UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DIAGNOSTICO MOLECULAR
PRÁCTICA 1
EXTRACCIÓN Y ELECTROFORESIS ROTAVIRUS.

Alumna: Yessenia Nohemi Gómez Martínez

Matrícula: 1841528 Grupo: 461
Sexto Semestre
Profesor: M. C. José Alejandro Rodríguez García

San Nicolás de los Garza Nuevo León, domingo 28 de noviembre 2021.

 1. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE
AGENTES INFECCIOSOS
Fase 2: Analizar y desarrollar técnicas moleculares específicas de ácidos
nucleicos y proteínas.
1. Elemento de competencia: Evaluar técnicas moleculares en el ambito médico
para el diagnóstico de patógenos y/o enfermedades genéticas.
2. Propósito de la práctica
Que el estudiante:
• Evalúe el tipo de protocolo de extracción y purificación de ácidos nucleicos para
el diagnóstico de patógenos dependiendo de la muestra biológica a utilizar.
• Realice la metodología correctamente sin errores.
• Verifique de forma cualitativa y cuantitativa los resultados de la técnica de
extracción y purificación de ácidos nucleicos.
• Desarrolle los cálculos matemáticos para obtener la concentración de ADN ó
ARN para su utilización en las técnicas de diagnóstico molecular.
3. Introducción
La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso en cualquier técnica de
diagnóstico molecular. Los protocolos de extracción y purificación deben asegurar
la obtención de un ácido nucleico (ADN ó ARN) en buena cantidad, calidad y
pureza. Estas tres características dependerán del tipo de muestra biológica a
procesar, la estructura de la célula ó patógeno y el tipo de ácido nucleico a
purificar (1). Por tal motivo, es importante asegurarse de la buena calidad del
ácido nucleico purificado para evitar falsos negativos en el diagnóstico, ya que la
presencia de inhibidores como proteasas, sales y compuestos orgánicos afectan la
función de las enzimas utilizadas en las técnicas moleculares.
Existen una gran variedad de métodos tradicionales y kits comerciales para la
extracción y purificación de ácidos nucleicos utilizados en el diagnóstico de
agentes infecciosos. En los métodos tradicionales la mayoría utiliza solventes
orgánicos para lisar al patógeno y mediante una desnaturalización de las
proteínas, purificar los ácidos nucleicos; mientras que en los kits comerciales la
purificación se realiza utilizando columnas de cromatografía para asegurar una
mejor calidad y pureza (2).
En esta práctica se realizará una extracción y purificación de ARN de rotavirus, el
cual es un patógeno causante de gastroenteritis en humanos y animales. El
síntoma principal es diarrea produciendo una deshidratación severa y
posteriormente la muerte si el paciente no es atendido oportunamente. El genoma
de estos virus es de doble cadena dividido en 11 segmentos protegido por tres
capas de proteínas (3). Los segmentos pueden ser observados mediante una
electroforesis en geles de poliacrilamida, donde se separan formando 4 grupos
con 4, 2, 3 y 2 bandas cada uno. Debido a que este patrón de migración es único
entre todos los virus entéricos, esta técnica es suficiente para el diagnóstico
directo de rotavirus en muestras de heces fecales diarreicas (4).
4. Material para el desarrollo de la práctica
- Muestra biológica
- Reactivos para extracción y purificación de ARN: Buffer de fosfatos (PBS), Buffer
de lisis (EDTA, SDS, -mercaptoetanol), Fenol, Cloroformo, Alcohol etílico
- Tubos de microcentrífuga de 1.7 ml
- Gradillas para microtubos
- Guantes de látex o nitrilo
- Reactivos para gel de poliacrilamida: Poliacrilamida 30%, Tris-HCl 2M pH 8.8,
Agua bidestilada, Persulfato de amonio 10%, TEMED (N,N,N´,N´-
Tetrametiletilendiamina)
- Moldes para preparar gel de poliacrilamida: vidrios, peine, sujetador
- Micropipetas de 5 ml, 1 ml, 200 l y 20 l Puntillas para micropipeta de 5 ml, 1
ml y 200 l
- Vaso de precipitado de 50 ml
- Azul de bromofenol-Sacarosa 40% y buffer de corrimiento PAGE 1X (TrisGlicina)
- Reactivos para tinción de ARN con Nitrato de plata: Solución fijadora (Alcohol
etílico 10%-ácido acético 0.5%), Solución de nitrato de plata 10 mM, Solución
reveladora (NaOH 750 mM-Formaldehído 1.5%), Solución de ácido acético 5%,
Agua bidestilda
- Recipiente de plástico para gel
- Vortex
- Microcentrífuga
- Cámara de electroforesis vertical
- Fuente de poder
5. Procedimientos para el desarrollo de la práctica
Etapa I: Purificación de ARN viral

1. Preparar un 1 ml de una suspensión de heces fecales al 20% en un tubo

de microcentrífuga de 1.5 ml utilizando PBS como diluyente.
2. Homogenizar en vortex (agitación) durante 2 minutos.
3. Centrifugar a 14,000 rpm por 5 minutos.
4. Tomar 200 μl del sobrenadante y depositarlos en un tubo de 1.5 ml limpio y
previamente etiquetado.
5. Adicionar 200 μl de buffer de lisis.
6. Homogenizar en vortex por 2 minutos.
7. Agregar 200 μl de Fenol saturado con Tris-HCl pH 8.0.
8. Homogenizar en vortex por 2 minutos.
9. Adicionar 200 μl de Cloroformo.
10.Homogenizar en vortex por 2 minutos.
11.Centrifugar a 14,000 rpm por 15 minutos.
12.Transferir de 300-400 l de la fase acuosa a un tubo limpio de 1.5 ml,
previamente etiquetado.
13.Evitar arrastrar la capa intermedia que contiene proteínas desnaturalizadas
(contaminantes).
14. Almacenar a -200C.
Etapa II: Electroforesis de ARN viral
1. Preparar un gel de poliacrilamida a una concentración final de 10%
mezclando los reactivos en un vaso de precipitado de 50 ml, en el orden
que se indica en la tabla:

2.Trasladar el gel a una cámara de electroforesis vertical y preparar el sistema

adicionando 300 ml de buffer de corrimiento 1X (Tris-Glicina).
3.Preparar una mezcla con 5 l de ARN y 3 l de azul de Bromofenol.
4.Depositar toda la mezcla en el pozo del gel.
5.Conectar la cámara de electroforesis a una fuente de poder y realizar el
corrimiento a 110 Volts por 3 horas.

Etapa III: Tinción de ARN viral con Nitrato de plata

1.Al terminar la electroforesis el gel se coloca en un recipiente de plástico con 100
ml de solución fijadora para iniciar la tinción.
2.Agitar por 30 minutos.
3.Retirar la solución fijadora por decantación y añadir 100 ml de solución de nitrato
de plata, cubrir el recipiente con papel aluminio.
4.Agitar por 30 minutos.
5.Decantar la solución de plata y lavar una vez con agua bidestilada.
6.Retirar 50 ml de solución reveladora e inmediatamente agitar el gel para que no
se manche, ya que la solución se vuelve obscura por la reacción del nitrato de
plata y la solución reveladora.
7.Agitar el gel suavemente hasta la aparición de las bandas de ARN (café oscuro),
esperar máximo10 minutos.
8.Retirar la solución reveladora y adicionar 50 ml de solución de ácido acético 5%,
agitando el gel por 3 minutos.
9.Retirar la solución de ácido acético y lavar 3 veces el gel con agua bidestilada.
10.Dejar el gel en agua bidestilada para analizar los resultados.

Análisis de Resultados
1. Incluir una foto del gel de poliacrilamida con los resultados de la purificación de
ARN viral, señalando el patrón electroforético de rotavirus.
Lecturas por Espectofotometría de 5 extracciones RNA de Coronavirus, se utilizó
el kit de omega Bio-Tek de extracción de RNA:
1. Muestra 1: concentración RNA 283.5 ng/uL; pureza 1.76.
2. Muestra 2: concentración RNA, 100.6 ng/uL; pureza 1.18.
3. Muestra 3: concentración RNA, 73.4 ng/uL; pureza 1.70.
4. Muestra 4: concentración RNA, 468.39 ng/uL; pureza 2.45.
5. Muestra 5: concentración RNA, 106.89 ng/uL; pureza 2.01.

Electroforesis de muestra de rotavirus, averiguar que tipos de patrones en

electroforesis existen en rotavirus.
6. Análisis de resultados
1. Incluir una foto del gel de poliacrilamida con los resultados de la purificación de
ARN viral, señalando el patrón electroforético de rotavirus
Figura 1. Perfiles de migración electroforética de rotavirus aislados en
Nigeria entre 2008 y 2013. Los geles de poliacrilamida al 10% se visualizaron
después de tinción de plata. Los segmentos de ARN muestran la distribución
clásica de bandas de rotavirus. Diez electroferotipos se observan y se presentan
tres controles mixtos (M).
Discusión
El genoma del rotavirus este compuesto de 11 segmentos de ARN bicatenario,
que codifican seis proteínas estructurales y cinco no estructurales. Las proteínas
estructurales (VPs) forman parte de la partícula viral mientras que las proteínas no
estructurales (NSPs) colaboran en la replicación viral, morfogénesis, restricción del
hospedero, secuestro de la maquinaria biosintética celular y en la patogenia. Se
reconoce un perfil de rotavirus como aquél en el cual existen 4 segmentos de gran
tamaño, 2 de tamaño medio, un triplete en el cual los segmentos migran muy
cercanos y que no siempre es bien resuelto, y 2 segmentos de bajo peso
molecular (Giambiagi, 2011). En la figura 1, en los carriles 1,2,4,5,6,7,8,9 y 10 se
pueden observar los segmentos característicos de un perfil de rotavirus. Varias
cepas de humanos, que no comparten el antígeno común de grupo de los
rotavirus grupo A, tienen un electroferotipo distinto al descripto anteriormente;
algunos segmentos de las muestras no forman un triplete en el cual los segmentos
migran muy juntos, el cual es característico del electroferotipo del grupo A. En los
rotavirus grupo A han sido identificados 14 serotipos diferentes de VP7 (serotipos
G) que comprenden rotavirus humanos y animales (Giambiagi, 2011), por lo tanto,
los carriles en los cual no se aprecian los tripletes se infiere que son diferentes
serotipos.
También se puede apreciar en los diferentes carriles que la banda 11 presenta
menor migración electroforética (figura 1, carril 4) por lo que se denominan de
electroferotipo "corto", para diferenciadas del perfil más común al cual se le
conoce como electroferotipo "largo" (Gonzalez, 1989).
Los carriles 7, 9 y 10 presentan un bandeo típico de rotavirus, sin embargo, su
visualización se ve afectada, esto podría deberse según menciona el Instituto
Nacional de Salud en el Manual de Procedimientos de Electroforesis a un mal
teñido, ya el colorante puede quedar retenido fuertemente en el gel generando un
fondo oscuro por sobretinción que impediría la visualización.
La electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN por su tamaño y al
observar las bandas obtenidas de la PCR, se puede visualizar que hay distintos
tamaños en los fragmentos, indicando variaciones, lo cual podría ocasionarse por
las mutaciones, adiciones o pérdida de nucleótidos. (Reece, 2012). Sin embargo,
ambos presentan los bandeos típicos de un rotavirus por lo tanto ambas muestras
son del mismo organismo.
Conclusión
Es importante caracterizar cuál es el tipo de retrovirus que está afectando al
paciente, en humanos sólo se presentan los retrovirus tipo A a C, ya que cada uno
produce diferentes enfermedades y síntomas que tienen importancia médica,
como son leucemias, linfomas, inmunodeficiencia, enfermedades autoinmunes,
neuropatologías, etc. Además, diferenciarlos conociendo su electroferotipo nos
ayuda a entender mejor el funcionamiento del virus y a tener una mejor estrategia
sobre cómo enfrentarlos creando una vacuna para prevenir su contagio.
Cuestionario
1. En base a la migración de los 11 segmentos del ARN viral, mencione si hay
variantes genéticas del virus entre las muestras analizadas, y cuál es el criterio
para reportar estas variantes.
Si, algunos fragmentos difieren en la cantidad o posición de las bandas, eso puede
deberse al serotipo del rotavirus
2. Explique si hay diferencia en la concentración del virus entre las muestras
(intensidad de color de las bandas de ARN), y qué significado tiene para
interpretar el grado de infección de este patógeno.
Mediante la nitidez y el ancho de las bandas electroforéticas se puede realizar una
estimación semi-cuantitativa de la concentración del virus, sin embargo, no es un
método confiable. Se ejecuta un gel con una proteína de concentración conocida y
se analiza la intensidad de la banda densitométricamente, pero sólo si hay un
control proteico estándar de concentración conocida. Se estima que un grado de
infección por rotavirus alto se estima por un ancho de banda mayor respecto al
control y con mayor intensidad (Agrawal GK & Thelen JJ, 2009).
3. Mencione los contaminantes más comunes en una muestra de ácidos nucleicos
purificados y cómo se analizan en base a absorbancias en el espectro de luz
ultravioleta.
Es común la contaminación por proteínas, la cual se puede observar según el
cociente A260/A280, este debe estar entre 2 y 2.3 para que sea adecuado, si el
cociente es inferior estaremos presentando contaminación de proteínas en la
muestra, otro cociente es el de A260/A230 que nos indica presencia de
compuestos fenólicos, este debe estar etre 1.8 y 2.0, valores inferiores a 1.8 indica
presencia de Trizol por ejemplo.
4. Escriba la fórmula para calcular la concentración de ARN de una muestra
problema y calcule la concentración en mg/ml de una muestra que mostró una
absorbancia de 0.091 obtenida en un nanodrop.
Fórmula: 40 x Absorbancia a A260 x Factor de dilución
Concentración de la muestra con absorbancia a 0.091: 0.091 x 40 x 1/10=
0.364 ug/mL

8. Referencias
• Citas en el texto
1. Buckingham L. 2012. Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and
Clinical Applications. F.A. Davis Company, USA. ISBN: 978-0-8036-2677-5.
2. Cornejo-Romero A, Serrato-Díaz A, Rendón-Aguilar B, Rocha-Munive MG.
2014. Herramientas Moleculares Aplicadas en Ecología: Aspectos Teóricos
y Prácticos. Primera edición. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos
Naturales. México. ISBN: 978-607-824-672-4.
3. Knipe DM and Howley PM. 2013. Fields Virology. 6th edition. Lippincott
Williams & Wilkins. USA. ISBN: 978-1451105636.
4. Herring AJ, Inglis NF, Ojeh CK, Snodgrass DR, Menzies JD. 1982. Rapid
Diagnosis of Rotavirus Infection by Direct Detection of Viral Nucleic Acid in
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- 4.2. Cuantificación de ARN. (2017, 1 diciembre). [Vídeo]. YouTube.
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- Crawford, S. E., Ramani, S., Tate, J. E., Parashar, U. D., Svensson, L.,
Hagbom, M., Franco, M. A., Greenberg, H. B., O’Ryan, M., Kang, G.,
Desselberger, U., & Estes, M. K. (2017). Rotavirus infection. Nature
Reviews Disease Primers, 3(1), 3. https://doi.org/10.1038/nrdp.2017.83

- Da Silva Soares, L., Pereira Mascarenhas, J. D., Benchimol Gabbay, Y.,

Porto Gusmão, R. H., & Da Costa Linhares, A. (2010). Molecular
characterization of G1 human rotaviruses detected in children from Belém,
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- Giambiagi, S. (2001). Estudios moleculares del gen 11 de rotavirus

(Doctoral dissertation, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales).
- González, S. A. (1989). Análisis molecular del genoma de rotavirus
(Doctoral dissertation, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires).
- Reece, J. B., Taylor, M. R., Simon, E. J. y Dickey, J. L. (2012). Gel
electrophoresis of DNA (Electroforesis en gel de ADN). En Campbell
biology: Concepts & connections (7° ed., pág. 243) - Técnicas, N.(2003)
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA
PROTEÍNAS Y ADN