BIOENSAYOS Y CITOTOXICIDAD
Los bioensayos son técnicas especializadas realizadas en organismos bajo condiciones
controladas de laboratorio y que pueden incluir cultivos celulares, bacterias, hongos,
insectos, plantas e incluso pequeños animales como helmintos o artrópodos. Los
bioensayos se utilizan en varias áreas de la ciencia para conocer las reacciones de algún
organismo ante la presencia controlada de una o varias sustancias. Las reacciones
pueden incluir diferentes efectos benéficos, pero también negativos, e incluso hasta la
toxicidad o muerte del organismo evaluado. También, los bioensayos pueden usarse
para describir los eventos implicados en la expresión de un fenómeno. Así, el uso de
bioensayos permite identificar la eficacia de una gran variedad de sustancias y
estandarizar su uso antes de realizar evaluaciones con vertebrados en condiciones in
vivo. Los bioensayos han cobrado gran relevancia ante las restricciones cada vez más
severas contra la experimentación con animales de laboratorio, domésticos o de
compañía
Existen sustancias con un amplio espectro de efectos sobre los organismos. Por tanto, es
necesario realizar más de un bioensayo para evaluar esas sustancias. Se dispone de una
gran variedad de bioensayos en función de los objetivos de investigación. Para realizar
un bioensayo es importante identificar: (a) qué sustancia será evaluada, (b) en qué
sustrato será utilizada, (c) en qué organismo se probará, y (d) qué tipo de respuesta
podría ser detectada, por ejemplo, efecto antimicrobiano, antihelmíntico o de toxicidad,
entre otros. Cuando el compuesto evaluado tiene efectos benéficos o adversos sobre un
organismo se considera que tiene actividad biológica o farmacológica. Dado que tanto
las sustancias a evaluar y los organismos pueden ser muy diversos, la actividad
biológica también puede ser diversa. Por ejemplo, hay bioensayos para el control de la
proliferación de hongos, bioensayos en plantas e incluso en helmintos, insectos,
arácnidos o crustáceos.
La toxicidad es la capacidad de una sustancia química que, al estar en contacto con un
organismo por exposición, ingestión, absorción, inyección, e inhalación en cantidad
suficiente, tiene la capacidad de ocasionar daño a células, tejidos, órganos o sistemas e
incluso provocar la muerte (Langman y Kapur 2006). En este contexto, los bioensayos
pueden servir para evaluar el potencial tóxico de sustancias e identificar los diferentes
daños o lesiones (Gámez y Más 2007). En los bioensayos de toxicidad la muerte es
considerada sólo como una respuesta biológica más (Pérez y Lazo 2010) y se reporta
como un valor de mortalidad o letalidad.
Los bioensayos muchas veces se usan como un primer paso para decidir si es relevante
investigar si alguna sustancia podría ser empleada en plantas, animales o humanos. Con
estas pruebas es posible calcular la concentración requerida para identificar algún
efecto. Por ejemplo, si se evalúa la letalidad o mortalidad sobre un organismo (bacteria,
parásito, etc.), la concentración requerida para matar el 50% de los organismos se
denomina concentración letal 50% (CL50) o concentración eficaz 50% (CE50%). Este
último término también puede aplicarse a procesos donde se esperan respuestas
positivas (reproducción, producción de alguna sustancia, etc.). Las CL50% o CE50%
permiten comparar sustancias diferentes y decidir cuál es más eficaz para alcanzar el
efecto deseado. También las CL50% permiten comparar las mismas sustancias en
diferentes sustratos, aislados, poblaciones, organismos, etc. Para identificar una
sustancia química benéfica de un determinado organismo, se espera que su efecto
favorable se logre a una baja concentración y su efecto tóxico se observe a una
concentración alta. Por otro lado, cuando se busca un efecto letal sobre un organismo
blanco, también es deseable que el efecto deseado se logre a la concentración más baja
posible.
Una amplia gama de organismos “modelo” son utilizados en los bioensayos in vitro, que
incluyen desde células o cultivos de células denominadas líneas celulares hasta
organismos más complejos como plantas de interés agrícola u otros organismos
importantes por sus implicaciones en la nutrición, producción y la salud animal o la
salud pública
Figura 1.-Organismo modelo utilizados para bioensayos de actividades biológicas
Líneas Celulares :
Son células de un tipo único (humano, animal o vegetal) que se han adaptado para
crecer continuamente en el laboratorio y que se usan en investigación. Estos bioensayos
cumplen varios propósitos, como son la producción de vacunas, la ingeniería de
proteínas, estudios de interacción/señalización celular, producción para trasplantes y la
reproducción “in vitro” de plantas de interés comercial o ensayos de nuevos
medicamentos. En la búsqueda de cualquier actividad biológica se debe confirmar si los
compuestos evaluados tienen un efecto tóxico sobre las células de plantas, animales o
humanos (i.e., efecto citotóxico, apoptosis). En algunos casos, el efecto tóxico sobre las
células constituye el elemento esencial como ocurre en los compuestos antitumorales
que atacan células que crecen sin control. Un ejemplo de este tipo de bioensayos es la
producción de Vincristina, que es un alcaloide de la planta vicaria (Catharantus roseus
(L.) G. Don) empleado como quimioterapéutico contra tumores venéreos transmisibles
en perros (van Zanden et al. 2005). Otro bioensayo de indicadores del metabolismo de
células tumorales es el de la determinación de la enzima lactato deshidrogenasa (Decker
y Lohmann 1988). En ocasiones los bioensayos emplean métodos o sustancias que de
manera indirecta permiten visualizar los efectos, ya sean benéficos o tóxicos, de las
sustancias, como el caso de los bioensayos de rojo neutro, metil tetrazolio y
sulforodamina B (Kaspers et al. 1994, Vichai y Kirtikara 2006, Repetto et al. 2008).
Bacterias y Hongos
Varios microorganismos ocasionan enfermedades en plantas, animales o humanos.
Tanto bacterias como hongos presentan una gran diversidad, por lo que también poseen
una amplia variación en su capacidad de crecimiento, reproducción y en los tipos de
enfermedades que ocasionan. Los bioensayos para microorganismos tienen múltiples
propósitos. Según Balouiri et al. (2016) los bioensayos se usan para determinar: (a) el
crecimiento con diversos microorganismos en agar (Figura 2F), (b) alguna respuesta
fisiológica como la bioluminiscencia o el flujo citofluorométrico, y (c) la curva de
mortalidad por densidad óptica. En condiciones ideales los bioensayos son la base para
evaluar el efecto biológico sobre animales o plantas en los que será empleado el
compuesto o producto. Por ejemplo, una vez que se demostró la actividad in vitro del
extracto de la planta Macleaya cordata (que contiene alcaloides), éste fue dosificado a
cerdos y mostró actividad contra cepas de bacterias de Salmonella enterica (Robbins et
al. 2013). Posteriormente se usó en la prevención de la enfermedad producida por tales
bacterias.
Protozoarios
Los bioensayos con protozoarios incluyen aquellos utilizados para la evaluación del
ecosistema microbiano del rumen (uno de los cuatro compartimientos digestivos o
estómagos de rumiantes como vacas, ovejas y cabras), por ejemplo, se ha evaluado el
efecto de los metabolitos secundarios de las plantas sobre la actividad fermentativa de
los protozoarios ruminales (Monforte-Briceño et al. 2005) y también existen bioensayos
orientados a evaluar el impacto de diversos compuestos sobre protozoarios patógenos
como Trypanosoma spp, Babesia spp, Toxoplasma spp y Eimeria spp (Croft y Weiss
1999).
Figura 2. Ejemplos de bioensayos utilizando distintas concentraciones de extractos o
compuestos contra: A y D) helmintos, B y E) Artemia salina, C) protozoarios, F) hongos.
Los nematodos gastrointestinales son parásitos que representan un problema a escala
global en humanos, animales de compañía y de granja. En estos parásitos los bioensayos
pueden usarse para evaluar la eficacia antihelmíntica de drogas convencionales y no
convencionales como los extractos de plantas. Los bioensayos comúnmente se realizan
con nematodos relevantes de humanos o animales. En estos parásitos el producto natural
se evalúa sobre diferentes fases de desarrollo como huevos, larvas o adultos (Castañeda-
Ramírez et al. 2018)
Los insectos y ácaros también se usan como modelos ya que en muchos casos son
transmisores de enfermedades y/o al mismo tiempo representan un problema para la
producción agropecuaria y salud humana. Por ejemplo, las garrapatas Rhipicephalus
microplus pueden ser vectores de enfermedades causadas por Babesia bovis, B.
bigemina, Anaplasma marginale, entre otros. Estas garrapatas son utilizadas como
modelo para detectar el efecto de diversos antiparasitarios convencionales o extractos de
plantas a través de la evaluación de la supervivencia y reproducción (Rosado-Aguilar et
al. 2010). Otro modelo de relevancia mundial son los mosquitos (géneros Anopheles,
Culex y Aedes) que son vectores de enfermedades como malaria, filariasis,
chikungunya, dengue, fiebre amarilla, entre otras. Los bioensayos aplicados en
mosquitos tienen la finalidad de inhibir su crecimiento o reproducción, así como repeler
y disuadir la ovoposición (Sukumar et al. 1991).
También existen los bioensayos de toxicidad que usan larvas del crustáceo Artemia spp,
esta prueba es muy utilizada por su bajo costo y su fácil implementación y es una
prueba estándar en ensayos preliminares de citotoxicidad de pesticidas, productos
naturales marinos, agentes antitumorales, y extractos de plantas con actividad
farmacológica. La pertinencia de este ensayo se refleja en una buena correlación entre la
letalidad de extractos de plantas aplicados a Artemia salina (in vitro) y la dosis letal oral
proporcionada a ratones (in vivo)
Plantas
Varias plantas pueden ser utilizadas como modelos para evaluar sustancias bioactivas
con diversos tipos de actividad sobre otras plantas. Los estudios alelopáticos (Macías et
al. 2001) permiten obtener nuevos inhibidores de crecimiento de organismos
indeseables. Estos productos tendrían ventajas sobre los plaguicidas tradicionales por
ser activos sobre diferentes sitios de acción de la planta, así como por la posibilidad de
no dejar residuos en el ambiente o en los tejidos de otras plantas o animales.
Citotoxicidad:
La toxicidad celular o citotoxicidad se define como los efectos adversos que resultan de
la interferencia con estructura, procesos celulares, o ambos, que se suceden en todas las
células y son esenciales para el funcionamiento, supervivencia y proliferación celular
Los ensayos de citotoxicidad, son capaces de detectar mediante diferentes mecanismos
celulares conocidos, los efectos adversos de interferencia con estructura y/o propiedades
esenciales para la supervivencia celular, proliferación y/o funciones. Dentro de estos se
encuentran la integridad de la membrana y del citoesqueleto, metabolismo, síntesis y
degradación, liberación de constituyentes celulares o productos, regulación iónica y
división celular. Con el desarrollo de mejores y nuevas herramientas como son los
bioensayos de toxicidad (Artemia salina) y citotóxicos in vitro empleando líneas
celulares, se realizó con mayor exactitud y rapidez los estudios citotóxicos que permiten
el aislamiento de nuevos fitofármacos.
Un bioensayo involucra organismos vivos, permite realizar mediciones experimentales
del efecto de agentes químicos en sistemas biológicos, El bioensayo de "letalidad de
larvas de Artemia salina" consiste en la determinación de la DL50 (Dosis Letal Media)
de los extractos de las plantas; se ha encontrado una correlación entre ensayos
in vitro y en vivo (r = 0,85 p < 0.05), empleando artemia y ratones, este método es una
herramienta útil para predecir la toxicidad oral aguda en extractos de plantas.
Como se indicó una línea celular es un grupo de células de tipo único (animal o vegetal)
que se han adaptado para crecer continuamente in vitro y que se usan en
investigación.Las líneas celulares derivadas de neoplasias humanas, se han convertido
en una de las principales herramientas de apoyo para realizar evaluación citotóxica de
extractos vegetales, siendo una técnica sensible, que genera resultados reproducibles y
válidos. Por estas razones las muestras cancerígenas in vivo fueron remplazadas por un
sistema in vitro el cual comprende cerca de 60 líneas celulares de tumores cancerígenos
humanos.
En 1982, Meyer et al. , fueron los primeros en introducir el uso de las larvas
de Artemia spp. en sustitución de animales superiores en la evaluación de extractos
vegetales para el descubrimiento de compuestos con actividad antitumoral y citotóxica.
Este ensayo se utiliza para la pre-evaluación de extractos vegetales en el descubrimiento
de compuestos antitumorales . Inicialmente, se determinó que existe una correlación
positiva entre la mortalidad de las larvas de artemia y la citotoxicidad frente a las
células 9KB (carcinoma nasofaríngeo humano) y la línea celular 3PS(P388)
(leucemia in vivo) . En general, los valores de ED50 para las citotoxicidades son
aproximadamente una décima parte de los valores de LC50 encontrados en los ensayos
con Artemia spp. En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Pardue Cancer Center se
utilizó el ensayo de artemia para la evaluación inicial de seis líneas celulares de tumores
humanos. De este modo, es posible detectar y entonces monitorear el fraccionamiento
de extractos con actividad citotóxica, utilizando el ensayo de mortalidad de larvas más
que otros ensayos antitumorales in vivo o in vitro que resultan más tediosos y costosos
Para ilustrar lo anterior tenemos el trabajo de Avalos-Soto J. et al 2014 que para realizar
la evaluación citotóxica de los extractos etanólicos de Azadirachta indica (A. Juss)
empleó las líneas celulares MCF7 (Cáncer de mama), HaCat (Queratinocitos Humanos)
y CaLo (Cáncer cervicouterino) indicando que porcentaje de células muertas se
determinó a partir del promedio de las absorbancias obtenidas de pozos tratados y no
tratados. Se graficaron los valores de concentración de los extractos contra el porcentaje
de viabilidad para obtener la IC50. Concluyendo que el extracto crudo de hoja de neem
fue el que presento una mayor actividad con una IC50 de 22.03 µg/mL sobre la línea
MCF7 (Cáncer de mama), la partición hexánica de hoja de neem fue la más activa sobre
la Línea Celular MCF7 (Cáncer de mama) con una IC50 25.17 µg/mL; pudiendo estos
extractos ser considerados como potenciales coadyuvante en el tratamiento de esta
enfermedad. ( Anexo 01)
Conclusiones
Los bioensayos son técnicas importantes para estudiar las interacciones entre sustancias
y organismos. Permiten identificar los gradientes de concentración necesarios para
observar algún efecto (actividad biológica) entre sustancia y organismo incluyendo la
muerte de estos. Entre los organismos utilizados como modelos para los bioensayos se
encuentran las líneas celulares, bacterias, hongos, protozoarios, nematodos
gastrointestinales, insectos, ácaros, crustáceos y diversas plantas
Referencias Bibliográficas:
1.- Cervantes et al . Bioensayos in vitro de relevancia en las ciencias biológicas y
agropecuarias. Bioagrociencias. Volum 12 N1
2.- Valderrama JA, Ibacache JA, Arancibia V, Rodriguez J, Theoduloz C. Studies on
quinones. Part 45: Novel 7-aminoisoquinoline-5,8-quinone derivatives with antitumor
properties on cancer cell lines. Bioorg Med Chem. 2009 Apr;17(7):2894–901. doi:
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3.- Rodríguez CE, Shinyashiki M, Froines J, Yu RC, Fukuto JM, Cho AK. An
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system. Toxicology. 2004 Sep;201:185–96.
4.- Ávalos-Soto J et al . Evaluación citotóxica de los extractos etanólicos de Azadirachta
indica (A. Juss) sobre diferentes líneas celulares. Rev. mex. cienc. farm 2014 Sep;
45( 3 ): 39-44.
5.- Veciana Galindo C.et al .. Evaluación de la citotoxicidad y bioseguridad de un
extracto de polifenoles de huesos de aceitunas. Nutr. Hosp. . 2014 Jun] ; 29( 6 ): 1388-
1393.
ANEXO 01
VALORES DE IC 50 DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS DE AZADIRACHTA
INDICA (A. JUSS) SOBRE LA LINEA CELULAR MCF 7
