Reactivos Uso Importancia
Medio Estudio de la fisiología y la bioquímica de células normales. Ayudan al crecimiento y mantenimiento de una
suplementado Investigación y desarrollo farmacéuticos, incluidos el variedad de estirpes celulares de mamíferos y de
metabolismo y la toxicología de los fármacos. otros tipos in vitro, ya sea como cultivos
Otras aplicaciones de reciente aparición: cultivo de células dependientes de anclaje o cultivos en suspensión.
madre, inmunoterapia y terapia celular.
PBS Lavado de células Mantener el pH y la presión osmótica lo más
Transportar células o tejidos parecido al ambiente biológico natural
Diluir células para contar y preparar reactivos. (fisiológico). El pH y la osmolaridad son dos
aspectos muy importantes que deben ser
controlados en ciertos protocolos de laboratorio.
Tripsina Remover las células de la superficie del recipiente de cultivo y Solución pura de la enzima, que maximiza la
ponerlas en suspensión. producción de células funcionalmente viables de
Liberar células adherentes de la superficie del recipiente de los recipientes de cultivo, mientras que previene la
cultivo a la suspensión. toxicidad inducida por otras proteasas
contaminantes.
SFB Mantenimiento y propagación de cultivos con bajos Aporta factores de crecimiento, hormonas,
requerimientos nutricionales. minerales, lípidos y otros micronutrientes, que al
Se emplea para la propagación y el mantenimiento de cultivos ser usados en concentraciones apropiadas en el
por largos períodos, sin que se afecte la integridad de las medio de cultivo, suplen satisfactoriamente los
células. requerimientos metabólicos que garantizan la
proliferación y adhesión celular.
DMSO Congelación de células en el cultivo celular en lugar de DMSO es tóxico para las células. Por lo tanto, es
glicerina. aconsejable utilizar un "medio de congelación"
Evitar la formación de cristales de hielo durante el proceso de previamente refrigerado. Normalmente, este medio
congelación, de lo contrario las células se destruirían. de congelación consiste en un medio de cultivo
estándar complementado con un 10% de DMSO.
Criopreservación en Monocapa
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4
Atemperar *Encender la luz UV en la cabina *Limpiar el área y todo el material *Retirar de la incubadora el frasco
de flujo laminar 30 min y luego que ingrese a la cabina con alcohol ROUX.
Medio suplementado
15 min de flujo de aire. potable al 70 %. *Cerrar la tapa del frasco ROUX.
PBS
*Observar al microscopio invertido:
Tripsina *Retirar el parafilm de los
Morfología, confluencia al 60% y
SFB reactivos a utilizar siempre dentro
de la cabina. libre de contaminación.
DMSO
Paso 8 Paso 7 Paso 6 Paso 5
*Tomar 750 μL de tripsina al
*Observar al microscopio *Eliminarla pipeta. *Cada pipeta o punta no deberá
0,25%.
invertido. *Homogenizar tocar ningún objeto o lugar.
*Añadir la tripsina por todo el
*Inactivar la tripsina con 3 ml *Aspirar el PBS. *Aspirar el medio del frasco ROUX.
frasco ROUX y dejar actuar por 2
de Medio suplementado. *Lavar las células con 5 ml de PBS
min.
*Añadir el medio suplementado estéril.
*Homogenizar
por donde se encuentran las *Colocar el PBS por el lado
*Llevar el frasco ROUX con la
células adheridas. contrario de las células adheridas.
tripsina a la incubadora por 2 min.
Paso 9 Paso 10
*Recoger la suspensión celular. *Aspirar el sobrenadante sin
*Vaciar en un tubo de 15 ml dañar el pellet.
estéril. *Tomar 1 ml de medio
*Eliminar la pipeta. suplementado.
*Centrifugar el tubo por 10 min *Resuspender el pellet
1600 r.p.m. suavemente 30 veces en 1 ml de
medio suplementado.
Viabilidad celular
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4
*Tomar 980ul de solución azul *Cálculos
tripán. *Tomar 20ul y cargamos la *Porcentaje de viabilidad *Porcentaje de viabilidad =
*Colocar en un microtubo cámara de Neubauer. celular. (células viables/nº células
estéril. *Ir al microscopio invertido. *Volumen de células necesarias totales) x 100.
*Tomar 20ul de la suspensión *Contar las células vivas en los 5 para llenar cada vial con *Número de células vivas/ml=
celular. cuadrantes de la cámara aproximadamente 2x106 cell/ml. células contadas vivas x el factor
*Resuspender 30 veces. Neubauer. de dilución x 10000.
Paso 8 Paso 7 Paso 6
Colocar en la gradilla los viales Criopreservación cálculos. Paso 5
*Resuspendemos 30 veces
*Colocamos 900ul de la estériles. 90% SFB
Cada vial se coloca: 1vial----------900ul *Suspensión celular
suspensión celular en cada vial. *Centrifugar 5min/1600 rpm.
*Colocamos 100ul de DMSO en = >90% SFB 5viales-------x
= >10% DMSO X=4.5 ml *Eliminar el sobrenadante.
cada vial. *PBS
*Colocamos el agente Resuspender el pellet celular en 10% DMSO
90% de suero fetal bobino 1vial----------100ul *Resuspender
crioprotector gota a gota por las *Alícuota 90% SFB y 10% DMSO.
paredes del vial. 5viales-------x
5 viales = 4.5 ml SFB
X=500 ml
Paso 9 Paso 10 Paso 12
Paso 11
*Cerrar herméticamente los *Colocar los viales en posición *Almacenar los reactivos a -4oC
*Almacenamos en el tanque
viales. vertical en un recipiente *Desechamos los objetos
nitrógeno líquido -196oC.
*Etiquetar: destinado para cripreservar. cortopunsantes.
-Nombre de la línea celular *Congelar paulatinamente en *Limpiar el área de trabajo.
-Concentración de células un congelador de -80oC por 24
-Fecha horas.
