“Año de la unidad, la paz y el desarrollo”

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

E.A.P. DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

BIOQUIMICA I
PRACTICA N° 05

TEMA: EFECTOS DE CONCENTRACIONES SATURANTES DEL

SUSTRATO SOBRE UNA CONCENTRACION CONSTANTE DE ENZIMA
MICHAELIS Y MENTEN

DOCENTE: Mg. Enrique León Mejía

[email protected]

TURNO: Noche CICLO: VI SECCCION: FB6N4

INTEGRANTES: 1. Esteban Carhuallanqui, Rondy Rufino.

2. Eulogio Castro, Sonali Lindy.
3. Medina Berrocal, Andrea Karin. (LIDER)
4. Milla Liñan, Mario Antonio.
5. Torres Barrial, Luis Enrique.

FECHA DE REALIZADA LA PRACTICA: 2204/ 2023

FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 28/04/ 2023
2023-I
 INDICE

Pág.

1. Introducción.........................................................................................1

2. Marco teórico.........................................................................................

3. Parte experimental.................................................................................

3.1. Equipos y materiales a usar:

3.2. Reactivos:

3.3. Muestra:

3.4. Procedimiento:

4. Resultados..............................................................................................

5. Conclusiones.........................................................................................

6. Cuestionario...........................................................................................

7. Referencias bibliográficas....................................................................
 EFECTOS DE CONCENTRACIONES SATURANTES DEL SUSTRATO
SOBRE UNA CONCENTRACION CONSTANTE DE ENZIMA MICHAELIS Y
MENTEN

1. INTRODUCCION
Los efectos de las concentraciones saturantes del sustrato
sobre una concentración constante de enzima Michaelis y
Menten. Estamos a punto de abordar uno de los principios
clave en la descripción de la velocidad de una reacción
química catalizada por una enzima. Si bien muchos de los
aspectos de la química de la enzima pueden resultar
complicados, el concepto básico es el de cómo los cambios
en la concentración del sustrato pueden afectar la velocidad
de la reacción. Para hacer esto, veremos cómo la relación
entre la concentración y la velocidad se ve afectada por el uso
de concentraciones saturantes del sustrato. Esto nos permitirá
estudiar cómo la actividad de la enzima puede ser afectada
por la concentración de sustrato. Al final de esta sección,
entenderás por qué los conceptos Michaelis y Menten son tan
importantes para el estudio de la bioquímica.
La mayoría de estos efectos incluyen la activación de la
enzima, la desactivación de la misma, el cambio en el nivel de
actividad, el aumento de la velocidad de reacción y el cambio
en el número de complejos enzima sustrato. Esto es
importante porque nos ayuda a entender cómo los cambios en
la cantidad de sustrato pueden afectar la producción o la
actividad de una enzima.
 2. MARCO TEORICO
2.1 ACTIVIDAD ENZIMATICA:
Las enzimas son proteínas altamente especializadas que catalizan numerosas
reacciones en los sistemas biológicos. Una propiedad importante es su
especificidad a la hora de reaccionar con sustratos, acelerando determinadas
reacciones químicas en disolución.
En general, un enzima proporciona el ambiente en que una reacción
determinada es, energéticamente, más favorable. El rasgo distintivo de una
reacción catalizada enzimáticamente es que ocurre en un lugar específico del
enzima, el sitio activo, la molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa
el enzima se denomina sustrato. El complejo enzima – sustrato formado es de
vital importancia para definir el comportamiento cinético de las reacciones
catalizadas. Una reacción enzimática sencilla puede formularse como sigue:

Donde E, S y P presenta enzima, sustrato y producto respectivamente. ES y

PE son complejos de enzima con el sustrato y con el producto.
La función del catalizador es aumentar la velocidad de una reacción reduciendo
la energía de activación de la misma. Ea los catalizadores no modifican los
equilibrios de la reacción ni se consumen mediante el proceso.
2.2 VELOCIDAD DE REACCION. CINETICA DE MICHAELIS–MENTEN
La velocidad de una reacción cualquiera viene determinada por la
concentración de reactivos y por una constante de velocidad k, y expresada por
una ley de velocidad. Por ejemplo, para una reacción unimolecular o de primer
orden, S → P, la cantidad de S que ha reaccionado por unidad de tiempo viene
dado por la siguiente expresión:
Donde K tiene unidades de S -1 y S de mol -1. Así pues, la concentración de
sustrato, [S], afecta a la velocidad de una reacción catalizada por un enzima.
No obstante, el estudio del efecto de [S] en una reacción enzimática no es
simple. Este tipo de comportamiento cinético es explicado por la teoría de
Michaelis y Menten, que postula que el enzima se combina con el sustrato en
un paso reversible rápido, para dar el complejo ES, según se muestra en la
reacción

La reacción de esta forma alcanza rápidamente un estado estacionario en el

que [ES] permanece aproximadamente constante con el tiempo. El complejo
ES se descompone seguidamente en un segundo paso más lento que limita la
velocidad de la reacción global dando el enzima libre E y el producto de
reacción P. Por tanto, la ley de velocidad para la reacción global viene
determinada por la etapa más lenta, según indica la ecuación

donde V se determina por la descomposición de ES. Bajo las condiciones de

estado estacionario ([ES]=cte) la velocidad del proceso se mantiene constante
en los primeros estadios de la reacción y coincide con la velocidad inicial, Vo.
Experimentalmente Vo puede determinarse calculando la pendiente de la
representación de [P] frente al tiempo.
Además, a medida que la concentración inicial de S aumenta, desplazando el
equilibrio hacia la formación de ES, también lo hace Vo hasta alcanzar un valor
constante. Este valor final se denomina velocidad máxima, Vmax. Esto se
observará cuando prácticamente todo el enzima esté formando complejo ES y
la concentración de E libre sea extremadamente pequeña ([ES]=[Et], donde Et
es la concentración total de enzima utilizada). En estas condiciones, el enzima
está saturado por el sustrato, de forma que un aumento adicional en la [S] ya
no tiene efecto sobre la velocidad inicial del proceso. De esta manera, se
puede definir que Vmax = k2·[Et], la cual varía de un enzima a otro, y donde k2
se define de manera general como kcat, una constante de velocidad de primer
orden que se denomina número de recambio.
Utilizando la aproximación del estado estacionario, se obtiene la Ecuación de
Michaelis-Menten:

La expresión [6] puede transformarse en la Ecuación de Lineweaver-Burk, la

cual es más útil para la determinación de Km y Vmax. Esto se lleva a cabo
tomando la inversa de la ecuación de Michaelis-Menten:

Los parámetros cinéticos kcat y Km son útiles para el estudio y comparación de

los diversos enzimas a través de su eficiencia catalítica. La eficiencia catalítica
se define como la relación entre ambos (kcat/Km).
Muchas enzimas actúan de manera similar a la enzima hipotética del ejemplo
anterior, generan curvas parabólicas cuando se grafica la velocidad de reacción
como función de la concentración de sustrato. Las enzimas que muestran este
comportamiento pueden describirse la mayoría de las veces con una ecuación
que relaciona la concentración del sustrato, la velocidad inicial, la Km y Kmax,
conocida como ecuación de Michaelis-Menten. Las enzimas cuya cinética
obedece dicha ecuación se denominan enzimas michaelianas.
Las enzimas Michaelis-Menten son diferentes a las enzimas alostérica.
Las enzimas alostéricas normalmente tienen múltiples sitios activos y a
menudo muestran cooperatividad, esto es, que la unión de un sustrato a un
sitio activo aumenta la capacidad de otros sitios activos para unir y procesar
sustratos.
Constante de Michaelis-Menten (KM): Informa sobre la concentración de
sustrato a la que están ocupados el 50% de los centros activos (mitad de la
velocidad máxima). Da una idea de la afinidad de la enzima por el sustrato.
Tiene unidades de concentración.
Velocidad máxima (Vmax): Velocidad de reacción para una determinada
cantidad de enzima saturada por el sustrato. Da una idea de la potencia
catalítica de la enzima. Tiene unidades de concentración por unidad de tiempo.
Número de recambio (kcat): Número de moléculas de sustrato procesadas
(recambios) por unidad de tiempo por una molécula de enzima, en condiciones
saturantes. Tiene unidades de (tiempo)-1. Cada molécula de sustrato es
procesada por la enzima en un tiempo igual a 1/kcat
Eficiencia catalítica (kcat/KM): Constante de velocidad aparente para la
reacción de segundo orden entre enzima y sustrato, a bajas concentraciones
de este último. Da una buena idea de lo eficiente que es la enzima, porque
cuantifica tanto la catálisis como la interacción. Tiene unidades de
(concentración x tiempo)-1.
 3. PARTE PROCEDIMENTAL

EQUIPOS Y MATERIALES
 Espectrofotómetro. B.M.

 Tubos de
prueba de 16 x 150mm.

 Pipetas de 1 y 10 mL.
  Gradillas.

REACTIVOS

 Solución de albúmina al 2 %.
Solución de pepsina al 1%.
  Ácido clorhídrico 1N. Agua destilada

PROCEDIMIENTO

● En una gradilla ponemos 7 tubos de ensayo y procedemos a agregar los

volúmenes de cada reactivo como dispone la siguiente tabla:
 Luego a nuestros tubos agregamos las cantidades de agua
destilada, la HCl 1N, y la albúmina correspondiente. Procedemos
a leer en el espectrofotómetro a 440 nanómetros nuestros 7 tubos
de ensayo. Los datos resultantes de la lectura se considerarán
como una lectura inicial.
 Luego encubamos los
7 tubos de ensayo a 37 °C por 5 minutos, en baño maría.
 Pasado el tiempo requerido, procedemos a adicionar 0,5 ml de
pepsina a cada uno de nuestros tubos de ensayo e incubar de
nuevo pero esta vez por 10 minutos en baño maría.
  Una vez pasado los 10 minutos en baño Maria, se realiza hacer a baño
de hielo, para enfriar los tubos, pero en este caso se realizó con agua
fría a falta de este material en el laboratorio.

● Después procedemos a leer en el espectrofotómetro a 440 nanómetros

nuestros 7 tubos de ensayo por última vez, dando así la lectura final.
 4. RESULTADOS

NUMEROS DE ABSORBANCIAS (LECTURA ABSORBANCIAS (LECTURA ACTIVIDAD

TUBOS INCICIAL FINAL) ENZEMATICA
1 0.446 0.454 -0.008
2 0.182 0.177 0.005
3 0.266 0.242 0.024
4 0.305 0.28 0.025
5 0.357 0.325 0.032
6 0.439 0.355 0.084
7 0.448 0.331 0.117

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZEMA-

TICA
12

10

0
0 2 4 6 8 10 12
5. RESULTADOS
6. CONCLUSIONES
- A medida que las concentraciones del sustrato aumentan, la
velocidad de la reacción crece hasta alcanzar un máximo, luego
disminuye gradualmente a medida que continuamos aumentando la
concentración del sustrato. Esto se debe a que, una vez que un
número determinado de sitios activos se encuentran "llenos", el
sustrato no puede reaccionar con la enzima. Esto a veces se conoce
como la ley de las cantidades limitadas.
- Se determino el experimento de la pepsina usando como sustrato la
albulina y se observa en la grafica diferentes resultados entre
MICHAELIS-MENTE Y LINEWEAVER-BURK de los cuales el
resultado responde al sustrato diferente.
7. CUESTIONARIO
7.1 Esquematice los factores que afectan la actividad enzimática.
7.2 Explique en que consiste la cooperatividad en los enzimas.
7.3 Grafique la bomba de sodio y potasio y describa su importancia
biológica.
7.4 Elabore un mapa conceptual acerca de los transportes que se realizan
a través de los ionoferos.
7.5 Explique las aplicaciones clínicas de la ecuación de LINEWABER Y
BURK.
8. REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS
 de Cátedra L. Catálisis enzimática [Internet]. Edu.ar. [citado el 27 de
abril de 2023]. Disponible en:
https://libros.unlp.edu.ar/index.php/unlp/catalog/download/690/660/2
291-1
 file:///C:/Users/usuario/Downloads/Dialnet-
CineticaEnzimaticaPractica-90191%20(1).pdf