la primera letra mayúscula del género y las dos primeras letras minúsculas de la
especie. Por ejemplo, la polimerasa termoestable aislada del organismo Thermus aquaticus se
denomina Taq ADN polimerasa.
6.2.3. EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR
• Se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación. Consta de 3 fases:
1. Desnaturalización del ADN molde.
2. Hibridación de los cebadores.
3. Extensión de los cebadores.
• Al final de cada ciclo, se obtiene una molécula de ADN nueva por cada fragmento de ADN
molde presente en la mezcla de reacción.
FASE 1. DESNATURALIZACIÓN
➢ La desnaturalización debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura suficientemente
elevada para garantizar la desnaturalización completa de la ADN molde, sin prolongarse para
evitar la inactivación de la ADN polimerasa.
➢ Si el tiempo o la temperatura son superiores, la polimerasa pierde actividad por
desnaturalizarse.
➢ Normalmente, la fase se realiza a 94-95ºC durante 15-30 segundos.
FASE 2. HIBRIDACIÓN
➢ La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing) a temperatura de entre 50 y
65ºC. el valor concreto de la Tm de los cebadores suele estar entre Tm +/- 5ºC.
➢ El tiempo estándar de esta fase es de 30-60 segundos.
FASE 3. EXTENSIÓN
➢ Durante esta fase, la ADN polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3´.
➢ La temperatura optima de polimerización de Taq ADN polimerasa es de 72ºC.
➢ El tiempo de esta fase esta condicionado por la enzima y la longitud del fragmento que se
quiere amplificar.
➢ El tiempo de extensión es de entre 30-45 segundos para amplificar.
6.2.4. PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN DE LA PCR
• Tras un numero de n repeticiones del ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de productos
amplificación, unos deseados y otros no deseados, pero en proporciones muy diferentes.
• Los productos amplificados que coinciden con el fragmento que queremos amplificar se les
llama “amplicones”.
• En cada ciclo, el numero de productos no deseados aumenta aritméticamente, mientras que
el numero de amplicones se hace exponencialmente.
6.3. PCR A TIEMPO FINAL
• PCR estándar convencional.
• PCR anidada.
• PCR múltiple.
• RT-PCR
1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
➢ Es la forma mas simple de PCR, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único
par de cebadores.
➢ Tres aspectos para profundizar para entender su funcionamiento:
- La composición de la mezcla de reacción.
- La preparación de las muestras.
- La programación de termociclador.
- El análisis de los productos amplificados.
La mezcla de reacción
▪ Contiene todos los reactivos necesarios para que la PCR se desencadene de
forma adecuada.
▪ Consiste en un tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos
necesarios para la replicación del ADN. El tampón aporta el pH y la concentración
salina adecuados para la óptima actividad de la ADN polimerasa con un máximo
de fidelidad.
▪ Suelen ser tampones a base de Tris con cloruro potásico (KCl) a un pH entre 8.3
y 9.0. Normalmente, se suministra en forma concentrada (2x, 5x o 10x) con la
ADN polimerasa.
▪ Los reactivos que se disuelven en el tampón son:
1- Cloruro magnésico.
2- Desoxinucleótidos trifosfato.
3- Cebadores.
4- ADN polimerasa.
5- ADN molde.
1- CLORURO MÁGNESICO
✓ Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg 2+) como
cofactor.
2- DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATO
✓ Debe contener los 4 desoxinucleótidos para incorporarlos a las cadenas en crecimiento.
✓ Los 4 dNTP deben estar presentes en la misma concentración.
✓ Se suministran concentrados.
3- CEBADORES
✓ La concentración de ambos debe ser la misma.
4- ADN POLIMERASA
5- ADN MOLDE
✓ Es un componente de la mezcla.
✓ Se utiliza ADN purificado.
6- OTROS ADITIVOS Y POTENCIADORES
✓ Su uso se debe limitar a los casos problemáticos, estudiando su efecto de forma
experimental.
Preparación de las muestras
▪ Ajuste del volumen de reacción: decidir el volumen final de la mezcla que
vamos a preparar. Normalmente, este volumen es de 25 ul o 50 ul. Los
componentes se suministran concentrados, hay que calcular los volúmenes
de cada reactivo que se añadirá a la mezcla y el volumen final de la mezcla
de reacción se completa con agua estéril grado PCR.
▪ Mezcla <máster>: es preferible preparar una única mezcla de reacción
llamada mezcla máster (master mix) que incluya todos los componentes,
excepto el ADN molde. La cantidad de cada componente se calcula
multiplicando la cantidad necesaria para una reacción por el numero de
muestras que se van a procesar simultáneamente + 1, teniendo en cuenta
que en el número de muestras hay que incluir los controles + y -. Una vez
completada la máster mix, se reparte la cantidad adecuada a cada tubo de
reacción y se añaden los respectivos ADN molde.
n muestras + 1 + 1 control positivo + 1 control negativo = n + 3
▪ Control positivo y negativo: en cada tanta se prepara un control + y otro -.
o Control +: es un tubo con mezcla máster al que se añade ADN
molde control que contiene el fragmento que se quiere
amplificar.
o Control -: es un tubo con mezcla máster en el que se
sustituye el ADN molde por agua estéril de grado PCR.
Programación del termociclador
▪ El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de PCR.
Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos
de incubación. La programación incluye tres etapas, que terminan con una
incubación final para el mantenimiento de los productos de la reacción hasta
su retirada de la máquina.
1. Desnaturalización: consiste en calentar la mezcla de reacción a 94-95ºC
durante varios minutos para asegurar la completa desnaturalización de
todas las moléculas bicatenarias de ADN.
2. Ciclos de replicación: se programan las temperaturas y los tiempos de
incubación (desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión) y
se programa el numero de veces que se va a repetir el ciclo. El numero
de ciclos de repetición va a depender del numero inicial de copias del
fragmento que se quiere amplificar. Cuanto mas abundante sea el
fragmento que se va a amplificar, menor número de ciclos de replicación
necesitaremos. El número de ciclos oscila entre 25 y 35, aunque para
moldes escasos o problemáticos se pueden aumentar hasta 40. Por
encima de 40 ciclos, aumenta considerablemente productos no
deseados inespecíficos y la ADN polimerasa pierde actividad por
desnaturalización.
3. Extensión final: consiste en una incubación a temperatura óptima de
polimerización de la ADN polimerasa durante 5-10 minutos, para
asegurarnos de que todos los productos de PCR están completos y en
forma de doble hélice.
4. Mantenimiento: última incubación a 4ºC sin limite de tiempo para
mantener las muestras hasta que se retiren del termociclador, anulando
la actividad de la enzima.
Análisis de los productos amplificados
▪ Una vez finalizada la reacción de PCR se analiza el resultado mediante una
electroforesis en gel de agarosa al 0.5-2.0 % junto con un marcador de
tamaños.
▪ La presencia de una única banda del tamaño adecuado indica que la PR ha
funcionado correctamente. La observación de varias bandas de distintos
tamaños indica la presencia de productos de amplificación no deseados. Por
lo que habrá que repetir la reacción variando la programación del
termociclador o la composición de la mezcla de reacción hasta conseguir un
resultado específico.
Resultado positivo
o En cada tanda de PCR se procesa simultáneamente un control
negativo o blanco, en el que el ADN molde se sustituye por agua
estéril de grado PCR. En el gel de la electroforesis, debe aparecer
limpia, sin bandas. Si se detecta alguna banda, indicaría
contaminación de algún reactivo o pipeta, lo que invalida los
resultados de la tanda.
Resultado negativo
o La ausencia de banda específica en una muestra problema indica,
que la muestra no contiene la secuencia diana y, por tanto, el
resultado sería negativo. O puede deberse a que algún reactivo
empleado puede no funcionar correctamente o la muestra puede
contener inhibidores de la PCR.
o El control positivo de la mezcla sirve para validar la mezcla de
reacción. Si todos los reactivos funcionan bien, en el control positivo
se observará la banda específica. Si hay algún problema en la mezcla
máster, se invalida la muestra. Para descartar la presencia de
inhibidores en una muestra hay que realizar un control positivo de la
muestra, en la que se amplifica un gel control presente en la
muestra. Si este control amplifica bien, se confirma que la muestra
es negativa para la secuencia que se estudió inicialmente. Si el
control positivo de la muestra no amplifica, la muestra no es apta
para PCR.
6.3.2. MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR
• La PCR estándar se utiliza mayoritariamente con fines diagnósticos, amplificando secuencias
menores de 3.5 kb.
• El intento de minimizar la producción de productos no deseados o la necesidad de amplificar
fragmentos de gran tamaño o de variantes o modalidades de la PCR estándar:
- PCR con inicio caliente.
- PCR de grandes fragmentos.
- PCR de alta fidelidad.
PCR CON INICIO EN CALIENTE (hot start-PCR)
➢ Elimina la actividad de la enzima a bajas temperaturas para evitar la aparición de productos de
amplificación no deseados.
➢ Usando varias estrategias:
- Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa: es la forma mas sencilla. Se prepara
sin el ADN polimerasa, se dispensa en los tubos y se colocan en el termociclador. Se añade
la enzima tubo a tubo una vez que la temperatura del termociclador este por encima de
65ºC. es engorrosa y aumenta el riesgo de contaminación.
- Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla: incluyendo el ADN
polimerasa en el interior de esferas de cera, de manera que cuando se alcanzan
temperaturas elevadas, al fundirse la cera, la enzima se libera a la mezcla de reacción.
- Suministrando la ADN polimerasa inactiva: bloqueando la enzima con un anticuerpo
específico que se libera cuando alcanza la temperatura elevada.
PCR DE GRANDES FRAGMENTOS
➢ Es una variante de la PCR estándar que permite aumentar el rendimiento cuando se amplifican
fragmentos de entre 5 y 35 kb.
➢ El diseño de estas PCR afecta a la composición de la mezcla de reacción y a la programación
del termociclador.
La mezcla de reacción
▪ Las variaciones de composición son:
o Mezcla de ADN polimerasas: es la utilización de una mezcla de dos ADN polimerasas
termoestables. Una es ADN polimerasa mayoritaria (sin actividad correctora) y la
otra es ADN polimerasa minoritaria (con potente actividad correctora, actividad
exonucleasa 3´->5´).
o Uso de aditivos: se suelen incluir aditivos como el glicerol, que estabiliza las ADN
polimerasas y el dimetilsulfóxido (DMSO), que favorece la desnaturalización.
o Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción: favorecen la eficiencia
de la amplificación de fragmentos largos.
La programación del termociclador
▪ Es evidente que para polimerizar con éxito fragmentos de gran tamaño en el momento
de programar el termociclador hay que aumentar considerablemente el tiempo de
extensión de cada ciclo. Se puede programar tiempos de extensión de hasta 25
minutos. Corremos el riesgo de que los tiempos de desnaturalización se acorten (2-10
segundos) para minimizar la inactivación de las polimerasas.
PCR DE ALTA FIDELIDAD
➢ Clonación.
➢ Queremos obtener fragmentos de ADN perfectos sin ningún error.
➢ Conviene realizar variaciones de la mezcla de reacción como:
- Utilización de ADN polimerasas termoestables.
- Buscar condiciones óptimas de la enzima ajustando el pH óptimo y la concentración de
magnesio (Mg 2+).
6.3.3. OTRAS TÉCNICAS DE PCR A TIEMPO FINAL
• PCR ANIDADA (nested-PCR): es la realización de dos reacciones de PCR acopladas, de manera
que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera. Se
usa cuando el rendimiento de la PCR es bajo (poca cantidad) o para aumentar la especificidad
cuando no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados. Los cebadores usados son
distintos:
- En la primera PCR, se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que incluye
la región de interés. Se denominan cebadores externos.
- En la segunda PCR, marcan el fragmento que realmente nos interesa. Se denominan
cebadores internos.
• PCR MÚLTIPLE (multiplex-PCR): consiste en la amplificación de varias secuencias diana a la vez,
en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR. Se consigue utilizando varios juegos de
cebadores, cada uno específico para amplificar una región diferente. Estas parejas de
cebadores tienen que cumplir varios requisitos:
- La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su ADN molde debe ser
similar.
- Los amplicones generados por cada pareja de cebadores deben tener un tamaño diferente
para poder separarse en la electroforesis y visualizarse.
- No pueden ni los cebadores ni los amplicones formar dímeros entre sí.
La aplicación mas sencilla es la incorporación de un control positivo interno. Este consiste en
añadir a la mezcla de reacción una pareja de cebadores diseñados para amplificar una
secuencia control que tiene que estar presente en el ADN molde problema. Tres resultados
serían posibles:
- Positivo: se observan dos bandas en la electroforesis, la especifica de la secuencia que se
esta estudiando y la del control positivo.
- Negativo: se visualiza solo la banda del control positivo.
- PCR no válida: no se observa ninguna banda, lo cual indica que la muestra contiene
inhibidores de la PCR.
• PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT-PCR): permite amplificar y analizar moléculas de ARN.
Tiene dos etapas:
- Síntesis de ADNc mediante retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa.
- Una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo amplifica.
Estos dos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo tubo.
6.4. PCR A TIEMPO REAL
• Se sigue el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de
manera que la detección de amplicones se realiza ciclo a ciclo.
• Se realiza en un termociclador a tiempo real que incorpora un lector de fluorescencia que
puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier momento
de la PCR.
• Las ventajas de la PCR a tiempo real sobre la PCR a tiempo final son:
- Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra.
- Resultados más fidedignos. Minimiza los problemas de contaminación, ya que se realizan
en tubos cerrados.
- Permite valorar el ADN diana inicial presente en la muestra.
• Para entender el funcionamiento, estudiaremos la cinética de la amplificación y los sistemas
fluorescentes de detección de amplicones.
6.4.1. CINÉTICA DE LA AMPLIFICACIÓN
• La curva de amplificación es una curva de tipo sigmoide que se obtiene al representar la
emisión de fluorescencia en cada ciclo de PCR respecto del número de ciclo en que se produce.
• Tres fases:
- Zona o fase de ruido: los amplicones están por debajo del nivel de detección del aparato.
- Zona o fase de crecimiento exponencial.
- Zona o fase de meseta.
*UMBRAL: fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR Green y sondas de hibridación.
*Ct (Cp): número de ácidos en donde la fluorescencia supere el umbral.
6.4.2. SISTEMAS DE FLUORESCENTES DE DETECCIÓN DE AMPLICONES
• Pueden ser de dos tipos:
- Independientes de secuencia.
- Específicos de secuencia: principio de transferencia de energía fluorescente (FRET).
▪ Sondas de hidrólisis o sondas de TaqMan: son oligonucleótidos sintéticos que tiene
fluorocromo donante, denominado notificador (reporter) en el extremo 5´y un quencer
(fluorescente o no) en el extremo 3´.
▪ Balizas moleculares: (molecular beacons) son un tipo especial de sondas
oligonucleotídicas especificas para PCR a tiempo real.
▪ Sondas FRET: son parejas de sondas que hibridan dentro del amplicón, en regiones
adyacentes.
6.4.3. APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL
• PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR): permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula
de ácido nucleico en una muestra. El termociclador a tiempo real detecta el llamado punto de
corte (Cp) o ciclo umbral (Ct). En la curva de amplificación el Cp es el ciclo en que se pasa de la
zona de ruido a la de crecimiento exponencial, mediante un giro brusco hacia arriba. El Cp de
una muestra es inversamente proporcional a la cantidad inicial de la molécula diana en la
muestra. Cuanto mayor sea el numero de secuencias diana en la muestra, menos ciclo de PCR
serán necesarios para alcanzar el Cp.
- Cuantificación absoluta: expresan el resultado final en unidades de concentración o en
numero de copias por unidad de volumen. Este tipo de cuantificación requiere la
elaboración de una curva de calibración con patrones que tengan una concentración
conocida.
- Cuantificación relativa: consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en
relación con la concentración de un gen de referencia que esta presente en todas las
muestras con un numero constante de copias.
• Curvas de fusión y detección de mutaciones: la curva de fusión es la gráfica que se obtiene
representando la fluorescencia frente a la temperatura. La curva se realiza una vez que ha
concluido la PCR. Para obtenerla, se baja la temperatura hasta un punto que garantice que
todo el ADN se encuentre en forma de doble hélice (60-65ºC). A partir de aquí, la temperatura
se va elevando lentamente hasta alcanzar la temperatura de desnaturalización (95ºC) al
tiempo que se monitoriza continuamente la variación de la intensidad de fluorescencia. Al
principio, la fluorescencia es máxima y va disminuyendo lentamente hasta llegar al punto de
fusión del amplicón, en el que se produce una disminución brusca de la fluorescencia.
Para visualizar mejor el punto de fusión, el software del termociclador calcula otra curva
basada en la derivada de la anterior, denominada curva de picos de fusión, porque en esta
curva el punto de fusión del amplicón se visualiza como un pico.
Si al finalizar la PCR se han sintetizado también productos no deseados, dado que estos tienen
puntos de fusión distintos que el amplicón, en la curva de fusión aparecerán varios puntos de
inflexión y en la curva de picos de fusión aparecerán varios picos.
Actualmente se están utilizando las curvas de fusión obtenidas con sondas fluorescentes únicas
o parejas de sondas FRET para detectar mutaciones puntuales. La detección se basa en la
disminución importante que experimenta la Tm del híbrido cuando en la secuencia diana hay
una base desapareada (mutación puntual).
Cuando se usa una sonda única esta debe cubrir la región de la mutación. Al inicio de la curva,
la fluorescencia es máxima porque la sonda esta unida al amplicón, y a medida que aumenta
la temperatura la fluorescencia disminuye porque la sonda se va despegando.
3 tipos de curvas de picos de fusión:
- Curva con un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión de
la sonda (indica que el ADN molde no presenta mutaciones).
- Curva con un único pico de fusión a una temperatura menor al punto de fusión de la sonda
(indica la presencia de una mutación en homocigosis).
- Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura del punto de fusión de la sonda y el
otro a una temperatura menor (indica una mutación en heterocigosis).
