METODOLOGÍA EN EL LABORATORIO

DE BIOQUÍMICA

• Tema 11: Espectroscopía de Absorción UV-

Visible.

• Tema 12: Centrifugación.

• Tema 13: Electroforesis.

• Tema 14: Cromatografía.

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 TEMA 11: ESPECTROSCOPIA DE
ABSORCIÓN UV-VISIBLE
1. Introducción
2. Propiedades de la radiación electromagnética (RE)
2.1 Comportamiento de RE
2.2 Espectro electromagnético
3. Interacción de la RE con la materia. Absorción/Emisión.
4. Espectroscopía UV-visible:
4.1 Especies absorbentes y transiciones electrónicas
4.2 Espectro de absorción
4.3 Leyes básicas de la absorción de RE UV-visible
4.4 Instrumentación en espectroscopía UV-visible
4.5 Aplicaciones
2
 1. INTRODUCCIÓN

Las espectroscopías son técnicas de análisis molecular

basadas en el estudio de las interacciones que se
establecen entre las radiaciones electromagnéticas y las
moléculas.

En concreto en este tema se describe la técnica basada en

la absorción de las radiaciones electromagnéticas UV y
visible (luz) por parte de las moléculas biológicas.

Presenta importantes aplicaciones en biología, química,

física y astronomía, entre otras disciplinas científicas.

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2. PROPIEDADES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
2.1 Comportamiento de la Radiación Electromagnética (RE)

La RE, por su comportamiento, puede considerarse tanto como una

onda o como un haz de fotones:

a) En el electromagnetismo (modelo clásico de onda sinusoidal) la

RE es un campo oscilante que se propaga como una onda sinusoidal
desde la fuente emisora. Este modelo se utiliza para explicar las
propiedades de la RE.

b) En la mecánica cuántica (modelo corpuscular) la RE se comporta

como una corriente de partículas discretas (fotones) emitidas por una
fuente. Este modelo se utiliza para explicar la interacción de la RE
con la materia.

Por tanto, el electromagnetismo clásico y la mecánica cuántica ofrecen

descripciones diferentes y complementarias de la RE.

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2. PROPIEDADES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
a) Modelo clásico de onda sinusoidal: Jamen Clerk Maxwell
RE = onda electromagnética que se define mediante dos parámetros:
- Longitud de onda (λ): distancia recorrida por un ciclo completo (de
cresta a cresta de la onda). En la espectroscopía UV-visible se
expresa en nm.
- Frecuencia (γ): número de oscilaciones completas que realiza la onda
por unidad de tiempo (herzios = s-1)
Longitud
onda
λ

Frecuencia (γ)

La RE viaja a velocidad cte en un medio dado. En el vacío, la RE viaja a la

velocidad de la luz (C)
C = λ × γ; C = 3 × 108 m/s 5
2. PROPIEDADES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

6
2. PROPIEDADES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
b) Modelo corpuscular: Max Plank
§ La RE se puede considerar también como un haz o flujo de partículas,
llamadas fotones, que se propagan en línea recta.
§ Existe una ecuación que relaciona los modelos ondulatorio y
corpuscular a través de la cte de Plank (cte de proporcionalidad entre
la Energía de un fotón y la frecuencia de la onda electromagnética)

La E (Energia) de los fotones viene determinada por:

𝑐 h - cte de Plank (=6,6252 x 10-34 Js)
C = λ × γ 𝐸 = ℎ𝛾 = ℎ γ - frecuencia
λ
modelo ondulatorio c - velocidad de la luz
λ - longitud de onda
§ La E que tiene un fotón es directamente proporcional a la γ de la
radiación e inversamente proporcional a la λ:
- A mayor λ, menor E
- A menor λ, mayor E
7
 2. PROPIEDADES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
2.2 Espectro electromagnético

El espectro electromagnético es el conjunto de las RE de todas las λ

+ energía
- energía

El espectro visible es la única parte que puede ver el ojo humano. Incluye la
RE cuya λ está aproximadamente entre 400 nm y 700 nm.
La luz roja tiene la λ más larga y la menor cantidad de E, mientras que la luz
violeta tiene la λ más corta y la mayor cantidad de E.

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 3. INTERACCIÓN DE LA RADIACIÓN CON LA MATERIA
Cuando se hace incidir RE de energía adecuada sobre la materia, ésta
interacciona con las moléculas que la componen, pudiéndose producir tres
fenómenos distintos:
- Dispersión à cambios de dirección que sufre la RE incidente
(difracción rayos x por ej. para ver estructura de proteínas cristalizadas)
- Absorción à la RE es absorbida por las moléculas produciendo un
incremento de energía en éstas. (Espectroscopía de luz polarizada, de
infrarrojo, de resonancia magnética nuclear, de UV-visible)
- Emisión à Tras la absorción de la RE, algunas moléculas ceden o
emiten el exceso de energía en forma de fotones (Espectroscopía de
fluorescencia/fosforescencia)

ESPECTROSCOPIA

9
 3. ABSORCIÓN
Niveles energéticos de una molécula
- Cuando una molécula absorbe la RE, pasa desde un estado basal (E1)
a un estado excitado (E2), de mayor contenido energético (se produce la
transición de un electrón a un estado de energía superior).
- La absorción de E sólo es muy probable si la cantidad de E corresponde
a la diferencia entre los dos niveles energéticos (ΔE = E2-E1)
- Por ello, las moléculas sólo absorberán RE de unas determinadas λ
Estado excitado (E2)

ΔE= hv
ΔE = E2-E1

Estado fundamental (E1) 10

 3. EMISIÓN
• Átomo absorbe un fotón UV-visible à E de ese fotón excita uno de los
e- del átomo que alcanza un nivel de E mayor (transición).
• El e- excitado es más inestable que en su estado basal à e- caerá al
estado de menor E y, al hacerlo, emitirá un fotón con la misma energía
que la diferencia entre los niveles energéticos (emisión de radiación).

λ=400 nm

λ=700 nm

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 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
- La espectroscopía UV-Vis está basada en el proceso de absorción de
la RE ultravioleta-visible (radiación con λ entre los 160 - 400 (UV) y
400 - 750 nm (visible)) por una molécula.

- La absorción de RE causa la promoción de un e- de un estado

fundamental a un estado excitado. Estos e- que absorben son los e- de
enlace de las moléculas, por lo que el espectro de absorción de una
molécula dependerá del tipo de enlaces que presenta.
- Por tanto las moléculas absorben RE en función de su estructura
molecular. 12
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4.1 Tipos de electrones absorbentes

ü Electrones que participan directamente en la formación del enlace entre

átomos:
Benceno
Metano
- e- σ enlazantes (Orbitales σ).
enlaces sencillos (C-C)

- e- π enlazantes (Orbitales π).

enlaces múltiples (C=C) o (C C)

ü Electrones no enlazantes que no participan en el

enlace y están localizados alrededor de átomos
como el O2, S o N2 (Orbitales n)

13
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4. 1 Especies absorbentes en UV-visible y transiciones electrónicas

Los orbitales antilenlazantes σ* y π* son la versión excitada del σ y π

enlazantes Estado
excitado (E2)
ΔE= hv
Estado
fundamental (E1)

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 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4. 1 Especies absorbentes en UV-visible y transiciones electrónicas

Los orbitales antilenlazantes σ* y π* son la versión excitada del σ y π

enlazantes Estado
excitado (E2)
ΔE= hv
Estado
fundamental (E1)

Transiciones electrónicas entres niveles de E moleculares en UV-visible

Cuando las moléculas absorben fotones de E adecuada (UV-visible) se
pueden dar 4 tipos de transiciones:
Antilenlazante
- σ-> σ* Antilenlazante
- π -> π*
- n-> σ* NO enlazante
- n-> π*
Enlazante

Enlazante 15
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4. 1 Especies absorbentes en UV-visible y transiciones electrónicas

Absorción de radiación UV-visible por compuestos orgánicos

Energía Transición Región del espectro Ejemplo
(λ max absorción)
σ → σ* U.V vacío (<185nm) Metano (125nm)
n→σ* U.V lejano (185-250nm) Acetona (190nm)

aplicaciones
Mayoría de
π → π* U.V. cercano (250-400nm) Benceno (203 y 250 nm)
n → π* Visible (400-800nm) Nitrobenceno (665nm)

Metano Acetona

Benceno Nitrobenceno

16
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4.1 Especies absorbentes en UV-visible

Grupos cromóforos y auxocromos

- Cromóforo: son los grupos funcionales de la molécula responsables de

la absorción.

- Auxocromos: grupos funcionales que por sí mismas no dan color a la

molécula, pero son capaces de aumentar la intensidad de color de un
cromóforo.

17
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4.2 Espectro de absorción de una molécula
- El espectro de absorción de un cromóforo es la representación de la
cantidad de RE que puede absorber en función de la λ de luz
incidente.
- El espectro de absorción de una molécula es una característica
diferencial de una molécula en disolución, es reflejo directo de su
estructura y del entorno que la rodea.
- La λ de mayor absorción (pico máximo de absorción) es usada para
determinar su concentración.

18
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4.2 Espectro de absorción de una molécula

Ejercicio: determinar el espectro de absorción del naranja de metilo

19
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4.2 Espectro de absorción de una molécula

Ejercicio: determinar el espectro de absorción del naranja de metilo

La determinación del espectro de absorción de una molécula se

realiza midiendo la absorción de la RE a distintas λ.

λ (nm) Absorbancia
420 0,53
460 0,71
500 0,47
540 0,078
580 0

20
 4. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV- VISIBLE
4.2 Espectro de absorción de una molécula

Ejercicio: determinar el espectro de absorción del naranja de metilo

La determinación del espectro de absorción de una molécula se

realiza midiendo la absorción de la RE a distintas λ.

λ (nm) Absorbancia
420 0,53
460 0,71
500 0,47
540 0,078
580 0

21
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Cuando la RE de una λ de intensidad I0 incide perpendicularmente sobre
una disolución de un compuesto químico que absorbe RE (cromóforo), el
compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará
pasar el resto (It), de forma que se cumple:

RE absorbida
I0 = Ia + It

It = I0 - Ia RE incidente RE transmitida

En espectroscopía UV-visible se determinan: Transmitancia y

Absorbancia (son adimensionales)
22
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Transmitancia

La transmitancia (T) nos indica la cantidad de RE transmitida por la

muestra.

Se expresa como la relación entre la cantidad de RE transmitida

una vez que ha atravesado la muestra (It) y la cantidad de RE que
incidió sobre ella (I0) y se representa normalmente en tanto por
ciento:

RE absorbida

RE incidente RE transmitida
𝑰𝒕
%𝑻 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝑰𝟎

23
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Absorbancia

La absorbancia (A) nos indica la cantidad de RE absorbida por la muestra.

Se expresa como la relación logarítmica entre la RE incidente (I0) y la

transmitida (It)

RE absorbida

𝑰𝟎
𝑨 = 𝒍𝒐𝒈 𝑨 = −𝒍𝒐𝒈𝑻 RE incidente RE transmitida
𝑰𝒕

Si I0 = It; log 1 = 0

A = 0 y T = 100%
(indica que la muestra no absorbe a una determinada λ)

24
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Ley de Lambert-Beer: relaciona A con C

La ley de Lambert-Beer indica que la fracción de I0 que es absorbida por

una solución es proporcional a la C de soluto, al espesor del medio
atravesado b y a la absortividad específica de cada cromóforo a.

RE absorbida

𝑰𝟎 a = absortividad
𝒍𝒐𝒈 =abc
𝑰𝒕
RE incidente a RE transmitida
A=abc
c C = concentración

A = ε·l·C b Paso óptico (longitud medio absorbente)

La variación de la A con la
concentración de soluto sigue una
proporcionalidad directa.
25
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Ley de Lambert-Beer A = ε·l·C

La absorbancia de una solución es:

• Directamente proporcional a su concentración
> número de moléculas > interacción de la luz con ellas
• Depende de la distancia que recorre la RE por la solución
= concentración > distancia recorre la luz por la muestra > número
moléculas se encontrará
• Depende de ε (coeficiente de extinción molar)
una constante de proporcionalidad específica de cada cromóforo.
ε es la A de una disolución 1M de un soluto, para un paso óptico de 1cm
Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l.
- (l) en cm
- (c) en M
- (ε) en L.moles-1·cm-1

26
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Ley de Lambert-Beer A = ε·l·C

La A de una disolución es la suma de las A de sus componentes.

- Un solo componente
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1
- Varios componentes
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1 + Adisolvente2 + Asoluto2…

27
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Ley de Lambert-Beer A = ε·l·C

La A de una disolución es la suma de las A de sus componentes.

- Un solo componente
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1
- Varios componentes
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1 + Adisolvente2 + Asoluto2…

• Cuando se hace una medida hay que descontar la contribución del

disolvente.
• Para ello siempre se requiere un tubo blanco que contenga todos los
reactivos excepto el soluto que se desea medir.
• La absorbancia de este tubo se restará de la que presente la muestra a
medir.

28
4.3 LEYES BÁSICAS DE LA ABSORCIÓN DE LUZ UV- VISIBLE
Limitaciones de la ley de Lambert-Beer

La relación proporcional entre A y C no es lineal en cualquier situación. La

ley de LB solo se cumple con RE monocromáticas y soluciones diluidas.

Limitaciones de la Ley de Lambert-Beer:

- Características del analito:
- C analito relativamente pequeña y C elevadas de electrolitos en la
muestra. Produce una alteración de la absortividad del analito.
- C analito elevada. Si supera 0,01M se altera la capacidad de
absorción por interacciones electrostáticas entre las moléculas.
- Impurezas en la muestra que presentan absorción.
- Limitaciones químicas.
- Por características de la técnica se produce una interacción del
analito con otras sustancias y se genera un compuesto con un
espectro diferente.
29
4.4 INSTRUMENTACIÓN EN ESPECTROSCOPÍA UV-VISIBLE

Los instrumentos diseñados para cuantificar la absorción son los

espectrofotómetros.

𝑰𝟎 𝑰𝒕

Cubetas

30
 4.4 INSTRUMENTACIÓN: ESPECTROFOTÓMETRO

Lámpara de luz

Función: responsable de emitir RE.

- Tungsteno-Halógeno: fuentes para visible

y UV próximo (350-750nm)

- Deuterio: fuentes para UV (200-350nm)

𝑰𝟎 𝑰𝒕

31
 4.4 INSTRUMENTACIÓN: ESPECTROFOTÓMETRO
Monocromador
Función: seleccionar una banda estrecha de λ de todas las que proceden
de la fuente de luz para aumentar la sensibilidad de la medida de A.
Monocromador formado por:
- Colimador, lente que concentra la radiación de la lámpara en el
monocromador.
- Prisma de vidrio o red de difracción que permite dispersar la luz en
todas las λ individuales
- Selector λ, rendija por la que pasa la radiación seleccionada y se
concentra sobre la muestra

𝑰𝟎 𝑰𝒕

32
 4.4 INSTRUMENTACIÓN: ESPECTROFOTÓMETRO
Compartimento muestra

Función: Aloja el recipiente donde se pone la disolución a analizar

- Aislado de radiación exterior para evitar interferencias
- Recipiente empleado se denomina cubeta, transparente a la radiación
empleada
- Dimensiones condicionan: volumen y paso óptico de muestra

𝑰𝟎 𝑰𝒕

33
 4.4 INSTRUMENTACIÓN: ESPECTROFOTÓMETRO
Compartimento muestra

Cubetas de un material que permita el paso de la RE en la región de

interés. Para ello se utilizan diferentes materiales:

- Cuarzo o sílice fundido - UV

- Cristal óptico y plástico - Visible

Características:
- Espacio interior habitualmente de 1 cm, aunque puede ser superior
o inferior dependiendo de la muestra.
- Ventanas perpendiculares a la direccionan del haz, que minimizan
las pérdidas por reflexión. No debe desviar la trayectoria de la luz.

34
 4.4 INSTRUMENTACIÓN: ESPECTROFOTÓMETRO
Detector y registrador digital

- Detector: dispositivo que detecta la It una vez que la RE ha

atravesado la muestra (I0) y parte de ella se ha absorbido (Ia).
Convierten la energía luminosa en energía eléctrica

- Pantalla digital: dispositivo de lectura que digitaliza la señal

eléctrica y la convierte en un número (absorbancia o transmitancia)

𝑰𝟎 𝑰𝒕

35
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE

Espectroscopía UV-Visible

Mide la cantidad de luz absorbida por el analito en

función de λ utilizada

Aplicaciones:
- Análisis cualitativos: identificación de sustancias químicas (compuestos
orgánicos e inorgánicos) mediante la identificación de los picos
máximos de absorción (en desuso).

- Análisis cuantitativos: determinación de concentración de compuestos

ya que la intensidad de absorción de un compuesto es proporcional a su
concentración (extensamente usado).

36
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Métodos para determinación de concentración de analito

- Directos: Aplicando la ecuación de Lambert-Beer

A = ε·l·C
Aplicaciones:
- Cuantificación de ácidos nucléicos por
absorción UV
- Cuantificación de proteínas por absorción UV

- Indirectos: Utilizando el método de la curva patrón

Aplicaciones:
- Cuantificación de proteínas por colorimetría
(Bradford, Lowry, Biuret, BCA…)
37
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Métodos para determinación de concentración de analito

- Directos: Aplicando la ecuación de Lambert-Beer

Si conoces el ε para el analito que queremos cuantificar
A = ε·l·C
Aplicaciones:
- Cuantificación de ácidos nucléicos por
absorción UV
- Cuantificación de proteínas por absorción UV

- Indirectos: Utilizando el método de la curva patrón

Aplicaciones:
- Cuantificación de proteínas por colorimetría
(Bradford, Lowry, Biuret, BCA…)
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 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Métodos para determinación de concentración de analito

- Directos: Aplicando la ecuación de Lambert-Beer

Si conoces el ε para el analito que queremos cuantificar
A = ε·l·C
Aplicaciones:
- Cuantificación de ácidos nucléicos por
absorción UV
- Cuantificación de proteínas por absorción UV

- Indirectos: Utilizando el método de la curva patrón

Si NO conoces ε para el analito que queremos cuantificar
Si el analito no absorbe en UV- visible y se necesita realizar una reacción
previa para lograr que el analito se transforme en una especie absorbente
(colorimetría)
Aplicaciones:
A = ε·l·C - Cuantificación de proteínas por colorimetría
ε = pendiente (Bradford, Lowry, Biuret, BCA…)
39
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Método curva patrón o curva de calibración
Se representan cantidades conocidas del cromóforo a determinar frente
a su A.
La recta de calibración se puede calcular:
- Gráficamente: Interpolando el valor de A medido de analito en la
gráfica.
- Regresión lineal (ajuste por mínimos cuadrados): determinamos el
valor de la pendiente en la ecuación de la recta.

Absorbancia A = ε·l·C

A= a C

cantidades
conocidas del
mg/L cromóforo

40
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE

Ejemplos de ensayos cuantitativos:

1. Determinación de concentración de macromoléculas mediante

métodos:
- Directos, macromoléculas que absorben directamente en UV-
Visible:
Ø Espectroscopía de proteínas
Ø Espectroscopía de ácidos nucleicos
- Indirectos, macromoléculas que no absorben directamente en UV-
Visible:
Ø Colorimetría: análisis que permite el cálculo de una
concentración a partir de una medida de A de un cromóforo
coloreado que se genera de forma artificial mediante una
reacción química.
2. Determinación de actividad enzimática (cinética enzimática)
3. Determinación del crecimiento celular en bacterias (turbidometría)
41
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE

Ejemplos de ensayos cuantitativos:

1. Determinación de concentración de macromoléculas mediante

métodos:
- Directos, macromoléculas que absorben directamente en UV-Visible:
Ø Espectroscopía de proteínas à Cromóforos proteicos

Enlaces peptídicos absorben en UV lejano (200nm)

Cadenas laterales de algunos aa (Phe, Tyr, Trp) absorben en UV próximo (230-300nm)

Grupos de naturaleza no proteica absorben en el visible (350-600 nm):

- Grupos prostéticos (grupo hemo de hemoglobina)
- Cofactores (NAD+)

42
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Ejemplos de ensayos cuantitativos:
Ø Espectroscopía de proteínas à Cromóforos proteicos

- La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm, la cual

se atribuye a la tirosina y al triptófano.
- Ventaja: no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o
destruye durante la determinación.

A = ε·l·C

Espectro típico de Trp, Tyr, His Espectro típico de proteínas

43
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Ejemplos de ensayos cuantitativos:

1. Determinación de concentración de macromoléculas mediante

métodos:
- Directos, macromoléculas que absorben directamente en UV-Visible:
Ø Espectroscopía de ácidos nucleicos à Cromóforos son las
bases nitrogenadas

Espectro típico de bases nitrogenadas

A = ε·l·C
44
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Ejemplos de ensayos cuantitativos:

1. Determinación de concentración de macromoléculas mediante

métodos:
- Directos, macromoléculas que absorben directamente en UV-Visible:
Ø Espectroscopía de ácidos nucleicos à Cromóforos son las
bases nitrogenadas
Espectro típico de bases nitrogenadas Espectro típico de ácidos nucleicos

45
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Ejemplos de ensayos cuantitativos:

1. Determinación de concentración de macromoléculas mediante

métodos:
- Directos, macromoléculas que absorben directamente en UV-Visible:
Ø Espectroscopía de ácidos nucleicos à Cromóforos son las
bases nitrogenadas

Las bases nitrogenadas absorben

alrededor de 260nm.

- 1 unidad A260 de dsDNA = 50µg/ml

- 1 unidad A260 de ssRNA = 40μg/ml

A = ε·l·C

46
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE
Ejemplos de ensayos cuantitativos:

1. Determinación de concentración de macromoléculas mediante

métodos Indirectos (Colorimetrías)

Ø Análisis que permite el cálculo de una concentración a partir de una

medida de Absorbancia de un cromóforo coloreado.
Ø En bioquímica, este cromóforo se genera de forma artificial mediante
una reacción química. El cromóforo absorbe en el visible.
Ø La muestra se destruye.
Ø Usan la albúmina de suero bovino para realizar la curva patrón.

Molécula + Sustrato à Compuesto coloreado

- Compuesto coloreado que absorbe

Compuesto que NO en UV-visible.
absorbe en UV-Visible - La cantidad de compuesto coloreado
es proporcional a la cantidad de
molécula
47
 4.5 APLICACIONES ESPECTROSCOPÍA UV - VISIBLE

Ejemplo colorimetría:

Método de Bradford para determinar concentración de proteínas.

- Implica la unión de un colorante (Azul de Coomassie brillante) a las
proteínas en medio ácido.

- La solución del colorante libre da color rojizo (465nm) y cambia a

azul (595nm) cuando se une a las proteínas

Proteína Complejo Azul

(Cadena lateral + Azul Coomassie proteína y A= 595 nm
básica y aromática Coomassie

color rojizo (465nm) azul (595nm)

48