MÓDULO 1.
CULTIVOS CELULARES
RA 2. Aplica técnicas de aislamiento y selección celular,
asegurando la viabilidad y asepsia del proceso.
Criterios de evaluación:
a) Se han aplicado técnicas mecánicas en el aislamiento de células a
partir de tejidos.
b) Se han aplicado técnicas enzimáticas en el aislamiento de células a
partir de tejidos.
c) Se ha utilizado la técnica de explante para el aislamiento de células a
partir de tejidos.
d) Se han aislado células a partir de fluidos biológicos.
e) Se han seleccionado células por el procedimiento de adherencia al
plástico o soporte de cultivo.
f) Se ha descrito la utilización de la separación celular para la selección
de células.
g) Se han utilizado técnicas de inmunoselección para la selección de
células.
h)Se ha realizado el registro de datos obtenidos, siguiendo los
procedimientos descritos.
i) Se han gestionado correctamente los residuos generados durante el
proceso de aislamiento.
j) Se han aplicado normas de higiene y seguridad biológica en los
trabajos.
Contenidos básicos:
Técnicas de aislamiento y purificación celular:
Tipos de aislamiento celular a partir de un material biológico.
Método de explantes y disgregación mecánica.
Método de digestión enzimática. Enzimas utilizadas comúnmente.
Selección de poblaciones celulares: adherencia al plástico, separación
celular, e inmunoselección.
UD 4. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 1
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UD 4 Técnicas de aislamiento y purificación celular
El cultivo celular, es el proceso mediante el cual algunas células pueden
cultivarse y expandirse en condiciones controladas. Para el cultivo in vitro,
las células utilizadas pueden ser derivadas de los tejidos o fluidos que las
albergan, utilizando para ello distintos procedimientos.
4.1. Tipos de aislamiento celular a partir de un material
biológico.
Los tipos de aislamiento celular más utilizados en el laboratorio de cultivos
celulares son: método de explantes; disgregación mecánica; digestión
enzimática y química e inmunoselección. Estos tipos se explicaran con
detalle en los siguientes epígrafes.
Dependiendo del material biológico de partida, se pueden obtener
distintas líneas celulares:
Muestras líquidas (fluidos biológicos): En el caso de las células
de la sangre, éstas pueden separarse unas de otras con relativa
facilidad, pero sin embargo de todas ellas sólo los leucocitos son
capaces de crecer y expandirse mediante su cultivo in vitro.
Las técnicas de separación dependen de las diferencias de:
tamaño celular, densidad celular, carga superficial específica,
química superficial celular, dispersión total de la luz por célula,
emisión de fluorescencia de uno o más constituyentes, etc.
Muestras sólidas (Tejidos, de origen embrionario o adulto,
sano o tumoral): Las células se pueden liberar de los tejidos
mediante distintos procedimientos como la hidrólisis enzimática con o
sin ayuda mecánica, la cual utiliza enzimas que degradan la matriz
extracelular.
4.1.1. Inicio de un cultivo primario.
Hay cuatro etapas:
1. Adquisición de la muestra.
2. Aislamiento del tejido.
3. Disección y/o disgregación del tejido.
4. Siembra en el recipiente de cultivo.
UD 4. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 2
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Es un requisito indispensable emplear material estéril y trabajar
en condiciones de asepsia
1. Aislamiento del tejido
Los tejidos para cultivos primarios se pueden obtener de:
Embriones de animales.
Órganos o tejidos de animales desarrollados.
Biopsias de tejidos humanos.
Es frecuente que requiera de consentimiento del comité ético del centro
asistencial, del facultativo y del donante o paciente o pariente para el uso
de biopsias para cultivo.
En ocasiones la biopsia se realiza con fines de diagnóstico y se debe
atender a las necesidades del patólogo. Esto afecta menos si la muestra
procede de resección quirúrgica o tejido no patológico, como placenta o
cordón umbilical.
A veces la obtención de la muestra se realiza en horario que no es
operativo para el laboratorio de cultivos celulares. Por lo que se requiere
recipientes y protocolos adecuados para la obtención y el almacenamiento
de la muestra. Un recipiente con medio de crecimiento y antibióticos
puede ser el adecuado para la mayoría de las muestras.
Tras la adquisición y aislamiento del tejido, se puede obtener un cultivo
primario mediante:
Técnica de explante. Favoreciendo la migración de células desde
fragmentos de tejidos adheridos a sustratos adecuados.
Disgregación mecánica o enzimática del tejido para obtener una
suspensión de células, algunas de las cuales se adherirán al sustrato
del cultivo.
Una excepción son las células hematopoyéticas, que de forma natural ya
están disgregadas.
UD 4. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 3
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Los explantes primarios son adecuados para una pequeña cantidad de
tejido.
La disrupción mecánica presenta mayor rendimiento cuando está
disponible una mayor cantidad de tejido. Funciona bien con tejidos
blandos o algunos tipos de tejidos más sólidos, cuando la cantidad de
rendimiento no es importante, o se pretende recuperar células no muy
adheridas a un estroma fibroso.
Parece ser requisito esencial que las células no sometidas a
transformación, se adhieren a una superficie para poder sobrevivir y
proliferar con eficacia, con la excepción de las células hematopoyéticas y
las células madre.
Las células transformadas, en especial células tumorales animales, son
capaces de proliferar en suspensión.
Separación de células no viables
Cuando el tejido es disgregado y sembrado solo una fracción de células
son capaces de sobrevivir y generar un cultivo primario.
Algunas aunque viable, puede que no sean capaces de adherirse, otras
son inviables, necróticas o apoptóticas.
La proporción de células necróticas o apoptóticas pueden determinarse
mediante tinciones de viabilidad y citometría de flujo.
Las células no viables suelen retirarse en el primer cambio de medio.
En cultivos celulares en suspensión las células no viables quedan diluidas
cuando las células inician su proliferación.
UD 4. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 4
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Las células no viables se pueden separar mediante centrifugación en una
mezcla de Ficoll y metrizoato sódico. Las células viables se obtienen en la
interfase del medio de cultivo y el Ficoll/metrizoato y las células muertas
se depositan en el fondo del tubo.
4.2. Método de explantes y disgregación mecánica.
La disgregación tisular es un proceso necesario para separar las células
entre sí manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo es necesario
romper la malla de proteínas que forman la matriz extracelular que las
mantiene unidas mediante procesos que separen las moléculas proteicas
de la matriz extracelular o bien rompiendo proteolíticamente las mismas
proteínas.
Debe ser rentable, reproducible y con una alta viabilidad celular.
a) Explantes primarios.
Fue el método original de iniciar un cultivo tisular, desarrollado por
Harrinson (1907) y Carrel (1912), entre otros.
Originalmente se ponía un fragmento de tejido en plasma sanguíneo o
linfa con suero heterólogo, en un portaojetos con una concavidad,
invertido y un cubreobjetos. El plasma coagulaba y junto al suero y los
extractos embrionarios proporcionaban los nutrientes y estimulaban la
proliferación y migración celular desde los márgenes del explante.
Esta técnica aun se emplea pero ha sido sustituida por métodos más
simplificados.
La muestra es troceada en pequeñas porciones y sembrada en la
superficie de una botella de cultivo o de una placa de Petri con un
volumen reducido de medio de alta concentración (40-50%) para que la
tensión superficial mantenga las piezas hasta que se adhiera
espontáneamente a la superficie.
Una vez alcanzada esta fase, suele ocurrir la expansión celular alrededor
del explante.
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Imágenes microscópicas
(10x) de la expansión del
crecimiento celular
alrededor del tejido
explantado antes de la
retirada de la muestra (b)
y después de la retirada
(c)
Técnica útil para pequeñas cantidades de tejidos, como biopsias cutáneas,
para las cuales existe riesgo de perder células durante la disgregación
mecánica o enzimática.
Desventajas:
Poca adherencia de algunos tejidos.
Selección de células con mayor capacidad migratoria en la
expansión que las de mayor interés.
b) Disgregación mecánica
Puede ser:
a) Manual: Se necesita el empleo de material quirúrgico previamente
esterilizado: pinzas, tijeras, bisturí, pipetas, etc. Y consiste en
triturar, fragmentar, cortar, picar, cribar, etc. los fragmentos de
tejido.
b) Automatizada: Se utilizan agitadores magnéticos o de rodillos para
facilitar la disgregación del tejido, así como, la liberación de las
células al medio de digestión.
Los disgregadores mecánicos u homogeneizadores tisulares facilitan
la disgregación de grandes volúmenes de tejidos o de tejidos de
gran dureza. Ej: Homogeneizador dispersor Ultraturrax.
Algunos autores han optado por la disgregación mecánica debido a:
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A partir de los explantes es proceso de crecimiento de las células es
lento.
La disgregación enzimática requiere más trabajo y tiene un riesgo
potencial de lesiones celulares durante la digestión enzimática,
aunque genere cultivos más representativos de las células en los
tejidos.
Técnicas de disgregación mecánica:
“Spillage” (raspado): se secciona el tejido minuciosamente y se
raspa los fragmentos, recogiendo las células que se desprende.
Tamizados: los tejidos
disecados se presionan y se
hacen pasar por tamices
con luces de mallas cada
vez más pequeños.
“Syringing”: se fuerza el
paso de los fragmentos a
través de una jeringa ( con
o sin aguja de calibre
amplio)
Pipeteado repetidos.
Desventajas de la disgregación mecánica:
Pueden causar daños mecánicos por cizallamiento.
El “Spillage” y el tamizado son los métodos más suaves.
La disrupción a través de jeringas y el pipeteado son los métodos
que pueden ocasionar más daños.
Son métodos moderadamente eficaces cuando se aplican a tejidos
blandos.
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4.3. Método de digestión enzimática.
4.3.1. Enzimas utilizadas comúnmente.
El procedimiento más sencillo de disgregación tisular es por métodos
enzimáticos, partiendo de una solución de disgregación simple a una
solución más compleja que variará dependiendo del tipo de tejido. En la
disgregación enzimática se emplean enzimas que rompen los
componentes de la matriz extracelular o las uniones intercelulares para el
tratamiento del tejido con soluciones de proteasas activas. En la práctica
se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres métodos. La elección
del procedimiento dependerá fundamentalmente de la naturaleza y la
cantidad de tejido de partida, así como, del uso previsto de las células que
se obtengan.
Las enzimas que se utilizan comúnmente para la disgregación del tejido
son preparaciones crudas de tripsina, colagenasa I, colagenasa IV,
elastasa, pronasa, dispasa, papaína, DNasa y hialuronidasa, solas o en
combinaciones. Las preparaciones crudas de las enzimas (con otras
proteasas contaminantes) son mejores disgregando el tejido que las
enzimas purificadas (generalmente menos tóxicas y más específicas en su
acción).
En ocasiones la disgregación enzimática se acompaña de una disgregación
química que se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones
divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. Ej: EDTA, EGTA y
citrato.
Sea cual sea el método de disgregación empleado, se debe verificar la
calidad y viabilidad celular, que no debe ser inferior al 80-90% para
asegurar el éxito de la derivación de la línea celular.
4.3.2. Disgregación enzimática
La adhesión intercelular en tejidos se debe a una variedad de
glicopéptidos que interactúan (moléculas de adhesión celular, CAM).
Algunas son dependientes del calcio (cadherinas), por lo tanto sensibles a
agentes quelantes como el EDTA o el EGTA.
Las integrinas, que se adhieren al conjunto de arginina-glicina-ácido
aspártico en la matriz extracelular, también tienen dominios de fijación del
Ca2+ que también se afectan por la depleción del calcio.
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La matriz intercelular y las membranas basales contienen:
Glicoproteínas, como la fibronectina y la laminina, que son sensible
a las proteasas.
Proteoglucanos, en menor medida, que pueden ser degradados por
glucanasas como hialuronidasas o heparinasas.
La disgregación enzimática se inicia con una solución de tripsina, o
tripsina/EDTA, añadiendo o reemplazando otras proteasas, para mejorar
la disgregación, u obviando la tripsina, si es necesario incrementar la
viabilidad.
La acción de unas enzimas pueden inactivar la acción de otras, por lo que
es arriesgado usar combinaciones, por ejemplo, las DNAsas se inactivan
en presencia de tripsina.
Se aconseja añadir secuencialmente, tras la inactivación de las
precedentes
Las más utilizadas solas o en combinación son: Las soluciones de tripsina,
colagenasa, elastasa, pronasa, Dispasa, DNAsa y hialuronidasa.
En disgregación primaria se utilizan otros enzimas, no obtenidos de
mamíferos como:
Trypzean (Sigma), una tripsina recombinante obtenida del maíz.
TrypLe (Invitrogen), de microorganismos recombinantes.
Accutase y Accumax (Innovative Cell Techonolgies).
Liberase Blendzyme 3 o Liberase TM (Roche).
Las preparaciones de enzimas no purificados suelen ser más eficaces que
las preparaciones de enzimas purificados. Debido a que las primeras tiene
como contaminantes otras proteasas, aunque las segundas suelen ser
menos tóxicas.
La tripsina y la pronasa proporcionan disgregación más completa,
pero pueden lesionar a las células.
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La colagenasa y Dispasa, generan disgregación incompleta, pero
dañan menos a la célula.
La hialuronidasa y la colagenasa pueden utilizarse para digerir la
matriz extracelular.
La DNAsa se utiliza para disgregar el ADN liberado de las células
lisadas, ya que este tiende a impedir la proteólisis y promueve la
reagregación.
Los protocolos más frecuentes en la disgregación enzimática son:
a) Tripsinización en caliente.
b) Tripsinización en frio.
a) Tripsinización en caliente.
El tejido es cortado y agitado en una solución al 2,5 % de tripsina en
PBS durante pocas horas.
Se aspiran, centrifugan las células que se van disgregando, cada media
hora y se recogen en medio con suero, para inactivar la tripsina y se
mantienen en frio.
Las células cosechadas se cuentan en cámara de recuento para conocer
su concentración y viabilidad y se trasfiere a los recipientes de cultivo a
una concentración adecuada.
b) Tripsinización en frio.
El tejido es cortado en fragmentos pequeños y
se introduce en una solución de medio con
0,25 % de tripsina a 4 ºC durante 6 a 18
horas.
Trascurridas las horas se decanta con cuidado
la tripsina, se incuba a 37 ºC durante 20 – 30
minutos.
Se añade suero fresco y se pipetea
repetidamente para ayudar a dispersar las
células.
Mediante una cámara cuentaglóbulos se
determina la concentración y viabilidad celular.
Se siembra en recipientes con medio de cultivo
fresco, a concentración requerida.
Siembra en el recipiente de cultivo.
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4.4. Selección de poblaciones celulares: adherencia al
plástico, separación celular, e inmunoselección.
4.4.1. Adherencia al plástico:
Al establecer un cultivo celular se seleccionan las células que van a crecer
en función de numerosos criterios: sólo formarán parte del cultivo
aquellas células que sean capaces de superar el proceso de disgregación,
de adherirse al sustrato y de proliferar (bien en forma de monocapa, bien
en suspensión).
El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al
sustrato y en esa forma inician la proliferación. Muchas líneas celulares
son anclaje-dependientes, es decir, no inician la proliferación hasta que se
han adherido al sustrato. Este es el modo normal de proliferación de la
mayor parte de las células, con excepción de las células hematopoyéticas
maduras.
En cultivos celulares que presentan dependencia de anclaje se utilizan
contenedores con superficies adherentes y en ocasiones tratadas que
mejoran la adhesión de las células a la superficie de crecimiento.
El material más utilizado es el plástico desechable, concretamente el
poliestireno que mejora la fijación, el crecimiento y la diferenciación
celular.
Frascos de cultivo celular. Tomada de:
http://www.belomed.com.pe
El crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de
proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato porque son
UD 4. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 11
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independientes del anclaje. Es propio de las células hematopoyéticas,
algunas líneas celulares transformadas y de células procedentes de
tumores.
Es de destacar que en todo tejido existe una fracción o tipo celular que es
capaz de crecer en suspensión. A pesar de que su origen no está claro se
cree que se trata de células madre ("stem cells") indiferenciadas.
4.4.2. Separación celular (para poblaciones
heterogéneas)
Existen varias metodologías para la separación celular de poblaciones
heterogéneas
a) Centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll, Percoll,
Metrizamida): las células sedimentan en un gradiente de densidad hasta
que alcanzan una posición de equilibrio equivalente a su propia densidad
(sedimentación isopícnica). El medio utilizado no debe ser tóxico ni
viscoso a densidades altas y debe ejercer poca presión osmótica en la
solución.
Tomada de: http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm
Método rápido, típico por ejemplo en la obtención de leucocitos de sangre
circulante libres del resto de células sanguíneas. Se trata de una
centrifugación a través de un medio de densidad constante (se podría
considerar como un gradiente escalonado de una sola etapa).
La densidad de este lecho debe ser intermedia entre la de los tipos
celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios
comerciales como Ficoll-Paque, Lymphoprep y otros muchos, formados
generalmente por mezclas de Ficoll (un polisacárido sintético) y
metrizamida (un compuesto sintético yodado). Se dispone de varios
medios con densidades adecuadas para la separación de tipos celulares
concretos; por ej., Nycoprep 1.077 para células mononucleares, Nycoprep
1.068 para monocitos, Polymorhoprep para células polimorfonucleares, o
Nycoprep 1.063 para plaquetas.
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Tomada de: http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm
b) Cromatografía de afinidad: es un método físico de separación en
el cual los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la
otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida. El eluyente es la
fase móvil que atraviesa la columna.
Tomada de: http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-content/uploads/2016/02/7-2016-teoria-
Unidad-6-Purificacion-de-proteinas.pdf
c) Electroforesis en gradiente: en gradiente de Ficoll, aprovecha la
carga celular para separar distintos tipos celulares.
4.4.3. Inmunoselección:
a) Separación inmunomagnética: se utilizan unas “microbeads” que
son unas bolitas magnéticas de unos 50nm de tamaño, que no
precipitan, no se agregan, son biodegradables y que, además, pueden
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llevar un anticuerpo, que es utilizado para separar distintas poblaciones
celulares.
Tomada de : http://tecnicasinmunologicas6.blogspot.com/2012/03/metodos-en-
inunologmia.html
b) Separación celular por citometría de flujo o “Cell Sorting”:
La técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia FACS
por sus siglas en inglés (Fluorescence-Activated Cell Sorting) es un tipo
especializado de citometría de flujo. Esta técnica provee un método
para la clasificación y selección de células provenientes de una mezcla
de varias poblaciones en dos o más contenedores de a una célula por
vez. Usa un método analítico por el que se mide la emisión de múltiples
fluorescencias y la dispersión de luz (“light scatter”) de células o
partículas microscópicas, alineadas secuencialmente mediante una
corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a
gran velocidad (hasta miles de células/segundo) frente a un haz de luz
láser de longitud de onda adecuada.
Tomadas de:
file:///home/usuario/Escritorio/Citometria_seminariosSCTs.pdf
UD 4. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 14
