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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS BASICAS Y APLICADAS

Manual para el trabajo del laboratorio de

Bioquímica

M.C. ANGELICA ORTEGA GARCÍA

DRA. ROBERTA SALINAS MARÍN

NOMBRE:_________________________________________________

Cuernavaca, Morelos, Enero del 2023

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ÍNDICE
PRÓLOGO .................................................................................................................. 1
DISTRIBUCIÓN DE SESIONES ................................................................................. 2
FORMATO DEL REPORTE DE PRÁCTICAS ............................................................ 3
CONSIDERACIONES PARA LLEVAR A CABO LA DISCUSIÓN DE PRÁCTICAS . 5
HIGIENE Y SEGURIDAD ............................................................................................ 8
REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO ...................................................... 8
RECOMENDACIONES ANTES DE TRABAJAR CON SUSTANCIAS QUÍMICAS .... 9
PRÁCTICA NO. 1...................................................................................................... 12
DISEÑO Y EVALUACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS ...................... 12
PRÁCTICA NO. 2...................................................................................................... 29
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS ...................................................................................... 29
PRACTICA NO. 3...................................................................................................... 60
CINÉTICA ENZIMÁTICA........................................................................................... 60
PRÁCTICA NO. 4...................................................................................................... 85
ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS ........................................................................... 85
.................................................................................................................................. 86
PRÁCTICA NO. 5.................................................................................................... 102
ANÁLISIS DE LÍPIDOS........................................................................................... 102
PRACTICA NO. 6.................................................................................................... 117
AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE ADN PLÁSMIDICO ............................... 117
PRÁCTICA NO. 7.................................................................................................... 130
METABOLISMO CELULAR.................................................................................... 130

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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Montaje para evaluar los pkas de la Glicina. .......................................................................................... 24
Figura 2. Formación del enlace peptídico. ............................................................................................................. 29
Figura 3. Reacción entre un aminoácido y ninhidrina. ........................................................................................... 30
Figura 4. Reacción entre un aminoácido y el Reactivo de Biuret. .......................................................................... 31
Figura 5. Electroforesis de proteínas en poliacrilamida. ........................................................................................ 55
Figura 6. Esquema general de la reacción enzimática. .......................................................................................... 60
Figura 7. Variación de la velocidad de reacción a diferentes concentraciones de sustrato. ................... 62
Figura 8. Modelo de Lineweaver-Burk y su representación gráfica. ...................................................................... 63
Figura 9. Disacárido reductor y no reductor. ......................................................................................................... 86
Figura 10. Reacción de Fehling en presencia de carbohidratos reductores. .......................................................... 86
Figura 11. Identificación de carbohidratos con ácido sulfúrico. ............................................................................. 87
Figura 12. Cálculo del RF en cromatografía. .......................................................................................................... 96
Figura 13. Identificación de azúcares reductores en leche. .................................................................................... 98
Figura 14. Tipos de ácidos grasos. ....................................................................................................................... 103
Figura 15. A) Ejemplos de fosfolípidos presentes en la yema de huevo. B) Gangliósidos en cerebro
bovino. 1) Patrón de gangliósidos de cerebro bovino y 2) Extracto crudo de gangliósidos. ................. 113
Figura 16. Plásmido TOPO 3.3 con el gen SLC35A1 .................................................................................. 122
Figura 17. Metabolismo de la glucosa para la síntesis de ATP. ........................................................................... 131

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Accesorios de seguridad necesarios para poder trabajar en el laboratorio. ............................................ 10

Tabla 2. Comparación del pH teórico y pH experimental. ...................................................................................... 20
Tabla 3. Comportamiento del pH durante la adición de un ácido o una base. ...................................................... 22
Tabla 4. Valores de pH de la solución de Glicina durante la adición de HCl. .......................................................... 25
Tabla 5. Valores de pH de la solución de Glicina durante la adición de NaOH. ..................................................... 25
Tabla 6 Comparación de métodos de cuantificación de proteínas. ...................................................................... 32
Tabla 7. Pruebas cualitativas para la identificación de aminoácidos. ................................................................... 38
Tabla 8. Valores de RF´s calculados a las diferentes fases móviles utilizadas........................................................ 40
Tabla 9. Identificación del grado de desnaturalización por el uso de agentes desnaturalizantes. ........................ 43
Tabla 10. Curva de estándar para el método de Biuret. ........................................................................................ 45
Tabla 11. Registro de volúmenes de muestra en la preparación de diluciones. ....................................... 46
Tabla 12. Curva de estándar para el método de Bradford. .................................................................................... 47
Tabla 13. Cuantificación de proteínas séricas con los métodos Biuret y Bradford. ................................................ 49
Tabla 14. Componentes del gel de separación y concentración. ........................................................................... 52
Tabla 15. Cálculo de la migración relativa de las proteínas del marcador de peso molecular. ............................. 55
Tabla 16. Cálculo de la migración relativa de las proteínas identificadas en suero humano. ............................... 56
Tabla 17. Registro de la altura de oxígeno producido por la catalasa al utilizar 1, 2 y 3 cubos de
papa/zanahoria ó mL de levadura. ................................................................................................................... 69
Tabla 18: Registro del volumen de oxígeno promedio producido por la catalasa al utilizar 1, 2 y 3
cubos de papa/zanahoria ó 0.2, 0.6 y 1 mL de levadura. [V=((  * r2))*Hn], donde Hn es la altura
dependiendo el número de cubos o mL de levadura. .................................................................................... 70
Tabla 19. Efecto de la concentración de enzima en la velocidad inicial de la reacción enzimática. ...... 70
Tabla 20. Registro de la altura de Oxígeno producido por la catalasa al utilizar 5, 40 y 60°C ............... 72
Tabla 21. Registro del volumen de oxígeno promedio producido por la catalasa al utilizar 10, 40 y
60°C. ..................................................................................................................................................................... 72

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Tabla 22. Efecto de la temperatura en la velocidad inicial de la reacción enzimática. ............................. 73

Tabla 23. Registro de la altura de oxígeno producido por la catalasa al utilizar pH 4, 7 y 10. ................ 75
Tabla 24. Registro del volumen de oxígeno producido por la catalasa al utilizar pH 4, 7 y 10. .............. 75
Tabla 25. Efecto del pH en la velocidad inicial de la reacción enizmática. ................................................ 76
Tabla 26. Variaciones en la concentración de sustrato. ................................................................................ 78
Tabla 27. Registro de la altura de oxígeno producido por la catalasa al utilizar las diferentes
concentraciones de sustrato. ............................................................................................................................. 78
Tabla 28. Registro del volumen de oxígeno producido por la catalasa al utilizar 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y
3.0 % en cada condición. ................................................................................................................................... 79
Tabla 29. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de zanahoria.................................... 81
Tabla 30. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de papa ............................................ 81
Tabla 31. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de levadura de panificación .......... 81
Tabla 32. Comparación de los parámetros cinéticos ..................................................................................... 82
Tabla 33. Solubilidad de azúcares en agua y alcohol. ............................................................................................ 92
Tabla 34. Identificación de azúcares reductores. ................................................................................................... 92
Tabla 35. Reacción de Fehling con sacarosa antes y después de la hidrólisis. ....................................................... 93
Tabla [Link]ón de Fehling con almidón antes y después de la hidrólisis. ......................................................... 93
Tabla 37. Factores de retención de las muestras problema evaluadas. ................................................................ 96
Tabla 38. Cuantificación de Lactosa en leches de diferentes marcas ........................................................ 99
Tabla 39. Solubilidad de lípidos. ........................................................................................................................... 108
Tabla 40. Registro de los aceites analizados ........................................................................................................ 109
Tabla 41. Índices de acidez teórico y experimental de aceites. ............................................................................ 109
Tabla 42. Etapas de la extracción de colesterol a partir de ____________ ............................................ 111
Tabla 43. Rf´s experimentales de las muestras de hígado. .................................................................................. 114
Tabla 44. Rf´s experimentales de las muestras de cerebro. ................................................................................. 114
Tabla 46. Cultivo y purificación de ADN plasmídico por lisis alcalina. ...................................................... 123
Tabla 47. Cuantificación de ADN plasmídico ................................................................................................ 125
Tabla 48. Mapa de carga de las muestras extraídas por equipo ......................................................................... 127
Tabla 49. Valores de pH de orina de estudiantes que se han mantenido en reposo. ........................................... 135
Tabla [Link] de pH de orina de estudiantes que realizaron ejercicio intenso. .............................................. 137
Tabla 51. Cinética de crecimiento de bacteria de E coli, con y sin KCN. ............................................................... 139
Tabla [Link] de pH en el medio posterior a la adición de glucosa. ........................................................ 141

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PRÓLOGO

El presente manual tiene como objetivo principal introducir al estudiante en el análisis

de biomoléculas e integración del conocimiento en alguna de las vías del metabolismo.
El manual se encuentra dividido en tres bloques. En el primer bloque de este
documento, se realiza un repaso de conceptos básicos de Química General y Química
Analítica con la finalidad de que el alumno reflexione sobre la importancia de los
cálculos, uso correcto de material volumétrico y graduado en la preparación de
disoluciones, así como la importancia y el funcionamiento de las soluciones
amortiguadoras. En el segundo bloque, se realizan análisis cualitativos de proteínas,
carbohidratos y lípidos mediante reacciones de oxidación y reducción. En este manual
se proponen métodos de aislamiento convencionales de estás biomoléculas, con la
finalidad de utilizar la electroforesis y la cromatografía en capa fina para analizar la
pureza y la polaridad de las mismas. También se incluyen métodos de análisis
cuantitativo de carbohidratos y proteínas utilizando técnicas colorimétricas y
volumétricas. Por otro lado, se propone una estrategia para evaluar los factores a
considerar para caracterizar los parámetros cinéticos de la enzima catalasa obtenida
a partir de diferentes fuentes biológicas tales como: zanahoria, papa, levadura de
panificación e hígado de pollo. Además, este manual muestra a los estudiantes la
purificación, cuantificación y electroforesis de ADN plasmídico. Finalmente, en el último
bloque se analiza la importancia de la Respiración celular y la cadena transportadora
de electrones mediante la inhibición del crecimiento microbiano utilizando inhibidores
y desacoplantes de estas vías metabólicas
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DISTRIBUCIÓN DE SESIONES

PRÁCTICA SESIONES ACTIVIDADES

Actividad 1-2
1. DISEÑO Y EVALUACIÓN DE
2
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Actividad 3/Análisis de
resultados
Actividad 1-3
Actividad 4
2. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 4
Actividad 5
Análisis de resultados
Actividad 1-3
Actividad 4-5
3. CINÉTICA ENZIMÁTICA 3
Actividad 6/Análisis de
resultados
Actividad 1
4. ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS 3 Actividad 2-3
Análisis de resultados
Actividad 1-3
5. ANÁLISIS DE LÍPIDOS 2
Análisis de resultados

6. AISLAMIENTO Y Actividad 1- 2
CUANTIFICACIÓN DE ADN 2 Actividad 3/ Análisis de
PLASMÍDICO resultados
Actividad 1- 2
7. METABOLISMO CELULAR 2 Actividad 3- 4/ Análisis
de resultados

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FORMATO DEL REPORTE DE PRÁCTICAS

El manual puede ser usado como bitácora ya que tiene espacio suficiente para incluir
anotaciones, y contiene tablas de resultados. Por lo tanto en la bitácora se debe
registrar la fecha en la que se llevó a cabo el trabajo experimental, diagramas de flujo,
cálculos, observaciones, discusión de resultados, conclusiones, cuestionario resuelto.

El informe final de cada práctica, tiene el objetivo final que los estudiantes sean
capaces de organizar, analizar y discutir los resultados obtenidos con bases teóricas
sustentadas en bibliografía consultada. A partir de esta experiencia los estudiantes son
capaces de elaborar conclusiones y recomendaciones para mejorar la realización de
la práctica.

El reporte de cada una de las prácticas será entregado siete días posteriores al término
de ella, basado en el siguiente orden:

Portada
Debe incluir: nombre de la institución en donde se imparte el laboratorio, nombre del
laboratorio, nombre y número de la práctica, nombre de los alumnos involucrados en
la elaboración del reporte, nombre de la profesora, fecha de realización de la práctica
y fecha de entrega de ésta.

Objetivo
Son las metas a corto plazo que se deben cubrir durante el desarrollo de la actividad
experimental. Los objetivos están proporcionados en el manual.

Introducción
Este manual proporciona una introducción para cada una de las prácticas para que los
alumnos tengan claro el fundamento teórico de la actividad experimental, la cual ya no
se debe incluir en la entrega del reporte. Para el reporte se solicita incluir el mapa
conceptual en donde se incluya conceptos de los temas abordados durante todas las
actividades experimentales. Este mapa conceptual va a ser entregado un día previo a
la sesión experimental. El profesor lo revisará y les entregará la retroalimentación del
documento para que uds., lo corrijan y lo incluyan ya corregido junto con el reporte de
práctica.

Materiales y Reactivos
Enlistar todos los materiales utilizados en la realización de la práctica.

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Metodología
Se representará en un diagrama de flujo que deberá de ser breve, claro y completo
para que los experimentos puedan ser reproducibles. Este diagrama de flujo va a ser
entregado un día previo a la sesión experimental. El profesor lo revisará y les entregará
la retroalimentación del documento para que uds., lo corrijan y lo incluyan ya corregido
junto con el reporte de práctica.

Resultados
Los resultados deben ser presentados en forma de texto, tabla y/o gráfica, de acuerdo
a lo solicitado por cada actividad práctica. Se aceptan propuestas de la presentación
de los resultados de acuerdo a la creatividad del equipo de trabajo.

Discusión
Esta parte debe ser entregada de forma INDIVIDUAL.
La discusión deberá de estructurarse a partir de la interpretación de los resultados. En
esta sección deberá de indicarse que resultados eran esperados, porqué, y los
resultados obtenidos como se compraran a los esperados. Sí los resultados son
diferentes, discutir los factores que pudieran influir en ellos. Para llevar a cabo la
discusión, se debe revisar de manera amplia la información relacionada con el tema
estudiado. Al final de este apartado se anexan comentarios referidos a los puntos
relevantes a considerar para cada una de las prácticas a realizar.

Conclusión
La conclusión debe estructurarse tomando en cuenta el objetivo de la práctica, los
resultados obtenidos y la discusión.

Cuestionario
Se deberán responder las preguntas generadas al final de cada práctica, que está
relacionado con los fundamentos, la relevancia de los resultados o la metodología
utilizada.

Bibliografía
Libros, páginas web, artículos que se consultaron para realizar la introducción y
contestar el cuestionario, deberá ser reportado de acuerdo al formato APA.

Firma de aceptación
Cada uno de los integrantes del equipo deberá firmar de conformidad sobre el
contenido del reporte.

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Evaluación del Reporte de Práctica en equipo: De acuerdo a la rúbrica, el reporte

de prácticas se evalúa bajo los siguientes rubros:

Puntaje
Introducción (mapa conceptual y diagrama de flujo) 0
Resultados (fotos, tablas, gráficas y cálculos 10
Discusión grupal 10
Conclusión grupal 5
Cuestionarios 2.5
Bibliografía formato APA 2.5

CONSIDERACIONES PARA LLEVAR A CABO LA DISCUSIÓN DE PRÁCTICAS

Práctica 1:
*Identificar las diferencias de las concentraciones de las soluciones preparadas.
*Comparar el pH experimental y el teórico.
*Identificar las soluciones que tienen la capacidad de amortiguar cambios de pH.
Evidenciar si existe diferencia entre la solución 0.1 M y 0.01 M
*Comparar los pka´s de la glicina teórico vs experimental; el pI teórico vs experimental.
Identificar si la glicina puede funcionar como un amortiguador.

Práctica 2:
*Mencionar cuales fueron las muestras que reaccionaron con los diferentes reactivos
y especificar la parte de la molécula que participa en la reacción.
*Identificar la muestra problema y mencionar como fue que llegaron a dicha deducción.
*Analizar el efecto de la fase estacionaria y la fase móvil sobre la elución de las
muestras de aminoácidos en el método de cromatografía. Identificar la mejor fase móvil
en base tomando como referencia la mejor separación entre muestras.
*Mencionar el efecto que tienen los diferentes factores desnaturalizantes sobre las
diferentes proteínas analizadas, identificar cuales tienen mayor efecto y recordar que
las diferencias observadas son en función de la estructura primaria de la proteína
evaluada.
*Identificar la sensibilidad de los métodos de cuantificación y su principio de acción.
Comparar las diferencias operativas que ejecutó durante la manipulación de la muestra
en los diferentes métodos.

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*Comentar sobre la presencia de las proteínas que deben estar presentes en el suero
humano: Albúmina, Alpha-1, Alpha-2, Beta y gamma. Mencionar el tamaño de las
proteínas de acuerdo a lo reportado en la bibliografía. Discutir las diferencias
observadas en los carriles en base a las variaciones en las concentraciones cargadas
por carril. Compara lo pesos moleculares teóricos de las proteínas con respecto a los
calculados.

Práctica 3:
*Discute las variaciones que se siguen durante el procedimiento de obtención de
enzima dependiendo de la fuente biológica. Menciona cuales son los cuidados que
deben de tener con la enzima durante el desarrollo de la parte experimental.
*Identifica la concentración de enzima óptima. Discute si es la misma concentración
para las otras fuentes de enzima, y a qué podría deberse dichas variaciones.
*Identifica la temperatura óptima de la enzima. Compara tus resultados con lo
reportado en la bibliografía.
*Identifica el pH óptimo de la catalasa y compáralo con lo reportado en la bibliografía.
*Analiza y discute como se comporta la actividad enzimática en función de la
concentración de sustrato. Una vez realizado el modelo cinético de Michaelis-Menten,
indica si su enzima se adapta a este modelo, si alcanzó la saturación del sustrato, y
de lo contrario que propondrían para que esto fuera posible.
*A partir del modelo cinético de Lineweaver-Burk, analiza los parámetros cinéticos de
la enzima. Buscar algún reporte en donde se indiquen los parámetros cinéticos de tu
enzima en tu modelo, y compara los datos y las condiciones experimentales a las que
se llevó a cabo. Discute cuál es la enzima de todos los modelos evaluados que es más
afín por su sustrato.

Práctica 4:
*Discutir sobre la solubilidad de los CHOs en agua y alcohol, evidenciarlo en función
de la composición química de los CHOs.
*Identificar los carbohidratos reductores y los no reductores. Indicar que diferencia
estructural existe entre los CHOs reductores y los no reductores.
*Mencionar los métodos que se pueden utilizar para convertir un CHO no reductor en
reductor. Mencionar el método que se utiliza en el desarrollo de la actividad
experimental y discute cual es la importancia de utilizar bicarbonato de sodio.
Comparar los resultados con el control negativo.
*Identificar el tiempo en el que inicia la hidrólisis del almidón. Discutir si la hidrolisis es
parcial o total. Mencionar a que se debe el tiempo que toma en llevarse a cabo la
hidrólisis.

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*Analizar los Rf´s de los CHOs establecidos como estándares y compararlos con los
CHOs presentes en la muestra problema para lograr su identificación. Discutir
ampliamente los datos obtenidos para el refresco ligth.
*Analizar la curva de calibración de lactosa, el análisis de muestras y mencionar si
existe alguna diferencia en la concentración de la lactosa presente en las leches
comerciales en función de sus marcas.

Práctica 5:
*Indicar el mejor solvente para los lípidos.
*Analizar los valores de índice de ácidez obtenidos, compararlos con los teóricos e
indicar cuál es el aceite de mejor y de peor calidad.
*Mencionar cuales alimentos presentan colesterol, y en que fase lo identificaron:
metanólica o clorofórmica.
*Sugerir cuales fueron los lípidos recuperados del hígado y cerebro. Discutir cuales
son los tipos de lípidos que se detectan cuando se usa yodo o ninhidrina o resorcinol
al revelar.
*Sugerir cuales fueron los lípidos recuperandos en las fases met metanólica o
clorofórmica de los alimentos en donde se evaluó la presencia de colesterol. Comparar
las bandas con los lípidos recuperados a partir del hígado y cerebro.

Práctica 6;
*Mencionar la importancia de reactivar la cepa antes de llevar a cabo la purificación
del plásmido.
*Indicar que etapas involucra la purificación del plásmido, y los cuidados que deben de
tenerse en cada etapa.
*Analizar la concentración de las muestras y la pureza obtenida. Discutir a estas dos
características, que muestra es la mejor.
*Discutir si el tamaño del plásmido migrado corresponde al tamaño indicado en el
mapa, de lo contrario menciona a que se debe que hayan más bandas en el carril de
la migración. Da una explicación breve, del reactivo que utilizaron para revelar las
bandas de ADN y como se lleva la interacción entre reactivo:ADN.

Práctica 7:
*Especificar que sucede cuando el organismo es sometido a altas concentraciones de
álcali. Comparar los valores de pH cuando el individuo está en reposo o cuando fue
sometido a ejercicio intenso.
*Menciona el comportamiento normal de un cultivo y comparar con el que tiene el KCN,
justificar a que se debe la diferencia de crecimiento observado.

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*Menciona el comportamiento del pH en un cultivo de levaduras control, compararlo

con el experimento que tiene 2,4-dinitrofenol y azida de sodio. Indicar si alguno de
estos compuestos se comporta como inhibidor o desacoplante. Indicar que proteína
de la cadena de transporte de electrones se ve afectada por la presencia de estos
compuestos.

HIGIENE Y SEGURIDAD
REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO

Artículo 1. Los laboratorios de docencia de la Facultad deben contar con la

infraestructura en equipo y materiales adecuados para el desempeño correcto de los
cursos ofrecidos.
Artículo 2. Es responsabilidad de la Facultad buscar el mantenimiento y actualización
del equipamiento.
Artículo 3. Es responsabilidad de los técnicos académicos y profesores del curos
reportar tanto a la dirección como al jefe de departamento correspondiente, cualquier
necesidad parar lograr el buen funcionamiento de los laboratorios de docencia, así
como planificar el suministro del material y consumibles requerido para los cursos
correspondientes.
Artículo 4. En caso de daño accidental del equipo o material de laboratorio por parte
de un estudiante el costo será cubierto de la siguiente manera:
I. El material que se rompa o deteriore estando en poder los estudiantes, deberá
ser repuesto por otro de las mismas características a más tardar al final del
semestre escolar; de lo contrario el estudiante no tendrá derecho a la
evaluación final del curso.
II. En caso de daño o ruptura de equipo de laboratorio cuyo valor sobrepase los $
300.00, la comisión de seguridad determinara, de acuerdo a las condiciones
del accidente, la proporción en que el estudiante será responsable de la
reposición del mismo.
III. En cualquiera de los casos indicados en los puntos 1 y 2, los técnicos de
laboratorio devolverán al estudiante su credencial y vale de préstamo y este
será sustituido con un vale de adeudo de material o equipo, según sea el caso,
el cual deberá firmar el estudiante.
IV. En caso de daño intencional, mal uso o vandalismo, el estudiante deberá cubrir
la totalidad del costo de reposición.
V. Los laboratorios de docencia podrán ser utilizados por los estudiantes,
catedráticos e investigadores de acuerdo a los lineamientos establecidos en el
reglamento de uso interno de laboratorios de docencia, siempre y cuando no
existan restricciones de seguridad marcadas por el reglamento de seguridad
vigente. 8
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RECOMENDACIONES ANTES DE TRABAJAR CON SUSTANCIAS QUÍMICAS

Los siguientes consejos le ayudarán a hacer su trabajo más fácil:

1. Asegúrese que al momento de iniciar su ingreso al laboratorio cuente con los
accesorios de seguridad que se muestran en la tabla 1.
2. Planee su trabajo antes de comenzar su procedimiento de laboratorio. Asegúrese
de saber qué hacer, si usted u otro compañero de laboratorio tiene un accidente.
3. Mantenga su lugar de trabajo libre de obstáculos.
4. Mantenga limpio y seco su equipo, colóquelo en un lugar firme y lejos de la orilla de
la mesa de laboratorio. Ponga atención a la proximidad de las botellas de reactivos a
mecheros, a sus compañeros y a sus equipos.
5. Excepto por la tubería de vidrio, agitadores de vidrio y cristalería graduada, use sólo
cristalería de borosilicatos (por ejemplo, Pyrex). Examine su cristalería detalladamente,
pata ver defectos como fracturas o agrietamientos. La cristalería dañada puede ser
reparada o descartada en un basurero designado y rotulado para cristalería quebrada.
6. Cualquier otro equipo también debe estar libre de defectos, como quebraduras,
agrietamientos, rajaduras y otros defectos obvios. Consulte a su profesor o al técnico
del laboratorio si tiene dudas. Si la duda persiste consulte el manual del equipo.
7. Una charola bajo el frasco de reacción puede actuar como un contenedor secundario
para confinar líquidos derramados en el caso de ruptura de alguna cristalería.
8. Use un escudo de protección (Solicítelo con el Técnico del laboratorio). Cuando
trabaje con mezclas reactivas. Coloque el escudo de protección en una posición
conveniente para protegerse usted y a otros compañeros. Además use lentes de
seguridad cuando use el escudo de protección.
9. Cuando trabaje con líquidos o vapores inflamables: No tenga mecheros u otra fuente
de ignición en las cercanías a menos que el instructor dé la orden. Use los extractores
para minimizar el escape del material al ambiente.
10. Si está utilizando mantas de calentamiento, no empiece con el trabajo de
laboratorio hasta que sepa las temperaturas de auto ignición de las sustancias
químicas que utilizará y que pueda asegurarse que todas las superficies expuestas
están a una temperatura menor a la de autoignición. Asegúrese de que los controles
de temperatura y los motores de los agitadores o calentadores no hagan chispa.
11. Cuando trabaje con sustancias inflamables en el laboratorio, use sólo equipo que
no produzca chispas.

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Tabla 1. Accesorios de seguridad necesarios para poder trabajar en el laboratorio.

Descripción Accesorio

El uso de una bata de laboratorio es

obligatoria ya que es necesaria para prevenir
contaminaciones y para protegerlo de:
salpicaduras, quemaduras, contacto con
sustancias químicas, etc.
Bata blanca

El uso de prendas cerradas es obligatorio, no

se permite el uso de short, faldas, etc..

Pantalón de mezclilla

El zapato cerrado es obligatorio. No será

permitido el calzado abierto o parcialmente
abierto como son: las sandalias, “crocs”, etc..

Zapato cerrado o bota

Los guantes son accesorios útiles en la

manipulación y en la limpieza por derrame de
alguna sustancia.

Guantes de nitrilo

Los lentes de seguridad son necesarios para

la protección de los ojos ante sucesos
inesperados como explosiones, salpicaduras,
etc..

Lentes de seguridad

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La franela es requerida para la limpieza de su

mesa de trabajo y es el primer accesorio
usado ante derrames pequeños.

Franela o paño de
algodón

El jabón como un recurso necesario para la

higiene personal y muy útil para lavar
pequeñas salpicaduras de alguna sustancia
química.

Jabón neutro y
detergente líquido

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PRÁCTICA NO. 1
DISEÑO Y EVALUACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

OBJETIVOS:
Preparar soluciones amortiguadoras, haciendo uso de la ecuación de Henderson-
Hasselbach, evaluar el pH experimental, compararlo con el teórico y determinar su
capacidad de amortiguamiento durante su enfrentamiento con un ácido y una base fuerte.

INTRODUCCIÓN:
Un sistema regulador, tampón o solución amortiguadora, es una disolución cuyo
objetivo es mantener constante el pH o dentro de límites definidos. Recordando que el
pH, es la forma en la que se designa la concentración de H + en cualquier solución
acuosa entre 0.1 M de H+ y 0.1 M de OH- (Nelson, et al., 2006). El pH se puede calcular
a partir de la siguiente ecuación matemática:
𝑙𝑜𝑔 1
𝑝𝐻 = = −log [𝐻+]
[𝐻+]
Donde:
p, es el logaritmo negativo de.
[H+], concentración de protones.

Una solución amortiguadora está constituida por dos componentes, uno que sea capaz
de neutralizar ácidos, y otro que sea capaz de neutralizar bases (Atkins, 2006). Las
soluciones reguladoras comunes están constituidas por un ácido débil y su base
conjugada, o por una base débil y su ácido conjugado. Por lo tanto, el pH de una
solución de este tipo estará determinado por las concentraciones relativas de los
ácidos y las bases que la constituyen (Voet et all., 2007). Las concentraciones del
ácido y la base conjugada para la preparación de una solución tampón se puede
obtener haciendo uso de la ecuación de Henderson-Hasselbach:

[𝐴𝑐 −]
𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + log
[𝐴𝑐𝐻]

𝑝𝑘𝑎 = − log 𝐾𝑎

Dónde:
pKa= Constante de disociación del ácido
[Ac-]= Concentración molar de la base conjugada
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[AcH]= Concentración molar del ácido

De esta manera, la razón [base conjugada]/[ácido] se mantiene aproximadamente

constante y se produce un cambio mínimo en el pH (Voet et all., 2007). Las soluciones
amortiguadoras se pueden clasificar:
I. Escala de pH en: ácidos, neutros y básicos;
II. Composición: sistema ácido-sal (constituido por un ácido débil y una sal débil),
sistema base-sal (constituido por una base débil y una sal de la base) o por un sistema
salino (constituido por una sal monosustituída-sal disustituída ó sal disustituída-sal
trisustituída);
III. Anfolitos, generalmente son sustancias orgánicas que tienen en la misma molécula
un grupo funcional donador de protones y el aceptor de éstos (Alfaro y Guzmán, 2007).
En bioquímica, los amortiguadores más importantes son el amortiguador fosfatos y el
bicarbonato, debido a que participan activamente en los sistemas biológicos. Por
ejemplo, el amortiguador fosfatos, actúa en el citoplasma celular en un rango de pH de
6.9-7.4. El amortiguador carbonatos, mantiene el pH del plasma sanguíneo a 7.4; en
personas que tienen enfermedades graves y llevan a cabo la sobreproducción de
ácidos metabólicos de manera incontrolada, la sangre puede alcanzar un pH igual o
menor a 6.8 causando lesiones celulares irreparables o muerte celular (Nelson, et all.,
2006)

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 14

DIAGRAMA DE FLUJO:
Actividad 1. Preparación de soluciones con potencial uso amortiguador.

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 15

Actividad 2. Evaluación de la capacidad de amortiguamiento de las soluciones.

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 16

Actividad 3. Comportamiento ácido base de Glicina

Fecha: _________________ Hora de inicio:________ Hora de término:_______

Conocimientos:____ 45% Habilidades:_____25 % Aptitudes y valores :______30 %

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 17

PROCEDIMIENTO:

Actividad 1. Preparación de soluciones con potencial uso amortiguador.

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS

4 Vasos de precipitado de 100 mL Fosfato de sodio monobásico(s)
(NaH2PO4)
2 Vasos de precipitado de 250 mL Fosfato de sodio dibásico(s)
(Na2HPO4)
3 Matraz volumétrico de 100 mL Tris(s)
2 Pipetas de 1, 5 y 10 mL HCl(s)
1 Probeta 10 y 100 mL Acetato de sodio trihidratado(s)
1 Balanza analítica Ácido acético(s)
1 Potenciómetro Fosfato de potasio
dihidrogenado(s)
1 Parrilla de agitación Bicarbonato de sodio(s)
1 Agitador magnético Carbonato de sodio(s)
Agua destilada
Solución estándar pH 4
Solución estándar pH 7
Solución estándar pH 10

NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.

NOTA2: Los alumnos debes traer papel secante siempre que se requiera el uso de potenciómetro.

a) Calibración del potenciómetro:

1. Presionar el botón ON/OFF para encender el potenciómetro.
2. Presionar el botón MODE/ENT, las veces que sean necesarias hasta seleccionar el
modo pH, se calibrará primero a pH 7.
3. Destapar el sensor con mucho cuidado, enjuagar con agua destilada y absorber el
exceso de agua con papel absorbente. Sumergir el sensor en el amortiguador de pH
7, y presiona la tecla ▲cal. La pantalla mostrará un valor que oscilará alrededor del
valor del pH del amortiguador utilizado. Permitir que la pantalla muestre un valor
estable y presionar la tecla MODE/ENT, para ajustar la calibración. No sacar el sensor
de la solución amortiguadora hasta que los ajuste a pH 7.
4. Enjuagar el sensor y secar muy bien con papel absorbente. Introducir el sensor en
el amortiguador pH 4. Permitir que la pantalla muestre un valor estable y presionar la
tecla MODE/ENT, para ajustar la calibración. No sacar el sensor de la solución
amortiguadora hasta que los ajuste a pH 4.

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 18

5. Repetir el paso 5, para calibrar el sensor con la solución amortiguadora 10. El sensor
está listo para usarse
6. Enjuagar y secar el sensor con agua destilada entre cada calibración y entre cada
cambio de muestra.
b) Preparación de soluciones:
Preparar 100 mL de las siguientes soluciones:

a) Solución de fosfatos
a1) Solución de fosfatos 0.1M. (NaH2PO4/ Na2HPO4, Ka= 6.2x10-8).
a2) Solución de fosfatos 0.01M. (NaH2PO4/ Na2HPO4, Ka= 6.2x10-8).

b) Solución Tris-HCl
b1) Solución Tris/HCl 0.1 M, pKa= 8.214
b2) Solución Tris/HCl 0.01 M, pKa= 8.214

1. Cada equipo debe preparar 100 mL de una de las soluciones listadas arriba, de
acuerdo con la asignación hecha por el profesor, mostrándole previamente los cálculos
correspondientes. En la bitácora se deben incluir los cálculos de cada una de las
soluciones indicadas.
2. Colocar en un matraz volumétrico de 100 mL, 50 mL de agua. Adicionar la masa del
ácido conjugado. En el caso del HCl, poner en hielo el matraz por 2 min antes de
verterlo. Homogeneizar poco a poco con movimientos circulares. En el mismo matraz,
colocar la masa de la base conjugada, homogeneizar hasta su solubilidad. Adicionar
agua destilada cuidadosamente hasta llevarlo al aforo.
3. Calcular el valor de pH que debe presentar dicha solución, haciendo uso de la
ecuación de Henderson-Hasselbach. Registrar los valores de pH en la tabla 2.
4. Medir el pH de las soluciones, y comparar el valor del pH obtenido con el calculado.
Registrar los valores de pH en la tabla 2.

c) Preparación de amortiguadores con ajuste de pH para la práctica de enzimas.

Amortiguador acetatos pH 4 (100 mL): Pesar 1.3607 g de acetato de sodio trihidratado.

Medir 0.5719 mL de ácido acético al 100% de pureza.

Amortiguador fosfatos pH 7 (100 mL): Pesar 0.07 g de fosfato de potasio dihidrogenado

(KH2 PO4) y 0.1 g de fosfato de sodio (Na2 HPO4).

Amortiguador carbonatos pH 10 (100 mL): Pesar 0.4038 g de Bicarbonato de sodio

(NaHCO3) y 0.4038 g de Carbonato de sodio (Na2CO3).
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 19

1. Pesar los componentes de cada amortiguador.

2. Colocar los reactivos en un vaso de precipitado con 80 mL de agua hasta solubilizar
a su totalidad.
3. Medir el pH y ajustar al pH correspondiente, si es necesario.
4. Colocar la solución en un matraz volumétrico de 100 mL. Enjuagar el vaso de
precipitado para recuperar toda la solución que haya quedado en él.
5. Colocar el agua de enjuague en el matraz volumétrico y aforar a 100 mL.
6. Transferir el amortiguador en un envase previamente lavado, secado y etiquetado.7.
Almacenar las soluciones a 4°C para ser usadas en la práctica de enzimas.

RESULTADOS:
1. Incluir los cálculos realizados para preparar cada una de las soluciones.

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 20

2. Calcular el valor del pH teórico de cada solución y compararlo con el pH

Experimental, indícalo en la tabla 2.

Tabla 2. Comparación del pH teórico y pH experimental.

Solución pH pH
teórico Experimental
Fosfato de sodio monobásico /
Fosfato de sodio dibásico 0.1 M
Fosfato de sodio monobásico /
Fosfato de sodio dibásico 0.01 M
Tris/HCl 0.1 M
Tris/HCl 0.01 M

CUESTIONARIO:
1. ¿Qué significa una diferencia entre el pH teórico y el pH experimental?
20
 21

2. ¿Qué propondrías si el valor del pH teórico y experimental es mayor o 0.5 unidades

de pH?

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

Actividad 2. Evaluación de la capacidad de amortiguamiento de las soluciones.

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS

2 Pipetas Pasteur con bulbo 25 mL HCl 0.1 N
Potenciómetro 25 mL NaOH 0.1M
Parrilla de agitación Soluciones fosfatos preparadas en la
actividad 1
1 vaso de precipitado de 250 mL Soluciones Tris-HCl preparadas en la
actividad 1
1 piceta Solución estándar pH 4
2 vasos de precipitado de 100 Solución estándar pH 7
mL

Solución estándar pH 10

NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.

NOTA2: Los alumnos debes traer papel secante siempre que se requiera el uso de potenciómetro.

En esta actividad, evaluaras la capacidad de amortiguamiento de las soluciones

preparadas en la actividad anterior:

1. Dividir las soluciones preparadas en la actividad 1 (a y b), en dos partes: colocando

50 mL en dos vasos de precipitados de 100 mL, perfectamente etiquetados: Nombre
de la solución y concentración.
2. Evaluando la capacidad de amortiguamiento en zona básica: Trabajar con una
solución a la vez de la siguiente manera: Adicionar 5 gotas de la solución NaOH 0.1M,
homogenizar y medir el pH con el potenciómetro. Registrar el valor del pH de la
solución en la tabla 3. Repetir el procedimiento del punto 2, hasta que el volumen de
NaOH 0.1 N sume 60 gotas.
3. Evaluando la capacidad de amortiguamiento en zona ácida: Trabajar con una
solución a la vez de la siguiente manera: Adicionar 5 gotas de la solución HCl 0.1M,

21
 22

homogenizar y medir el pH con el potenciómetro. Registrar el valor del pH de la

solución en la tabla 3. Repetir el procedimiento del punto 2, hasta que el volumen de
HCl 0.1 N sume 60 gotas.
4. Realiza el mismo procedimiento, ahora con agua como control negativo.

RESULTADOS:

a) Anota el cambio de pH que experimenta cada una de las soluciones, tal como
lo indica la tabla 3.

Tabla 3. Comportamiento del pH durante la adición de un ácido o una base.

Solución Adición pH, después de la adición
# gotas
0 5 10 20 30 40 60 pH
Fosfato de sodio HCl 0.1N
monobásico/Fosfato de
sodio dibásico 0.1 M NaOH 0.1
N
Fosfato de sodio HCl 0.1N
monobásico/Fosfato de
sodio dibásico 0.01 M NaOH 0.1N

Tris/HCl 0.1 M HCl 0.1N

NaOH 0.1N

Tris/HCl 0.01 M HCl 0.1N

NaOH 0.1N

Agua HCl 0.1N

NaOH 0.1N

pH= |pH final- pH inicial|

b) Realiza una gráfica en Excel donde se muestre el pH (eje y) vs el número de

gotas de ácido o base (eje x). En un gráfico ubica todas las soluciones en la
zona ácida y en otro gráfico, ubica todas las soluciones en la zona básica.
22
 23

CUESTIONARIO:
1. ¿Cómo se comporta el agua al someterse a diferentes volúmenes de HCl y NaOH?
2. ¿Cómo debe comportase una solución que es un buen amortiguador de pH?
3. ¿Qué sucede si adicionas 1 mL más de ácido o base a las soluciones que
identificaron con un comportamiento similar al de un amortiguador?

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

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 24

Actividad 3. Comportamiento ácido base de Glicina

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS
2 Vasos de precipitados de 100 mL Glicina 0.1N por equipo
100 mL
1 Pipetas de 10 mL 25 mL NaOH 0.1 N
1 Probeta de 50 mL 25 mL HCl 0.1 N
1 Agitador magnético Solución estándar pH 4
1 Bureta de 50 mL Solución estándar pH 7
1 Soporte universal Solución estándar pH 10
1 Pinzas para bureta
1 Potenciómetro
1 Parrilla de agitación
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.

1. En un vaso de precipitado de 100 mL, colocar 30 mL de Glicina 0.1N.

2. Introducir en la solución una barra magnética y colocar el vaso sobre la parrilla de
agitación.
3. Determinar el pH de la solución con el potenciómetro tal como lo indica en la figura
1

Figura 1. Montaje para evaluar los pkas de la Glicina.

4. Titular la solución añadiendo los volúmenes de HCl 0.1N que ha sido colocado
previamente en la bureta, tal como se indican en la tabla 4. Registre en la tabla 4, el
valor del pH de la solución de Glicina después de cada adición.
5. Colocar en otro vaso de precipitado de 100 mL, 30 mL de Glicina 0.1N.
6. Introducir en la solución una barra magnética y colocar el vaso sobre la parrilla de
agitación.
7. Determinar el pH de la solución con el potenciómetro, registrar el valor en la tabla 4.
8. Titular la solución añadiendo los volúmenes de NaOH 0.1N que ha sido colocado
previamente en la bureta, tal como se indican en la tabla 5. Registre en la tabla 5, el
valor del pH de la solución de Glicina después de cada adición.
24
 25

RESULTADOS:
Tabla 4. Valores de pH de la solución de Glicina durante la adición de HCl.

HCl 0.1 N añadido HCl 0.1 N pH de la solución

(mL) acumulado (mL) de Glicina 0.1 N
0 0
0.5 0.5
0.5 1
1 2
2 4
2 6
2 8
2 10
2 12
2 14
2 16
2 18
2 20
2 22

Tabla 5. Valores de pH de la solución de Glicina durante la adición de NaOH.

NaOH 0.1 N NaOH 0.1 N pH de la solución

añadido (mL) acumulado (mL) de Glicina 0.1 N
0 0
0.5 0.5
0.5 1
1 2
2 4
2 6
2 8
2 10
2 12
2 14
2 16
2 18
2 20
2 22

25
 26

a) Elaborar la gráfica de pH (eje y) en función del volumen acumulado (eje x) de HCl y

NaOH.
b) En la curva de tiltulación, calcular los pKas de los grupos amino y carboxilo.
c) Comparar los pKa obtenidos en la curva, con los valores teóricos para Glicina y
calcular el punto isoeléctrico real y experimental.

CUESTIONARIO:
1. Busca la ecuación matemática para calcular los valores de pKas.
2. ¿A qué corresponden los valores de pKas de la glicina?

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

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 27

BIBLIOGRAFÍA
Atkins, P. (2006) Principios de la química: los caminos del descubrimiento en 11.
Equilibrio acuoso: 11.1 Acción de la solución amortiguadora, (3ª Ed., pag. 409), Médica
panamericana, Buenos Aires.
Nelson, D., Cox, M. M. y Lehninger, A. L. (2006) La escala de pH representa la
concentración de H+ y OH+ en 6.1 Ionización del agua, ácidos débiles y bases débiles
en Principios de Bioquímica. (4ª Ed., pp. 22) Omega.
Voet, D., Voet, J., Pratt, C. (2007) Fundamentos de Bioquímica: la vida a nivel
molecular en Capítulo 2: El agua: Química ácido-base. (2ª Ed., pag 33-36) Médica
panamericana, Buenos Aires.
Alfaro, F., Guzmán, J. (2007). Diseño de una guía práctica para la preparación,
conservación y correcto uso de las soluciones amortiguadoras (Tesis de Licenciatura
en Química y Farmacia). Universidad del Salvador Facultad de Química y Farmacia,
San Salvador, El Salvador.
Nelson, D., Cox, M. M. y Lehninger, A. L. (2006) 2.3 Tamponamiento contra cambios
de pH en los sistemas biológicos en Principios de Bioquímica. (4ª Ed., pp. 65-69)
Omega.
Cano, H., Méndez, S., y Cruz, J. (s.f.) Práctica 2 Determinación experimental del pH y
soluciones amortiguadoras y Práctica 3 Soluciones amortiguadoras II del Manual
prácticas de laboratorio de Bioquímica de la Escuela de Química de la Facultad de
Ciencias de la Universidad Industrial de Santander. (Código: MFOQ-BQ.01; Versión:
00; pp. 13-25)

Barboza-Corona, J. E., Ortiz, G., Salcedo-Hernández, R. (s.f.) Práctica 2:

Determinación del pH y preparación de soluciones en Manual de prácticas de
Bioquímica de la División Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato Campus
Irapuato-Salamanca (pp. 6-9)

27
28

28
 29

PRÁCTICA NO. 2
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS: Identificar mediante pruebas cualitativas la presencia de aminoácidos.

Aislar proteínas de interés biológico e identificarlas mediante pruebas cualitativas.
Observar el fenómeno de la desnaturalización en proteínas modelo. Identificar el punto
isoeléctrico de una proteína. Conocer y comparar dos métodos de cuantificación de
proteínas: Biuret y Bradford. Comprender el principio de la cromatografía y
electroforesis de proteínas.

INTRODUCCIÓN:
Una proteína es un polímero de aminoácidos, en el que cada aminoácido se encuentra
unido entre sí por un enlace peptídico. Existen 20 aminoácidos que forman parte de la
proteínas y son conocidos como -aminoácidos. Se conocen así, por que los cuatros
grupos que se encuentran unidos al carbono anomérico son diferentes, con la
excepción de la glicina: un grupo carboxilo, un grupo amino, un átomo de hidrógeno y
el grupo R (Nelson et al., 2006). El grupo R varia para cada uno de los aminoácidos,
esta variabilidad le confiere a cada uno de los aminoácidos características especiales
como polaridad o la capacidad de interaccionar con el agua a un pH neutro. Como se
mencionó anteriormente, las proteínas están constituidas por aminoácidos unidos por
un enlace peptídico. Un enlace peptídico se forma como resultado de la interacción
entre el grupo amino de un aminoácido y el grupo hidroxilo del otro aminoácido (que
constituyo el grupo carboxilo), liberando agua como producto de la deshidratación tal
como se muestra en la figura 2 (Nelson et al., 2006). Es importante mencionar que
cuando se sintetiza un péptido o una proteína, los aminoácidos se añaden al extremo
carboxilo terminal y siempre el grupo amino libre del primer aminoácido se conoce
como amino terminal (Figura 2; Nelson et al., 2006).

Figura 2. Formación del enlace peptídico.

29
 30

Un polipéptido está constituido por 10 a 100 aminoácidos, y un polipéptido es

considerado una proteína cuando ésta contiene más de 100 aminoácidos (Nelson et
al., 2006). Las proteínas son biomoléculas que conservan una estructura bien definida
y organizada, dada por la naturaleza de los aminoácidos que la constituyen. Existen
cuatro tipos de estructuras: en la primaria, se especifica el orden que tienen los
aminoácidos que la constituyen; en la secundaria, la naturaleza de los aminoácidos da
lugar a patrones estructurales repetitivos (-hélice, hoja  plegada); la terciaria,
describe el plegamiento tridimensional de la proteína y finalmente la cuaternaria, se
observa la incorporación de dos o más subunidades que muestran una proteína con
actividad (Nelson et al., 2006).
Las proteínas así como los aminoácidos, pueden ser identificados mediante muchas
reacciones químicas, así como el uso de varias técnicas implementadas en el área de
bioquímica. A continuación se describirán algunas de las pruebas y técnicas utilizadas
para el análisis de estas biomoléculas.
La identificación de aminoácidos se puede llevar a cabo por reacciones cualitativas
sencillas como pueden ser:

Prueba de ninhidrina: La ninhidrina por su poder oxidante, desamina y descarboxila

a los grupos amino y carboxilo presentes en el carbono anomérico de los aminoácidos,
siempre y cuando no se encuentren comprometidos con el enlace peptídico. La
reacción puede ser descrita brevemente: se elimina hidrógeno que al combinarse con
el oxígeno de la ninhidrina se produce agua. El aminoácido se convierte en iminoácido,
el cual es hidrolizado para dar lugar a un cetoácido y amoniaco. El amoniaco reacciona
con la ninhidrina residual y la ninhidrina reducida, formando un compuesto de color
violeta (dicetohidrindilidenodiceto-hidrindamina), tal como se muestra en la figura 3.
(MacFaddin, J., 2003; Garrido et al., 2006)

Figura 3. Reacción entre un aminoácido y ninhidrina.

Prueba de biuret. Es una prueba general para polipéptidos y proteínas ya que sirve
para reconocer los enlaces peptídicos. El reactivo de Biuret contiene sulfato cúprico
30
 31

en una solución de hidróxido de sodio que le da un carácter alcalino. Cuando este

reactivo se pone en contacto con los péptidos o las proteínas se forma un complejo de
coordinación entre los iones Cu++ y los pares electrónicos libre del nitrógeno que forma
el enlace peptídico. El complejo resultante es de color violeta a púrpura, color que varía
dependiendo de la concentración de la proteína. Este reactivo es utilizado como
método de cuantificación para proteínas que se encuentran en un rango de 1-20
mg/mL, y el complejo es detectado a una longitud de onda de 545 nm (figura 4; Doria
et al., 2009; Guarnizo y Martínez, 2013).

Figura 4. Reacción entre un aminoácido y el Reactivo de Biuret.

Las proteínas en su ambiente nativo tienen un plegamiento dado por la interacción de

los aminoácidos que las constituyen, sin embargo este ambiente está expuesto a
cambios dependientes del ambiente celular o a tratamientos químicos que logran
alterar la estructura nativa de la proteína o la pérdida de su actividad, fenómeno
conocido como desnaturalización (Melo y Cuamatzi, 2007; Nelson, et al., 2006).
En algunos casos, el proceso de desnaturalización es reversible. La desnaturalización
de proteínas ocurre cuando se exponen al calor, cambio del pH, sustancias químicas.
Las proteínas mantienen su estabilidad estructural, a una temperatura de 37°C,
cuando la temperatura aumenta por arriba de ésta, aumenta la energía de las
moléculas que la constituyen rompiendo las interaccciones débiles que existen entre
ellas, promoviendo la desnaturalización (Nelson, et al., 2006; Melo y Cuamatzi, 2007).
31
 32

Otra forma por la que una proteína puede perder su conformación nativa es por
cambios bruscos del pH del ambiente (la adición de un ácido o un álcali); provoca la
ionización de grupos aminos o carboxilos. Esto contribuye a una inestabilidad de
cargas y pérdida de puentes de hidrógeno existentes entre la proteína y el medio
acuoso en el que se encuentra soluble, llevándola a la precipitación. Este tipo de
desnaturalización puede ser reversible (Nelson, et al., 2006; Melo y Cuamatzi, 2007).
Las proteínas en soluciones acuosas pueden ser desnaturalizadas por la adiciones de
sustancias químicas como agentes caotrópicos, solventes polares o apolares o
detergentes. Estas sustancias no rompen los enlaces covanlentes de las proteínas,
pero al solubilizarse con el agua, rompen interacciones hidrofóbicas que promueven la
desestabilización de la estructura de la proteína (Melo y Cuamatzi, 2007; Nelson, et
al., 2006). La desnaturalización completa se lleva cuando algunos de estos
compuestos el 2-mercaptoetanol o el ditiotreitol (DTT), actúan rompiendo puentes
disulfuro (Melo ;y Cuamatzi, 2007).
Una de las determinaciones más usadas en el área de bioquímica es lograr conocer la
concentración de proteínas en una muestra biológica. Existen diferentes métodos para
la cuantificación de proteínas, tal como se observa en la tabla 6 (García, H., y Vázquez,
R., 1998)

Tabla 6 Comparación de métodos de cuantificación de proteínas.

Ensayo Longitud de onda Sensibilidad y Mecanismo de Nota

de detección rango efectivo de acción
(nm) aplicación
Absorción de UV 205 10-50 g/mL Absorción del La sensibilidad
280 50 g/mL a 2 enlace peptídico. depende del
mg/mL Absorción de número de
tirosinas y aminoácidos
triptófano presentes. Su
costo es bajo.
Ensayo de Biuret 540 1 g/mL a 1.5 El Cu+2 es Procedimiento
mg/mL reducido a Cu+ en lento. No
presencia de compatible con
proteínas a un pH detergentes o
básico, los iones agentes
Cu+ son quelados reductores.
potenciando el
color azul.
Ensayo de 595 1 g/mL a 10 g Reacciona con No compatible
Bradford /mL aminoácidos con detergentes.
específicos y Ensayo rápido.
estructuras Útil cuando la
terciarias de precisión no es
proteínas. El importante.
32
 33

colorante Azul
brillante de
coomasie G-250
cambia de color
café a azul
Método BCA 562 0.5 g/mL a 1.2 El Cu+2 es
(Ácido mg /mL reducido a Cu+ en
bicinconínico) presencia de
proteínas a un pH
alto; el ácido
bicinconínico
quela los iones
Cu+ formando
complejos color
púrpura.

En bioquímica también se han desarrollado técnicas para separar o visualizar

proteínas. Estas técnicas se conocen como cromatografía o electroforesis.
El método de separación por cromatografía consiste en separar o fraccionar una
muestra de proteínas solubles en solución utilizando una fase móvil, al ser aplicada
sobre una matriz absorbente (fase estacionaria). La fase móvil está constituida por una
mezcla de compuestos químicos que modifican la polaridad de la fase (agua, ácido
acético, alcoholes, entre otros). La fase estacionaria puede ser sílica gel, alúmina,
resina de dextrano, etc., fijadas en vidrio o aluminio. Para la visualización de las
muestras generalmente se utiliza ninhidrina. La separación de la muestra con respecto
al punto de carga, se evalúa como migración relativa (Rf), en donde se evalúa el
recorrido relativo de cada muestra con respecto al recorrido realizado por la fase móvil
(Roca, et al., 2003; UNAM, 2005).
El método de separación de electroforesis también es utilizado con frecuencia para
determinar el peso molecular de la proteína. Este tipo de electroforesis es vertical, y
utiliza una red inerte constituida por acrilamida y N, N´metilen-bis-acrilamida. El
porcentaje de la cantidad de acrilamida en el gel, determina el tamaño de poro y el
tamaño de la proteína a separar (Segal y Ortega, 2005; Voet et al., 2009; García,
2000). La electroforesis se puede llevar en condiciones nativas o en condiciones
desnaturalizantes. En condiciones nativas, las proteínas conservan su plegamiento;
mientras que en las desnaturalizantes se utilizan detergentes y agentes reductores
para romper las estructuras conformacionales, garantizando que la migración de la
muestra a través de un campo eléctrico sea lineal (Segal y Ortega, 2005; Voet et al.,
2009; García, 2000). Las muestras pueden ser visualizadas al sumergir el gel en una
solución que contiene azul de coomasie (Voet et al., 2009)

33
 34

DIAGRAMA DE FLUJO:

Actividad 1. Reacciones de identificación de aminoácidos y proteínas

Actividad 2. Cromatografía de capa fina

34
 35

Actividad 3. Agentes desnaturalizantes.

Actividad 4. Cuantificación de proteína total en suero humano mediante el

método de Biuret y Bradford.

35
 36

Actividad 5. Electroforesis en gel de proteínas

Fecha: _________________ Hora de inicio:________ Hora de término:_______

Conocimientos:____ 45 % Habilidades:_____ 25 % Aptitudes y valores :______30 %

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 37

PROCEDIMIENTO:

Actividad 1. Reacciones de identificación de aminoácidos y proteínas

MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

20 Tubos de ensaye de 16 x150 mm * 2 mL Albúmina 1 % * 1 Huevo
2 Gradillas * 2 mL Peptona 1 % * 10 mL Leche
2 Agitadores magnéticos * 2 mL Triptófano 1 %
1 Matraz Erlenmeyer *2mL Ac. Aspártico 1 %
3 Pipetas Pasteur con bulbo 5 mL de Ninhidrina 1 %
1 Parrilla de calentamiento 5 mL Reactivo de Biuret
1 Baño maría o 1 vaso de precipitado de
250 mL
1 Pinzas para tubos de ensaye
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2:*Preparar en agua destilada.
NOTA3: El material biológico debe ser proporcionado por los estudiantes.

REACTIVOS PARA IDENTIFICAR AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de tartrato de sodio y

potasio en 500 mL de agua en un matraz volumétrico de 1 L. Adicionar 300 mL de
hidróxido de sodio al 10% y aforar a 1 L con agua destilada.

Ninhidrina 1%: Disolver 0.1 g de ninhidrina en 100 mL de n-butanol.

Reacción de la Ninhidrina:
[Link] 0.5 mL de la solución de aminoácidos o proteínas al 1% en un tubo de
ensayo.
2. Agregar a cada tubo, 3 gotas de la solución de ninhidrina 1%.
3. Calentar en baño de maría en ebullición por 2 minutos.
4. Registrar los resultados en la tabla 7.

Reacción de Biuret:
1 .Colocar 0.5 mL de la solución de aminoácidos o proteínas al 1% en un tubo de
ensayo.
2. Agregar a cada tubo 0.25 mL del reactivo de Biuret, mezcla bien.
3. Registrar los resultados en la tabla 7.

37
 38

RESULTADOS
Marca sobre la tabla las reacciones positivas (+) que resultan durante la identificación
los aminoácidos utilizados.

Tabla 7. Pruebas cualitativas para la identificación de aminoácidos.

Muestra Biuret Ninhidrina

Albúmina

Ovoalbúmina

Ácido aspártico

Triptofano

Caseína

Problema

Agua

CUESTIONARIO
1.-Reproduce la estructura de los aminoácidos tirosina, fenilalanina, y de los
aminoácidos ensayados.
2.-Explica por qué las proteínas pueden ser positivas con el reactivo ninhidrina.

CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

38
 39

Actividad 2. Cromatografía de capa fina.

MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO
0.01 g Alanina Coca cola normal (alumnos)
1 Regla 0.01 g Fenilalanina Coca cola ligth (alumnos)
Cromatofolios de sílica gel 0.01 g Valina Pepsi cola normal (alumnos)
1 Secadora 10 mL n-propanol Pepsi cola ligth (alumnos)
1 Pipeta automática de 0.5-10 uL 10 mL n-Butanol
Puntas de 0.5-10 uL o capilares 100 mL Ácido acético
Horno de secado Agua destilada
2 Vaso de precipitado de 100 mL 3 mL de HCl 0.5 M en etanol.
1 Vaso de precipitado de 250 mL
Papel aluminio
Guantes
1 Caja de Petri de vidrio o cristalizador
Encendedor (alumnos)
Un cromatofolio de silica gel de 4 x 5
cm
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2:*El material biológico debe ser proporcionado por los estudiantes y algunos materiales.

Estándares de aminoácidos: Preparar una solución de los aminoácidos Ala, Phe y

Val: Pesar 0.01 g del aminoácido y disolver en 1 mL de 0.5 M de HCl en etanol.

Muestra o problema: Pipetear 1 mL de refresco y disolver con 1 mL de HCl 0.5 M en

etanol.

1. Sobre un cromatofolio de silica gel de 4 x 5 cm, señalar una línea recta de referencia
a menos de 1.0 cm del extremo inferior de la placa, sobre la cual se aplicarán 2-4 veces
por cada disolución de aminoácido y 8-10 veces de la disolución problema. Las
muestras tienen que estar separadas entre sí 1 cm, aproximadamente.
2. Preparar las siguientes fases móviles por mesa de trabajo:

Disolvente A: n-butanol/ácido acético/agua en proporción [Link] (v/v)

Disolvente B: n-propanol/agua en proporción 7:3 (v/v)
Disolvente C: n-butanol/ácido acético/agua en proporción [Link] (v/v)

3. Colocar las placas en un vaso de precipitado con cada una de las fases móviles, del
que se añade volumen suficiente para que cubra aproximadamente 1 cm de la placa.

39
 40

4. Dejar ascender el disolvente hasta que llegue a 1 cm aproximadamente del extremo

superior de la placa. Sacar la placa y marcar con un lápiz la línea final hasta la que ha
llegado el disolvente.
5. Dejar secar a temperatura ambiente y nebulizar con la solución de ninhidrina 1%.
6. Colocar la placa en la parrilla de calentamiento hasta que se observe la aparición
de bandas coloreadas, lo que debe tardar de 3 a 5 minutos.
7. Calcula los Rf de los aminoácidos e identifica los aminoácidos presentes en la
muestra problema. Registre los resultados en la tabla 8.

RESULTADOS
1. Incluye las fotos de los cromatofolios. Calcula los Rf´s de los aminoácidos.

Tabla 8. Valores de RF´s calculados a las diferentes fases móviles utilizadas.

Distancia
Distancia
recorrida
Fase de la recorrida
Nombre de la de la Color de
cromatografía Número de la Rf’s
Muestra fase la mancha
de afinidad muestra
móvil
(cm)
(cm)

1 Alanina

Fase A 2 Fenilalanina

3 Valina

4 Problema

1 Alanina

Fase B 2 Fenilalanina

3 Valina

4 Problema

1 Alanina

Fase C 2 Fenilalanina

3 Valina

40
 41

4 Problema

CUESTIONARIO

1. En una mezcla de ácido acético: butanol: agua (4: 50: 3) en una mezcla de serina,
ácido aspártico, triptófano y leucina. En qué fase correrá el ácido aspártico. a) Agua b)
Butanol c) Ácido acético.
2. En las mismas condiciones anteriores en qué fase correrá el triptófano. a) Agua b)
Butanol c) Ácido acético.
3. Explicar el significado anfotérico de los aminoácidos, y menciona que aminoácidos
son polares y no polares.

CONCLUSIONES

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Actividad 3. Agentes desnaturalizantes.

MATERIALES Y REACTIVOS MATERIAL

EQUIPO BIOLÓGICO

5 Tubos de ensayo 16 x 150 15 mL de Peptona 1% Huevo (alumnos)

mm

1 Parrilla de calentamiento *15 mL de Caseína 0.5 %. Debe 15 mL de Clara de huevo al

con agitación ser preparada por los técnicos. 1% en NaCl al 0.9 % (preparada
Este volumen es por equipo. La por los alumnos)
preparación se indica debajo de
esta tabla.

1 Vaso de precipitado de 50 3 mL Ácido clorhídrico

mL

1 Matraz volumétrico de 25 3 mL Etanol Absoluto

mL

41
 42

Papel filtro 3 mL NaOH 2M ó al 40%

Potenciómetro 3 mL Acetona

Pizeta 0.2 g Sulfato de amonio

1 Probeta 100 mL 1 g Caseína grado reactivo

1 Gradilla
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser proporcionado por los estudiantes.

Preparación de 25 mL de caseína 0.5 %. Colocar aproximadamente 125 mg de

caseína en un vaso de precipitado de 50 mL (NOTA: Agregar 10 mL de agua destilada
y 2.5 mL de NaOH 1N; agitar hasta lograr una solución total de la caseína. Una vez
disuelta la caseína, vertir en un matraz aforado de 25 mL aforar con agua destilada
hasta 25 mL. Mezclar bien. La solución debe ser clara y limpia si no es así, filtrar con
papel.

1. Colocar cuatro series de tubos de ensayo, cada serie debe tener siete tubos de
ensayo.
2. Etiquetar una serie como agua y numerarlos del 1 al 7. Otra serie se llamará
peptona, otra caseína, otra ovoalbúmina y la última agua. Numerar igualmente cada
tubo del 1 al 7.
3. A cada tubo adicionar 2 mL de la solución correspondiente de acuerdo al nombre
asignado.
2. A los tubos 1 de cada serie, calentar a baño María.
3. A los tubo 2 de cada serie, adicionar 0.5 mL de HCl concentrado
4. A los tubos 3 de cada serie, adicionar 0.5 mL de etanol absoluto.
5. A los tubos 4 de cada serie, adicionar 0.5 mL de NaOH 2 M ó al 40%.
6. A los tubos 5 de cada serie, adicionar 0.5 mL de acetona.
7. A los tubos 6 de cada serie, adicionar cristales de sulfato de amonio hasta su
saturación.
8. El tubo número 7 de cada serie, funcionará como control negativo.
9. Mezclar por inversión cada tubo. Observar los resultados obtenidos y llevar a
cabo un registro en la tabla 9.

RESULTADOS
1. Presenta fotos de cada uno de los tubos de la actividad de desnaturalización de
proteínas e inclúyelas en la tabla 9. En la misma tabla, indica con una C (si se ven
42
 43

hebras en la solución, P (lechosa o turbia) y S (si la muestra es idéntica al tubo 7).

Discute ampliamente si los factores desnaturalizan de la misma manera a ambas
proteínas o a que se debe que la desnaturalización varíe entre una y otra.

Tabla 9. Identificación del grado de desnaturalización por el uso de agentes desnaturalizantes.

MUESTRA CALOR ACIDOS DISOLVENTES BASES SALES CONTROL

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

(Calentar) (0.5 mL (0.5 mL (0.5 mL (0.5 mL NaOH Sulfato de Control
HCl ) Etanol) Acetona) 40 %) amonio

Peptona

Caseína

Ovoalbúmin
a

Agua

C=completamente, P=parcialmente, S= sin ningún cambio, todo es comparado con

respecto al tubo 7 o control.

CUESTIONARIO
1. En la actividad de desnaturalización de proteína, ¿En qué tubos se lleva a cabo
la desnaturalización?
2. ¿Cuál es el fundamento teórico de la desnaturalización en cada caso?

CONCLUSIONES:

43
 44

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

Actividad 4. Cuantificación de proteína total en suero humano mediante el

método de Biuret y Bradford.

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS

20 Tubos de ensayo 15 mL Reactivo de Biuret

15 Microtubos de 1.5 mL 15 mL Reactivo de Bradford

1 Vaso de precipitados de 250 mL 1 g Albúmina bovina

Micropipetas de: Agua destilada

0.5-10 uL
20-100 uL
10-1000 Ul

Puntas de:
0.5-10 uL
20-100 uL
10-1000 uL

Pizeta

2 Celdas

1 Espectrofotómetro UV/VIS

1 jeringa de 3 o 5 mL o tubo vacutainer

sin EDTA (tapa roja)

Algodón o torundas

Alcohol

1 tubo falcon de 15 mL

REACTIVOS PARA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

44
 45

Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de tartrato de sodio y

potasio en 500 mL de agua en un matraz volumétrico de 1 L. Adicionar 300 mL de
hidróxido de sodio al 10% y aforar a 1L con agua destilada.

Reactivo de Bradford: Mezclar 100 mg de Coomassie Blue G-250 en 50 mL de

etanol al 95%. Adicionar a esta solución 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v).
Diluir la solución resultante a 1 L. Las concentraciones finales de los reactivos son:
Azul Coomassie G-250 0.01% (p/v), etanol 4.7% (p/v), ácido fosfórico 8.5% (p/v).

Muestra de suero humano. El profesor conseguirá una muestra de suero humano o

bien previo a la sesión práctica, obtener sangre humana (tubo con 3 mL de sangre por
equipo) con una jeringa de 3 mL. Colocar en un tubo falcón de 15 mL. Dejar reposar
20-40 min a temperatura ambiente y centrifugar a 1500 rpm durante 15 minutos.
Recuperar el suero en un microtubo de 1.5 mL, refrigerar o bien congelar a -20 ºC
hasta su uso.

a) Método de Biuret
1. Preparar 1 mL de una solución de Albúmina bovina a una concentración de 20
mg/mL.
2. Colocar en 5 tubos de ensayo los volúmenes de solución estándar y agua como se
indica en la tabla 10. Las muestras problema que se van a utilizar son diluciones de
suero humano previamente aislado. Utilizando microtubos de 1.5 mL, realizar
diluciones del suero humano como indica la tabla 10 o bien de acuerdo a las
instrucciones del profesor.
3. Considerar un volumen que permita analizar cada dilución de suero con el método
de Bradford y Biuret (2 mL). Registrar los volúmenes de suero y agua utilizados para
preparar cada dilución en la tabla 11.
4. Añadir 1 mL del reactivo de Biuret a los tubos estándar y muestras problema.
5. Incubar a temperatura ambiente por 10 min y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.
6. Registre los resultados en la tabla 13.

Tabla 10. Curva de estándar para el método de Biuret.

Tubo 20 mg/mL H2O Concentración

bovina de proteína*
(L)
(L) (mg/mL)

45
 46

Blanco 0 100
1 12.5 87.5
Curva de 2 25 75
calibración
3 50 50
4 75 25
5 100 0
Muestra
Muestras problema
(L)
Suero 100 0
humano 1: 5
Suero 100 0
humano 1:10
Suero 100 0
humano 1:20
Suero
humano 100 0
1:100
Suero
humano 100 0
1:500
Suero
humano 100 0
1:1000
Nota: La muestra de proteína debe ser diluida para que el valor de la DO no sea mayor a 1 y se
encuentre dentro de la curva estándar. De la dilución de suero (1:5 ó 1:10 ó 1:20) tomar 100 L para
cuantificar o bien solo preparar 100 L.
*Calcular la concentración de albúmina con la fórmula C 1V1=C2V2. Únicamente para la curva estándar,
para las muestras utilizar la ecuación obtenida de la regresión lineal de acuerdo con los resultados
obtenidos.

Tabla 11. Registro de volúmenes de muestra en la preparación de diluciones.

Volumen de suero Volumen de agua Volumen final*
Diluciones de suero
(L) destilada (L) (L)
46
 47

1:5
1:10
1:20
1:100
1:500
1:1000
*Considerar un volumen que permita analizar cada dilución de suero con el método de Bradford
y Biuret

b) Método de Bradford
1. Preparar 1 mL de una solución de Albúmina bovina a una concentración de 1 mg/mL.
2. Etiquetar 2 series de microtubos de 1.5 mL. La primera serie será de 7 tubos
(incluyendo el blanco), sólo la curva estándar. La otra serie será de 12 microtubos,
incluir la curva estándar y las diluciones de suero realizadas en la actividad anterior.
3. Colocar en la primera serie, los volúmenes de solución estándar y agua como se
indica en la tabla 12 y mezclar por pipeteo. Las muestras a cuantificar son las
diluciones de suero humano.

Tabla 12. Curva de estándar para el método de Bradford.

Tubo 1 mg/mL Albúmina H2O Concentración

bovina
(L) (mg/mL)
(L)
Blanco 0 100
1 10 90
2 20 80
Curva de 3 40 60
calibración
4 60 40
5 80 20
6 100 0
Muestras Muestra problema
(L)

47
 48

Suero humano
20 0
1: 5
Suero humano
20 0
1:10
Suero humano
20 0
1:20
Suero humano 20 0
1:100
Suero humano
20 0
1:500
Suero humano
20 0
1:1000

4. Colocar en la otra serie de tubos, 20 L de las soluciones correspondiente a la curva

estándar (las soluciones recién preparadas en la primera serie). Colocar también en
sus respectivos microtubos, 20 L de las diluciones de suero preparadas previamente
en la actividad de Biuret.
5. A cada microtubo, añadir 980 L del reactivo de Bradford.
6. Mezclar por inversión y leer absorbancia a 595 nm después de 2 minutos de agregar
el colorante y antes de 1 hora de iniciada la reacción.
7. El valor de la D.O. (densidad óptica) de las diluciones problema, no debe ser mayor
a 1 y debe encontrarse dentro de los valores de la D. O. de la curva estándar. Recordar
que este método es más sensible que el de Biuret.
8. Registrar los resultados en la tabla 13.
Nota: La muestra de suero debe ser diluida para que el valor de la DO no sea mayor
a 1 y caiga dentro de la curva estándar.

RESULTADOS
1. Llena la tabla 13 con los resultados obtenidos de cada método de cuantificación de
proteínas de suero humano. Genera una gráfica en Excel en donde se muestre la
concentración de proteína en el eje x (mg/mL) y la densidad óptica (D. O.). A partir de
esa gráfica obtén la ecuación de la recta así como la correlación obtenida a partir de
los datos de la curva de calibración. Presenta los cálculos realizados durante la
determinación.

48
 49

Tabla 13. Cuantificación de proteínas séricas con los métodos Biuret y Bradford.
Concentración Concentración de
D.O. D.O. de proteína proteína
Tubo
Biuret Bradford Biuret Bradford
(mg/mL) (mg/mL)
Blanco
1
2
3
4
5
6
Suero
humano
1: 5
Suero
humano 1:10
Suero
humano 1:20
Suero
humano 1:100
Suero
humano 1:500
Suero
humano
1:1000

Para la siguiente actividad considerar las concentraciones determinadas por Biuret

o Bradford de la muestra de suero, de acuerdo con los mejores resultados obtenidos
(R2 0.95, curva estándar de Biuret o Bradford). Realizar los cálculos para preparar
25, 50 y 100 g de proteína en aproximadamente 20 L. El volumen depende del
espesor del vidrio a utilizar.

49
 50

CÁLCULOS

CUESTIONARIO
1.- Discuta un método colorimétrico alternativo para la determinación de proteínas,
indicando en que se fundamenta.
2.- ¿Qué ventajas y desventajas presentan los métodos de cuantificación utilizados?
3.- Realiza una lista de las 10 proteínas más abundantes en suero humano.

CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

50
 51

Actividad 5. Electroforesis en gel de proteínas

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS

1 juego de Micropipetas Agua destilada

Puntas estériles para cada una de 5 mL Tris 2 M pH 8.8

las micropipeta

2 Tubos para centrífuga 5 mL Tris 2 M pH 6.8

20 Tubos eppendorf 10 mL Acrilamida 30%/bisacrilamida 0.8%

1 vaso de precipitado de 250 mL 1 mL SDS 10%

Parrilla de calentamiento 0.5 mL Persulfato de amonio 10%

Cámara de electroforesis para 0.5 mL TEMED

proteínas

Fuente de poder 120 mL solución de Coomassie:

Recipiente para desteñir 200 mL Solución desteñidora.

6 L Marcador de peso molecular para

proteínas Cat. 26619 ThermoFisher Scientific

2000 mL Buffer 1X SDS de corrida:

2 Vidrios para cámara de electroforesis de 1.5

mL

Un peine de 1.5 mL
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.

SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS

• Acrilamida al 30%/ bisacrilamida 0.8%: Mezcla 30 g de acrilamida y 0.8 g de
N,N′-metilenebisacrilamida con 100 mL de agua. Filtrar con membrana de 0.45
µm y almacena a 4°C en un recipiente cubierto de papel aluminio. No se use
después de 30 días ya que la acrilamida se hidroliza gradualmente a ácido
acrílico y amonio. PRECAUCIÓN: El monómero de acrilamida es neurotóxico.
Utiliza una mascarilla cuando trabajes con el polvo de acrilamida. Utiliza
guantes cuando se encuentre en forma de solución y además no puede ser
pipeteada con la boca.

51
 52

• Buffer 5X Laemly: 60 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-

mercaptoetanol, 0.01% Azul de bromofenol (4 mL de 1.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10
mL de glicerol, 5 mL de -mecaptoetanol, 2 g SDS, 1 mL de 1% Azul de
bromofenol)
• Buffer 5X SDS de corrida: 15.1 g de Tris base, 72 g de glicina, 5 g de SDS,
aforar a 1 L de agua destilada. Diluye 1:5 para utilizar el buffer de corrida y se
obtendrá un pH de 8.3. Almacenar a 4°C para usarse durante un mes.
• Solución de Coomassie: 200 mL de ácido acético, 1800 mL de agua destilada,
0.5 g de Azul de Coomassie G-250, mezclarlo por una hora y filtrarlo en papel
Whatman No. 1, Almacena a temperatura ambiente de manera indefinida.
• Solución desteñidora: 200 mL de metanol. 150 mL de ácido acético. 650 mL
de agua destilada.

a) Determinación del peso molecular de proteínas en electroforesis en

condiciones desnaturalizantes.

1. Reconocer cada uno de los aditamentos que constituyen el sistema de

electroforesis. Limpiar los vidrios muy bien con etanol. Colocar los vidrios de acuerdo
a las indicaciones del profesor y verificar que no tengan fuga.
2. En un tubo de centrífuga etiquetado como gel de separación colocar las soluciones
en el orden en el que se presentan en la tabla 14.
3. Mezclar cuidadosamente y vaciar entre los vidrios de la cámara la solución que al
polimerizarse dará lugar al gel de separación al 10%.
4. Colocar sobre la mezcla una pequeña capa de etanol al 70% para favorecer la
polimerización por 30 min.
5. Cuando el gel ya se esté polimerizando, preparar en un tubo de centrífuga
etiquetado como gel de concentración las soluciones de la tabla 14, en el orden en el
que se presentan.

Tabla 14. Componentes del gel de separación y concentración.

Soluciones Gel de separación Gel de concentración

10% 4%
(mL) (mL)

Agua destilada 3.55 3.16

Tris 2 M pH 8.8 1.35 -

Tris 2 M pH 6.8 0.25

52
 53

Acrilamida 2.50 0.53

30%/bisacrilamida
0.8%

SDS 10% 0.075 0.04

Persulfato de amonio 0.025 0.013

10%

TEMED 0.005 0.005

Volumen final 7.5 4

6. Mezclar perfectamente la solución. Retirar el volumen de etanol que se colocó para

favorecer la polimerización, invirtiendo el gel de cabeza. Colocar la solución del gel de
concentración sobre el gel de separación ya polimerizado. Colocar el peine y esperar
a que polimerice por 15 min a temperatura ambiente.
7. Mientras el gel se polimeriza, desnaturalizar las muestras de suero de la siguiente
manera:
8. Preparar 3 muestras de suero (25, 50 y 100 g) en microtubos de 1.5 mL o 0.6 mL.
Considerar las concentraciones determinadas por Biuret o Bradford de acuerdo con
los mejores resultados obtenidos (R2 0.95, curva estándar de Biuret o Bradford). Diluir
la muestra de proteína en un microtubo 1:5 (V/V) con el Buffer 5X Laemly. Calentar
por 5 min en un baño maría en ebullición.
9. Ensamblar la cámara de electroforesis. Adicionar el buffer 1X SDS de corrida hasta
que los electrodos estén completamente cubiertos.
10. Cargar el volumen de muestra preparado en cada pozo. Cargar 6 L del marcador
de peso molecular. Considerar el orden de carga que el profesor indique por equipo.
11. Migar las muestras a 40 mA hasta que el azul de bromofenol alcance la zona del
gel de separación; incrementar la corriente a 15 mA.
12. Detener la electroforesis cuando el azul de bromofenol esté a punto de salir del gel
de acrilamida.
13. Recuperar el gel, cortar el gel concentrador y colocarlo en el sitio de residuos. Teñir
el gel, colocándolo dentro del recipiente con la solución de Coomassie para tinción por
15 min.
14. Desteñir el gel en 50 mL de solución de desteñir durante una hora. Repetir el
procedimiento dos o tres veces más hasta que aparezcan las bandas teñidas de azul
y el fondo casi transparente.

53
 54

15. Para conservar el gel, puede ser como se indica: incubar durante 12 h en glicerol
al 20%. Colocar sobre papel celofán en un bastidor a temperatura ambiente por 2 a 3
días.
Nota: El Marcador de peso molecular utilizado tiene como No. de catálogo_________
(Marca Thermo scientific). Incluir una imagen del patrón de migración del mismo.

RESULTADOS:

1. Incluir en el reporte la(s) foto(s) de los geles de acrilamida realizado.

2. Observar la tabla 15. En la primera columna, anotar el peso molecular de las
proteínas que forman parte del marcador de peso molecular. Medir la distancia
recorrida por cada una de ellas, tomando como cero cm la base del pozo de carga, y
anotarlo en la columna 2.
4. Calcular el logaritmo del peso molecular de las proteínas del marcador de carga (log
(PM)). Calcular la migración relativa tal como se indica en la figura 5.
5. Construir una gráfica en la paquetería Excel, ubicando el logaritmo del Peso
molecular (kDa) del marcador de peso molecular utilizado (eje x) y la movilidad relativa
(eje y). La tendencia de los puntos debe dar una línea recta, por lo tanto se debe
obtener una ecuación que la represente.
6. En lo pozos donde se cargaron las diluciones de suero, se observará más de una
banda. En la tabla 16, asignar una número de banda y medir su correspondiente
distancia migrada. Calcular la movilidad relativa para las muestras de proteína
aisladas.
7. Calcular los pesos moleculares de las proteínas aisladas, a partir de la ecuación de
la recta obtenida en el punto 5. Mostrar los cálculos realizados. 54
 55

8. Incluye en el espacio la gráfica que realizaste y los cálculos requeridos para obtener
los pesos moleculares.

A B
Mw M1

𝑴𝒓 = 𝒅𝒑/𝒅𝒇
𝒅𝒑

260 kDa
𝒅𝒇

140 kDa

100 kDa

70 kDa

Mw: Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained Protein

Ladder #SM1841 Tomada de: [Link]
ilustraci%C3%B3n-electroforesis-de-la-prote%C3%ADna-de-
M1: Lisado de linfocitos humanos suero-de-sangre-image56276357#_
Figura 5. Electroforesis de proteínas en poliacrilamida.
A) En esta imagen se muestra la migración de proteínas de un lisado de linfocitos humanos.
Mr, migración relativa; dp, distancia migrada de la proteína; df, distancia que migra el azul de
coomasie. B) En esta imagen se muestra la migración de las proteínas presentes en el suero
humano.

Tabla 15. Cálculo de la migración relativa de las proteínas del marcador de peso molecular.
Proteínas de marcador
Log (PM) prot
Distancia Migrada
marcador
Peso molecular Mr
(cm)
(kDa)

55
 56

Tabla 16. Cálculo de la migración relativa de las proteínas identificadas en suero humano.

Proteínas en suero No banda Distancia Mr PM

humano (numeración Migrada
arbitraria)
(cm)

CUESTIONARIO:
1. ¿Qué necesitas incluir en la técnica de electroforesis de proteínas para obtener el
tamaño de las proteínas aisladas?
2. ¿Coinciden los pesos moleculares experimentales de las proteínas con los teóricos?

CONCLUSIONES:

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:
56
 57

Barboza-Corona, J. E., Ortiz, G., Salcedo-Hernández, R. (s.f.) Práctica 6: Propiedades

iónica de los aminoácidos en Manual de prácticas de Bioquímica de la División
Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato Campus Irapuato-Salamanca (pp.
16-18)
Barboza-Corona, J. E., Ortiz, G., Salcedo-Hernández, R. (s.f.) Práctica 7: Identificación
de aminoácidos y proteína en Manual de prácticas de Bioquímica de la División
Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato Campus Irapuato-Salamanca (pp.
19-21)
Barboza-Corona, J. E., Ortiz, G., Salcedo-Hernández, R. (s.f.) Práctica 8:
Cromatografía en placa fina y/o papel en Manual de prácticas de Bioquímica de la
División Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato Campus Irapuato-
Salamanca (pp. 22-24)
Barboza-Corona, J. E., Ortiz, G., Salcedo-Hernández, R. (s.f.) Práctica 10:
Determinación aproximada del punto isoeléctrico en Manual de prácticas de
Bioquímica de la División Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato Campus
Irapuato-Salamanca (pp. 27-28).
Doria, M., Ibáñez, J., y Mainero, R. (2009) Experimento 46. Cuantificación de proteínas
en Experimentos de química en microescala para nivel medio superior (1ª Ed., pp.
291).Universidad Iberoamericana, México.
García, H. (2000) Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e
importancia. Univ Diag. 1(2):31-41
Garrido, A., Teijón, J., Blanco, D., Villaverde, C., Mendoza, C., y Ramírez, J. (2006)
Propiedades del grupo amino en Reacciones químicas características de los
aminoácidos en Tema 4: Aminoácidos: propiedades generales en Fundamentos de
Bioquímica estructural (2ª Ed., pp. 68-69) Ed. Tébar, S. L. Madrid, España.
Garrido A., y Teijón, J. (2006) Reacciones específicas de algunos aminoácidos en
Reacciones químicas características de los aminoácidos en Fundamentos de
Bioquímica estructural (2ª Ed., pp 68) Ed. Tébar, S. L., Madrid, España
Guarnizo, A., y Martínez, P. (2013) 19-2A Prueba de Biuret en 19 Obtención y análisis
de caseína en Experimentos de química orgánica, con enfoque en ciencias de la vida
(1ª Ed., pp.183) Elizcom S.A.S., Armenía, Colombia.
Guarnizo, A., y Martínez, P. (2013) 19-2B Reacción Xantoproteíca en 19 Obtención y
análisis de caseína en Experimentos de química orgánica, con enfoque en ciencias de
la vida (1ª Ed., pp.183) Elizcom S.A.S., Armenía, Colombia.
MacFaddin, J. (2003) 14. Prueba de la hidrólisis del hipurato en Pruebas Bioquímicas
para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. (3ª Ed., pp. 185) Ed. Médica
Panamericana S. A. Buenos Aires, Argentina

57
 58

Lemos, M. (2020) Electroforesis de Proteínas: para qué sirve y cómo entender el

resultado. Tomado de: [Link]
Melo, V., y Cuamatzi, O. (2007) Desnaturalización de proteínas en Capítulo 5
Proteínas: estructura y función biológica en Bioquímica de los procesos metabólicos
(2ª Ed., pp. 98) Ed. Reverté, S. A. de C. V., México
Nelson, D., Cox, M. M. y Lehninger, A. L. (2006) Capítulo 3 Aminoácidos, péptidos y
proteínas en Principios de Bioquímica. (4ª Ed., pp. 75-88, 143) Omega.
Padilla, F., Guédez, T., Alfaro, M., Regnault, M., Rincón, A. (2010) Fraccionamiento y
caracterización de las proteínas solubles de la harina de nuez de barinas
(Caryodendron orinocense k.) Revista del instituto nacional de higiene rafael rangel.
ISSN 0798-0477. Tomada de
[Link]
Quesada, S. (2007) Experimento 2. Aminoácidos en Manual de Experimentos de
Laboratorio para Bioquímica (pp. 16-25) Ed. EUNED, San José, Costa Rica.
Quesada, S. (2007) Experimento 3. Proteínas en Manual de Experimentos de
Laboratorio para Bioquímica (pp. 26-33) Ed. EUNED, San José, Costa Rica.
Raya-Pérez, J., Gutiérrez-Benicio, G., Ramírez, J., Covarrubias-Prieto, J., Aguirre-
Mancilla, C. Caracterización de proteínas y contenido mineral de dos variedades
nativas de frijol de México. Agronomía mesoamericana 25(1):01-11. 2014 ISSN:2215-
3608
Roca, P.,, Oliver, J., y Rodríguez, A. ( 2003) Técnicas cromatográficas en Capítulo 9
Técnicas de separación: Cromatografía en Bioquímica. Técnicas y métodos (pp. 118-
123) Ed. Hélice, Madrid, España
Segal, C., y Ortega, G. (2005) Práctica 4 Electroforesis de proteínas en Manual de
prácticas de Biología Molecular de la Célula I (1ª Ed., pp. 51-52) Ed. Publidisa, México
UNAM (2005) Cromatografía de aminoácidos en Prácticas de Bioquímica (4ª Ed., pp.
21-22) México
Vasudevan, DM., Sreekuman S., Vaidayananthan, K. (2011)Reacciones de color de
aminoácidos y proteínas en Texto de Bioquímica (6ª Ed., pp. 26) Ed. Cuéllar Ayala,
México
Vázquez-Jorge, Y., Guerra-Molina, L., Quintana-Tamayo, J., RamírezArzuaga, J.,
Fernando-Ballestero, R., Vázquez-Jorge, Y. (2013) Caracterización físicoquímica y
contenido de proteínas de extractos fluidos del ostión de mangle (Crassostrea
rizophorae) Revista Cubana de química ([Link] 66-74)
Vejar, E. (2005a) Reacción Xantoproteíca en Lectura 7. Reacciones de color para
aminoácidos en Prácticas de bioquímica descriptiva (1ª Ed., pp. 168) Universidad de
Sonora. México
Vejar, E. (2005b) Reacción de Hopkins-Cole en Lectura 7. Reacciones de color para
aminoácidos en Prácticas de bioquímica descriptiva (1ª Ed., pp. 169) Universidad de
Sonora. México 58
 59

Vejar, E. (2005c) Reacción de Millon en Lectura 7. Reacciones de color para

aminoácidos en Prácticas de bioquímica descriptiva (1ª Ed., pp. 167) Universidad de
Sonora. México
Voet, D., Voet, J., y Pratt, C. (2009) Electroforesis en Sección 5.2 Purificación y
electroforesis de proteínas en Fundamentos de bioquímica, la vida a nivel molecular (
2ª Ed.,pp. 105-106) Ed., Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.

59
 60

PRACTICA NO. 3
CINÉTICA ENZIMÁTICA

OBJETIVOS: Aislar enzimas de diferentes fuentes biológicas, determinar la

especificidad por su sustrato. Observar el efecto que tiene la concentración de enzima,
el pH y la temperatura sobre la actividad enzimática. Determinar los parámetros
cinéticos de la catalasa que proviene de diferentes fuentes biológicas, usando las
condiciones óptimas de reacción.

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas que tienen actividad catalítica, es decir son capaces de
actuar sobre una molécula en particular (conocida como sustrato) y convertirla en un
producto completamente diferente (Ramírez y Anaya, 2014). Mientras la reacción se
lleva a cabo se forma un complejo enzima sustrato, y finalmente se libera el producto
sin que la enzima sufra alguna modificación química (figura 6). Estas proteínas tienen
una actividad sobre su sustrato que es dependiente de la temperatura, pH y cofactores
(Del Riesgo Prendes et al., 2012).

Figura 6. Esquema general de la reacción enzimática.

Las enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol
-SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del
medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la
conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un

60
 61

pH óptimo en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica

(Del Riesgo Prendes et al., 2012).
En general, la velocidad de la reacción se incrementa con la temperatura hasta que un
punto máximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el número de
moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de estado de
transición, para formar a los productos. La elevación excesiva de la temperatura del
medio que contiene a las enzimas, resulta en un decremento de la velocidad como
resultado de la desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura tridimensional
de las enzimas (Del Riesgo Prendes et al., 2012).
Por nomenclatura, estas proteínas toman el nombre del sustrato sobre el cual actúan
por lo tanto podemos hacer mención de algunas de ellas:
La sacarasa o invertasa, es una enzima que se encuentra en el metabolismo de las
levaduras, que se encarga de convertir a la sacarosa en glucosa y fructosa.
La amilasa que fácilmente se ubica en la saliva de los seres vivos, es una enzima que
hidroliza el almidón produciendo glucosa (Tena y Novo, 2008).
La enzima catalasa participa de manera activa en la desintoxicación metabólica,
presente en el hígado. Por lo tanto, debe quedar claro que, esta proteína es una
enzima antioxidante en la mayoría de los organismos aerobios, ya que cataliza la
conversión de peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno (Varela Caamina et
al., 2021)
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis
no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de
sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración
de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como
V) aumenta linealmente con el aumento de la [S] (figura 7). Sin embargo, cuando
aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima
(Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S] (figura 8;
Del Riesgo Prendes et al., 2012).
El modelo de la cinética de Michaelis, se lleva a cabo entre la enzima-sustrato
formándose un complejo. La ecuación de Michaelis-Menten, describe como la
velocidad de reacción depende del equilibrio entre la concentración de sustrato y la
contante de la enzima (Del Riesgo Prendes et al., 2012).

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉=
𝐾𝑀 + [𝑆]

61
 62

Modelo de Michaelis-Menten

V0 (mmoles urea hidrolizada/min)

0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0 1 2 3 4
Urea (mmol)

Figura 7. Variación de la velocidad de reacción a diferentes concentraciones de sustrato.

La gráfica de velocidad frente a la concentración de S, no es lineal. Aunque a bajas

concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que
aumenta la concentración de sustrato. Esto dificulta el cálculo de los valores de la K M
y la Vmax, por lo que Lineweaver-Burke lineariza la ecuación obteniendo el doble
recíproco es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Como se puede
apreciar en la figura 8, el resultado de este tipo de representación es una línea recta
cuya ecuación es y = mx + b, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de
ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas
equivalente a -1/Km (Del Riesgo Prendes et al., 2012).

1 𝐾𝑀 1
= +
𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

62
 63

Figura 8. Modelo de Lineweaver-Burk y su representación gráfica.

63
 64

DIAGRAMA DE FLUJO
Actividad 1. Preparación del extracto enzimático.

Actividad 2. Evaluación del efecto de la concentración de enzima en la velocidad

de reacción.

64
 65

Actividad 3. Evaluación del efecto de temperatura con respecto a la actividad

enzimática.

Actividad 4. Evaluación del efecto de pH sobre la velocidad de reacción.

65
 66

Actividad 5. Evaluación de la concentración de sustrato en la velocidad de

reacción.

Actividad 6. Cálculo de la KM y Vmax de la catalasa proveniente de diferentes

fuentes.

Fecha: _________________ Hora de inicio:________ Hora de término:_______

Conocimientos:____ 45 % Habilidades:_____25 % Aptitudes y valores :_____30%

66
 67

PROCEDIMIENTO
Actividad 1. Preparación del extracto enzimático.

MATERIAL Y EQUIPO SOLUCIONES O REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

2 Vasos de precipitado de 250 mL Agua destilada *Papa
*Cuchillo 10 g Glucosa *Zanahoria
*Tabla para picar *Levadura de panificación

NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.

NOTA2: *El material biológico, así como material y soluciones que tengan un asterisco (*), deben ser
proporcionado por los alumnos.

Manipulación de la fuente de enzima

Papa o zanahoria: Cortar la papa o la zanahoria en fragmentos de 1 cm3. Cortar los

fragmentos en el momento que vayan siendo requeridos o conservarlos en un vaso
con agua destilada para reducir la oxidación. Mantener en frío los trozos utilizando
hielo.

Levadura de panificación: Re suspender 5g de levadura en 100 mL de una solución de

glucosa al 2%. Incubar la suspensión a 37-40ºC por 5-10 min para reactivar la levadura
de panificación (la suspensión se puede utilizar cuando se vea en la superficie de la
misma espuma que corresponde a la presencia de dióxido de carbono).

RESULTADOS:

Incluye fotos en donde se muestre la apariencia de las fuentes de enzima, antes y

después de que han sido procesadas.

Etapa Papa Zanahoria Levadura de

panificación
Antes
Después

Nota: El profesor decidirá qué equipo trabajará una fuente de enzima y los resultados serán
compartidos.

CUESTIONARIO
1. Determina la apariencia de la solución recuperada.
67
 68

2. ¿Por qué se almacenan el extracto enzimático en frío?¿Qué sucedería si se dejara

a temperatura ambiente o se llevara a -20°C?

CONCLUSIONES:

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

Actividad 2. Evaluación del efecto de la concentración de enzima en la velocidad

de reacción

MATERIAL Y EQUIPO SOLUCIONES O REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

2 Vasos de precipitado de 250 mL *50 mL H2O2 3% (Se compra en *Papa
las farmacias)
10 Tubos cónicos de 50 mL 10 g Glucosa *Zanahoria
1 Probeta de 50 mL *Detergente líquido *Levadura de panificación
4 Pipetas graduadas de 10 mL Agua destilada
2 Pipetas graduadas de 5 mL
1 Espátula
*4 Reglas
*Computadora portátil
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico, así como material y soluciones que tengan un asterisco (*), deben ser
proporcionado por los alumnos.

1. Preparar agua en un baño maría a una temperatura de 37-40°C.

2. Colocar en un tubo cónico de 50 mL: 15 mL de H2O2 al 3%, una gota de detergente
líquido y mantener en el baño por 3 min.
3. Adicionar al tubo de centrífuga de 50 mL que contiene el H 2O2 al 3%, 3 cubos de
papa/zanahoria, ó 0.2 mL de levadura de panificación. También es posible proponer
los volúmenes a utilizar de acuerdo con el comportamiento de la muestra. Manteniendo
el tubo en el baño maría.
4. Medir la altura del oxígeno (espuma) cada 2 min por 6 min. Homogeneizar
suavemente para mantener el contacto entre el peróxido y los cuadros de papa.
5. Registra los resultados en la tabla 17.
6. Repetir la actividad desde los puntos 2 al 4, modificando los cubos (1, 2) de
papa/zanahoria y los volúmenes de levadura (0.6 y 1 mL).
7. Considerando el diámetro del tubo, calcula el volumen promedio de oxígeno (cm 3)
generado cada 2 minutos. El volumen de oxígeno será calculado como si fuera un
cilindro. Registra los resultados en la tabla 18.

68
 69

8. Gráfica, en el eje de las “y”, el volumen calculado en cm 3; y en el eje de las “x”, el

tiempo en min. Recuerda que la gráfica debe tener el formato de dispersión. En una
misma gráfica incluir las tendencias de los resultados para las tres condiciones
experimentales utilizadas (papa, zanahoria y levadura).
9. Coloca tu cursor sobre los puntos que corresponden a los datos de un experimento,
y con el click izquierdo pide la línea de tendencia. La pendiente de esta gráfica es la
velocidad inicial, es decir la velocidad con la que la enzima está actuando sobre el
sustrato y las unidades son en cm3/min.
10. Obtén las pendientes de las tres series de experimentos y coloca los valores en la
tabla 19. Identifica la pendiente mayor. Mientras mayor sea la velocidad inicial, más
rápida es nuestra enzima y esa será la mejor condición experimental.
11. Para avanzar a la siguiente actividad, debes indicar el número de cubos que se
van a utilizar para evaluar el efecto de la temperatura.
12. En la tabla 19, coloca las velocidades iniciales de todos los modelos biológicos
utilizados.

RESULTADOS:

a) Registra la altura de oxígeno generado en la tabla 17.

Tabla 17. Registro de la altura de oxígeno producido por la catalasa al utilizar 1, 2 y 3 cubos
de papa/zanahoria ó mL de levadura.
Zanahoria Papa Levadura
Tiempo
(min) H1 H2 H3 H1 H2 H3 H1 H2 H3
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (mL) (mL) (mL)
0

H1: altura de un cubo ó 0.2 mL de levadura, H2: altura de dos cubos o 0.6 mL de levadura, H3: altura de tres cubos
o 1.0 mL de levadura.

b) Considerando el diámetro del tubo, calcula el volumen promedio de oxígeno (cm 3)

generado. El volumen de oxígeno será calculado como un cilindro. Registra los
resultados en la tabla 18.

69
 70

Tabla 18: Registro del volumen de oxígeno promedio producido por la catalasa al utilizar 1, 2
y 3 cubos de papa/zanahoria ó 0.2, 0.6 y 1 mL de levadura. [V=(( * r2))*Hn], donde Hn es la
altura dependiendo el número de cubos o mL de levadura.

Zanahoria Papa Levadura

Tiempo VC1 VC2 VC3 VC1 VC2 VC3 VC1 VC2 VC3
(min) (cm ) (cm ) (cm3)
3 3
(cm3) (cm3) (cm3) (cm ) (cm ) (cm3)
3 3

0
2
4
6
VC1, volumen utilizando un cubo o 0.2 mL de levadura, VC2: volumen utilizando dos cubos o 0.6 mL de levadura y
VC3: volumen utilizando tres cubos o 1.0 mL de levadura. Unidades en cm3. X, el tiempo (min). Y, Volumen del
oxígeno producido (cm3). Velocidad inicial, es la pendiente de la regresión lineal de cada conjunto de datos (m).

c) Gráfica, en el eje de las “y”, el volumen calculado en cm 3; y en el eje de las “x”, el

tiempo en min. Recuerda que la gráfica debe tener el formato de dispersión. Obtener
la pendiente de la recta y ese valor será la velocidad de reacción en unidades de
cm3/min. Registrar el valor de la velocidad inicial en la tabla 19. Identificar cual es la
concentración de enzima óptima (cubos o mL).

Tabla 19. Efecto de la concentración de enzima en la velocidad inicial de la reacción

enzimática.
Cantidad de enzima Velocidad inicial (cm3/min)
(mL o cubos)
Levadura Papa Zanahoria
0.2 1
0.6 2
1.0 3

CUESTIONARIO:

1.¿Cuál es el volumen óptimo/ cubos de zanahoria o papa del ensayo?

CONCLUSIONES:_____________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

70
 71

Actividad 3. Evaluación del efecto de temperatura con respecto a la actividad

enzimática

MATERIAL Y EQUIPO SOLUCIONES O REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

2 Vasos de precipitado de 250 mL *50 mL H2O2 3% (Se compra en *Papa
las farmacias)
10 Tubos cónicos de 50 mL 10 g Glucosa *Zanahoria
1 Probeta de 50 mL *Detergente líquido *Levadura de panificación
4 Pipetas graduadas de 10 mL Agua destilada
2 Pipetas graduadas de 5 mL
1 Espátula
*Cuchillo
*4 Reglas
*Computadora portátil
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico, así como material y soluciones que tengan un asterisco (*), deben ser
proporcionado por los alumnos.

1. Preparar un baño maría a la temperatura: 0-5°C, 37-40ºC y otro a 55-60°C.

2. Colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL: 15 mL de H 2O2 al 3%, una gota de
detergente líquido y mantener en el baño por 3 min.
3. Adicionar al tubo cónico de 50 mL que contiene el H 2O2 al 3%, ______ cubos/mL
de papa/zanahoria/levadura seleccionados de acuerdo con la mayor velocidad inicial.
Manteniendo un par de tubos en hielo y el otro par de tubos a 55-60°C. Los datos
correspondientes a la temperatura de 37-40°C, serán tomados de la actividad anterior.
4. Medir la altura del oxígeno (espuma) cada 2 min por 6 min. Homogeneizar
suavemente para mantener el contacto entre el peróxido y la enzima. Registra los
resultados en la tabla 20.
5. Considerando el diámetro del tubo, calcula el volumen promedio de oxígeno (cm 3)
generado cada 2 minutos. El volumen de oxígeno será calculado como si fuera un
cilindro. Registra los resultados en la tabla 21.
6. Gráfica, en el eje de las “y”, el volumen calculado en cm 3; y en el eje de las “x”, el
tiempo en min. Recuerda que la gráfica debe tener el formato de dispersión. En una
misma gráfica incluir las tendencias de los resultados para 0-5°C, 37-40°C y 55-60°C.
7. Como ya sabes, coloca tu cursor sobre los puntos que corresponden a los datos de
un experimento, y con el click izquierdo pide la línea de tendencia. La pendiente de
esta gráfica es la velocidad inicial, es decir la velocidad con la que la enzima está
actuando sobre el sustrato y las unidades son en cm3/min.
8. Obtén las pendientes de las tres series de experimentos y coloca los valores en la
tabla 22. Identifica la pendiente mayor. Mientras mayor sea la velocidad inicial, más
rápida es la enzima y esa será la mejor condición experimental.

71
 72

9. Para avanzar a la siguiente actividad, debes indicar la temperatura óptima ______,

que se fijará para evaluar el efecto del pH sobre la velocidad de reacción.
10. En la tabla 22, coloca las velocidades iniciales de todos los modelos biológicos
utilizados.

RESULTADOS:

a) Registra la altura de oxígeno generado en la tabla 20.

Tabla 20. Registro de la altura de Oxígeno producido por la catalasa al utilizar 5, 40 y

60°C
Zanahoria Papa Extracto de levadura
Tiempo
H10° H40 H60 H10° H40 H60 H10° H40 H60
(min)
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm)

6
H10°: altura a 10°C, H40°: altura a 40°C, H60°: altura a 60°C.

b) Considerando el diámetro del tubo, calcula el volumen promedio de oxígeno (cm 3)

generado. El volumen de oxígeno será calculado como un cilindro. Registra los
resultados en la tabla 21.

Tabla 21. Registro del volumen de oxígeno promedio producido por la catalasa al
utilizar 10, 40 y 60°C.
Tiempo Zanahoria Papa Extracto de levadura
(min) V10° V40° V60° V10° V40° V60° V10° V40° V60°
(cm )
3
(cm ) (cm ) (cm ) (cm ) (cm ) (cm ) (cm ) (cm3)
3 3 3 3 3 3 3

4
72
 73

6
V10°, volumen a 10°C, V40°: volumen a 40°C, V60°: volumen a 60°C. X, el tiempo (min). Y, Volumen del oxígeno
producido (cm3)

c) Gráfica, en el eje de las “y”, el volumen calculado en cm 3; y en el eje de las “x”, el

tiempo en min. Recuerda que la gráfica debe tener el formato de dispersión. Obtener
la pendiente de la recta y ese valor será la velocidad de reacción en unidades de
cm3/min. Registrar el valor de la velocidad inicial en la tabla 22. Identificar cual es la
concentración de enzima óptima.

d) Registra la velocidad inicial de todos los experimentos y coloca los valores en la

tabla 22.

Tabla 22. Efecto de la temperatura en la velocidad inicial de la reacción enzimática.

Temperatura (°C) Velocidad inicial (cm3/min)
(mL o cubos)
Levadura Papa Zanahoria

10
40
60

CUESTIONARIO:
1. ¿Cómo varía la velocidad inicial con respecto a la temperatura?
2. Compara la temperatura óptima que obtuviste con la temperatura óptima de la
bibliografía.
CONCLUSIONES:

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Actividad 4: Evaluación del efecto de pH sobre la velocidad de reacción

MATERIAL Y EQUIPO SOLUCIONES O REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

2 Vasos de precipitado de 250 mL *50 mL H2O2 3% (Se compra en *Papa
las farmacias)
10 Tubos cónicos de 50 mL 10 g Glucosa *Zanahoria
1 Probeta de 50 mL *Detergente líquido *Levadura de panificación

73
 74

4 Pipetas graduadas de 10 mL Agua destilada

2 Pipetas graduadas de 5 mL 60 mL Amortiguador pH 4.0
1 Espátula 60 mL Amortiguador pH 7.0
*Cuchillo 60 mL Amortiguador pH 10.0
*4 Reglas
*Computadora portátil
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico, así como material y soluciones que tengan un asterisco (*), deben ser
proporcionado por los alumnos.

Amortiguador pH 4: Preparar una solución de 0.1 M de ácido acético y 0.1 M de

acetato de sodio trihidratado. Ajustar el pH a 4.00.
Amortiguador fosfatos pH 7 (1 L): 0.7 g de fosfato de potasio dihidrogenado
(KH2PO4); 1 g de fosfato de sodio (Na2HPO4). Solubilizar en 850 mL. Ajustar el pH a
7.00. Aforar a 1 L
Amortiguador pH 10: Preparar una solución de 0.1 M de fosfato de potasio
monobásico, KH2PO4. Ajustar a pH 10.

1. En este caso se observará como se modifica la velocidad de reacción a pH 4.0, 7.0

y 10.0.
2. Preparar un baño maría de acuerdo con el rango de temperatura _____ºC en donde
se obtuvo la velocidad de reacción más rápida que corresponderá a la mayor
producción de oxígeno en el menor tiempo.
3. Colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL: 15 mL del amortiguador a pH 4.0, 15
mL de H2O2 al 3%, una gota de detergente líquido. Incubar por 3 minutos a la
temperatura seleccionada.
3. Adicionar al tubo de centrífuga los ____ cubos/mL de
papa/zanahoria/levadura/hígado seleccionados de acuerdo con la mayor velocidad
inicial.
4. Medir la altura del oxígeno (espuma) cada 2 min por 6 min. Homogeneizar
suavemente para mantener el contacto entre el peróxido y los cuadros de
zanahoria/papa/volumen de extracto de levadura ______. Registra los resultados en
la tabla 23. Repite el experimento variando el pH 7 y 10.
5. Considerando el diámetro del tubo, calcula el volumen promedio de oxígeno (cm 3)
generado cada 2 minutos. El volumen de oxígeno será calculado como si fuera un
cilindro. Registra los resultados en la tabla 24.
6. Gráfica, en el eje de las “y”, el volumen calculado en cm3; y en el eje de las “x”, el
tiempo en min. Recuerda que la gráfica debe tener el formato de dispersión. En una
misma gráfica incluir las tendencias de los resultados para pH 4, 7 y 10.
7. Como ya sabes, coloca tu cursor sobre los puntos que corresponden a los datos de
un experimento, y con el click izquierdo pide la línea de tendencia. La pendiente de

74
 75

esta gráfica es la velocidad inicial, es decir, la velocidad con la que la enzima está
actuando sobre el sustrato y las unidades son en cm3/min.
8. Obtén las pendientes de las tres series de experimentos y coloca los valores en la
tabla 25. Identifica la pendiente mayor. Mientras mayor sea la velocidad inicial, más
rápida es nuestra enzima y esa será la mejor condición experimental.
9. Para avanzar a la siguiente actividad, debes indicar el pH óptimo ______, que se
fijará para evaluar los parámetros cinéticos KM y Vmáx.
10. En la tabla 25, coloca las velocidades iniciales de todos los modelos biológicos
utilizados.

RESULTADOS:

a) Registra la altura de oxígeno generado en la tabla 23.

Tabla 23. Registro de la altura de oxígeno producido por la catalasa al utilizar pH 4, 7

y 10.
Zanahoria Papa Extracto de levadura
Tiempo
(min) H4 (cm) H7 (cm) H10 H4 (cm) H7 (cm) H10 H4 (cm) H7 (cm) H10
(cm) (cm) (cm)

6
H4: altura pH 4, H7: altura pH 7 y H10: altura a pH 10.

b) Considerando el diámetro del tubo, calcula el volumen promedio de oxígeno (cm 3)

generado. El volumen de oxígeno será calculado como un cilindro. Registra los
resultados en la tabla 24.

Tabla 24. Registro del volumen de oxígeno producido por la catalasa al utilizar pH 4, 7
y 10.
Tiempo Zanahoria Papa Extracto de levadura
(min) V4 V7 V10 V4 V7 (cm3) V10 V4 V7 V10
(cm ) (cm ) (cm ) (cm )
3 3 3 3
(cm ) (cm ) (cm ) (cm3)
3 3 3

75
 76

6
V4, volumen a pH 4, V7: volumen a pH 7, V10: volumen a pH 10. X, el tiempo (min). Y, Volumen del oxígeno producido
(cm3)

c) Gráfica, en el eje de las “y”, el volumen calculado en cm 3; y en el eje de las “x”, el

tiempo en min. Recuerda que la gráfica debe tener el formato de dispersión. Obtener
la pendiente de la recta y ese valor será la velocidad de reacción en unidades de
cm3/min. Registrar el valor de la velocidad inicial en la tabla 25. Identificar cual es la
concentración de enzima óptima.

d) Registra la velocidad inicial de todos los experimentos y coloca los valores en la

tabla 25.

Tabla 25. Efecto del pH en la velocidad inicial de la reacción enizmática.

Velocidad inicial (cm3/min)
pH
Levadura Papa Zanahoria

76
 77

10

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál el valor del pH óptimo?
2. ¿Qué pasaría si utilizas un pH fuera del rango que se usó en este experimento?
3. ¿Cuál es la importancia de mantener el pH en una reacción enzimática?
4. Investiga el pI de la catalasa y explica lo que sucedería si el buffer de reacción tiene
un pH 4.

CONCLUSIONES:

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

Actividad 5. Evaluación de la concentración de sustrato en la velocidad de

reacción.
MATERIAL Y EQUIPO SOLUCIONES O REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO
2 Vasos de precipitado de 250 mL *50 mL H2O2 3% (Se compra en *Papa
las farmacias)
10 Tubos cónicos de 50 mL 10 g Glucosa *Zanahoria
1 Probeta de 50 mL *Detergente líquido *Levadura de panificación
4 Pipetas graduadas de 10 mL Agua destilada
2 Pipetas graduadas de 5 mL 100 mL Amortiguador pH 4.0 ó pH
7.0 ó pH 10.0
1 Espátula
*Cuchillo
*4 Reglas
*Computadora portátil
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico, así como material y soluciones que tengan un asterisco (*), deben ser
proporcionado por los alumnos.
NOTA3: Cada equipo debe solicitar al técnico el amortiguador que requerirá con anticipación para
realizar la actividad 5

1. Para identificar la KM de la enzima se debe identificar la velocidad de reacción de

ésta variando la concentración de sustrato. Las concentraciones de sustrato a utilizar
serán 0, 0.5, 1, 1.5, 2 y 3%. La preparación de la solución de reacción se preparará de
acuerdo con lo indicado en la tabla 26.

77
 78

2. Preparar un baño maría de acuerdo con el rango de temperatura seleccionada.

3. Colocar en un tubo cónico de 50 mL, el volumen de amortiguador y H2O2 de acuerdo
a la concentración de H2O2 que se va a utilizar.
4. Colocar el tubo con la solución de reacción en el baño maría por 3 min.
5. Adicionar al tubo que contiene la solución de reacción, la cantidad de enzima que
se decidió utilizar en la actividad 2.
6. Medir la altura del oxígeno (espuma) cada 2 min por 6 min. Homogeneizar
suavemente para mantener el contacto entre el peróxido y los cuadros de papa.
Registra los resultados en la tabla 27. Repite el experimento variando la concentración
de sustrato.
7. Considerando que el diámetro del tubo es de 5 cm, obtén la altura y registra los
resultados en la tabla 27.
8. Calcula el volumen de oxígeno (cm3) generado cada 2 minutos. El volumen de
oxígeno será calculado como si fuera un cilindro. Registra los resultados en la tabla
28.

Tabla 26. Variaciones en la concentración de sustrato.

Concentración de H2O2 Amortiguador pH ____ H2O2 3%
(%) (mL) (mL)
0 15 0
0.5 25 5
1.0 20 10
1.5 15 15
2.0 10 20
3.0 0 30

RESULTADOS:

a) Registra la altura de oxígeno generado en la tabla 27.

Tabla 27. Registro de la altura de oxígeno producido por la catalasa al utilizar las
diferentes concentraciones de sustrato.

Zanahoria
Tiempo
(min) H0% H0.5% H1.0% H1.5% H2.0% H3.0%
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm)
78
 79

Papa
Tiempo
H0% H0.5% H1.0% H1.5% H2.0% H3.0%
(min)
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm)

Extracto de levadura
Tiempo
(min) H0% H0.5% H1.0% H1.5% H2.0% H3.0%
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm

6
H0%: altura tubo a 0% sustrato, H0.5%: altura tubo a 0.5% sustrato, H1.0%: altura tubo a 1.0 % de sustrato, H1.5%: altura
tubo a 1.5% de sustrato, H2.0%: altura tubo a 2.0% de sustrato, H3.0%: altura tubo a 3.0% de sustrato.

b) Considerando el diámetro del tubo, calcula el volumen promedio de oxígeno (cm3)

generado. El volumen de oxígeno será calculado como un cilindro. Registra los
resultados en la tabla 28.

Tabla 28. Registro del volumen de oxígeno producido por la catalasa al utilizar 0, 0.5,
1.0, 1.5, 2.0 y 3.0 % en cada condición.

Tiempo Zanahoria

79
 80

(min) V0% V0.5% V1.0% V1.5% V2.0% V3.0%

(cm3) (cm3) (cm3) (cm3) (cm3) (cm3)

Tiempo Papa
(min) V0% V0.5% V1.0% V1.5% V2.0% V3.0%
(cm3) (cm3) (cm3) (cm3) (cm3) (cm3)

Tiempo Extracto de levadura

(min) V0% V0.5% V1.0% V1.5% V2.0% V3.0%
(cm3) (cm3) (cm3) (cm3) (cm3) (cm3)

6
V0%, Volumen a 0% sustrato, V0.5%: Volumen a 0.5% sustrato, V1.0%: Volumen a 1% sustrato, V1.5%: Volumen a 1.5%
sustrato, V2.0%: Volumen a 2% sustrato y V3.0%: Volumen a 3% sustrato.

CONCLUSIONES:

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
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 81

Actividad 6. Cálculo de la KM y Vmax de la catalasa proveniente de diferentes

fuentes.

MATERIAL Y EQUIPO SOLUCIONES O REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

*Computadora portátil
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico, así como material y soluciones que tengan un asterisco (*), deben ser
proporcionado por los alumnos.

1. Con los datos obtenidos en la tabla 29 a la 31, grafica en el eje de las “y”, la Vo y en
el eje de las “x”, grafica la concentración de sustrato [% H2O2]. Este gráfico representa
el modelo de Michaelis-Menten.
2. Con los datos obtenidos en la tabla 29 a la 31, grafica en el eje de las “y”, 1/Vo y en
el eje de las “x”, grafica el inverso de la concentración de sustrato (1/S). Este gráfico
representa el modelo de LineWeaver-Burk. Obtén la pendiente de la recta y calcula la
KM y la Vmáx.

RESULTADOS:

a) Registrar el valor de Vo en las tablas 29 a la 31, dependiendo de la fuente de enzima

utilizada. Calcular los recíprocos de 1/[S] y 1/Vo.

Tabla 29. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de zanahoria

H2O2 (%) 0 0.5 1 1.5 2 3
Vo (%/t)
1/[S] (1/%)
1/Vo (t/%)
Donde [S]= % H2O2

Tabla 30. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de papa

H2O2 (%) 0 0.5 1 1.5 2 3
Vo (%/t)
1/[S] (1/%)
1/Vo (t/%)
Donde [S]= % H2O2

Tabla 31. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de levadura de

panificación
H2O2 (%) 0 0.5 1 1.5 2 3
Vo (%/t)

81
 82

1/[S] (1/%)
1/Vo (t/%)
Donde [S]= % H2O2

b) Graficar la Vo (eje y) vs [S] (eje x), para representar el modelo de Michaelis-Menten.

c) Graficar 1/Vo (eje y) vs 1/[S] (eje x), en donde la pendiente de la linearización será
KM/Vmax y la intersección con el eje y, es 1/Vmax. Esta gráfica representa el modelo de
Lineweaver-Burk.
d) Vaciar los parámetros cinéticos (KM y Vmax) en la tabla 32. Comparar los valores e
indicar cual es la catalasa más específica por su sustrato.

Tabla 32. Comparación de los parámetros cinéticos

Parámetros Sistemas biológicos
cinéticos
Levadura Papa Zanahoria
KM
Vmáx

CUESTIONARIO:
1. ¿La enzima corresponde al modelo de Michaelis-Menten?
2.¿Qué significa el valor de la Km?
3. Propón un experimento en donde se observe la inhibición de la enzima.

CONCLUSIONES:

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA:

Ramírez, J. y Anaya, M. (2014). Enzimas: ¿qué son y cómo funcionan?. Revista Digital
Universitaria ISSN: 1607 – 6079. vol.15, No.12.
[Link]
Del Riesgo Prendes, Lilia, Garzón Fernández, Ruth, Castillo Rivera, Fabio. (2012).
Colección lecciones de ciencias naturales y matemáticas. Ed. Universidad del rosario.
Págs 111-122.
Tena, M. y Novo, , Jesús, J. (2008) Extracción y ensayo de la actividad invertasa de
levadura de panadería Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus
Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba.
Chaplin MF (1986) Monosaccharides. En Chaplin MF, Kennedy JF (eds.):
“Carbohydrate Analysis: A Practical Approach”. IRL Press (Oxford, England) pp. 1-36.
82
 83

Descripción muy simple pero bastante completa de los principales métodos de análisis
de monosacáridos.
Petrona , A. (2012). Prácticas de laboratorio de bioquímica. Instituto Tecnológico del
Conkal. Secretaría de Educación Pública. Págs. 35-39.
[Link]
Durazo, E. (2018). Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica. Facultad de
Ciencias Marinas UABC. Págs. 26-29. [Link]
[Link]
Varela Caamiña, María Peregrina; Blanco Anaya, Paloma y Díaz de Bustamante,
Joaquín. (2021). ¿Por qué paran las reacciones? Diseñar experimentos para indagar
la interacción enzima-sustrato. Educación Química, 32(2). DOI:
[Link]

83
84

84
 85

PRÁCTICA NO. 4
ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVOS: Identificar algunas propiedades de los carbohidratos. Identificar el poder

reductor de algunos carbohidratos. Aplicar un método de cuantificación de
carbohidratos en jugos o bebidas de cola. Utilizar la cromatografía en capa fina para
la identificación de carbohidratos.

INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos ó azúcares, reciben este nombre debido a que la mayor parte de
ellos se caracterizan por tener sabor dulce. Sin embargo, esta propiedad la presentan
solamente los monosacáridos y los oligosacáridos, ya que los polisacáridos
generalmente son insípidos. Los carbohidratos de bajo peso molecular son conocidos
como monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos; mientras que los de elevado peso
molecular contienen más de 20 unidades de monosacárido y son conocidos como
polisacáridos.. Otras características típicas de estas biomoléculas son su solubilidad
en agua y su capacidad de cristalizar (Nelson, et al, 2006; Gonzáles et al., 2003).
Los azúcares, se caracterizan por tener al grupo funcional carbonilo (aldehído o
cetona), y muchos grupos hidroxilos (Nelson, et al, 2006). Los disacáridos, están
constituidos por dos monosacáridos que se encuentran unidos covalentemente
mediante un enlace o-glicosídico que se forma cuando el grupo hidroxilo de un azúcar
reacciona con el carbono anomérico de otro carbohidrato. De igual manera, los
polisacáridos, están constituidos por monosacáridos unidos entre sí por enlaces o-
glicosídicos(Nelson, et al, 2006).
Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, debido al
grupo carbonilo libre que tienen en su molécula (figura 9). Este carácter reductor se
identifica mediante la reacción redox llevada a cabo entre el grupo carbonilo y el sulfato
de cobre (II), en un ambiente con pH alcalino. Cuando la reacción se lleva a cabo con
el glúcido reductor, se forma óxido de cobre (I) de color amarillo a rojo ladrillo,
indicando que el glúcido presente es reductor (Nelson, et al, 2006; Herrera et al., 2003).

85
 86

Figura 9. Disacárido reductor y no reductor.

Los reactivos que se utiliza para la identificación de azúcares reductores, son el

reactivo Fehling o el reactivo de Benedict. El reactivo de Fehling está constituidos por
dos soluciones: Fehling A: sulfato cúprico (y Fehling B: hidróxido de sodio (NaOH), y
tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6*4H2O).
En medio alcalino, el cobre procedente del sulfato cúprico (CuSO4) se encuentra en
forma de hidróxido cúprico, y se forma la correspondiente sal Na2SO4. Cuando el
Cu(OH)2 (de color azul) se calienta en presencia de un compuesto reductor se forma
óxido cuproso (de color rojo ladrillo) (Gustsche y Pasto, 1979). Si hay un compuesto
reductor, el cobre cambia su estado de oxidación de (2+ a 1+), lo que se evidencia por
el cambio de color (figura 10).

Figura 10. Reacción de Fehling en presencia de carbohidratos reductores.

Otro de los métodos que también se estudiarán en esta práctica es la cromatografía

de capa fina. Este método es muy utilizado, ya que con él se pueden separar y
caracterizar las moléculas de carbohidratos en base a la afinidad que existe entre las
fases móvil y la estacionaria, (Herrera et al., 2003). Los cromatofolios son revelados,
al exponer los carbohidratos que se han separado con ácido sulfúrico concentrado y
calor. Los carbohidratos sufren una deshidratación al perder tres moléculas de agua,
86
 87

dando lugar a un derivado de furfural de color café (figura 11; Guarnizo y Martínez,
2009).

Figura 11. Identificación de carbohidratos con ácido sulfúrico.

87
 88

DIAGRAMA DE FLUJO:
Actividad 1. Identificación de las propiedades físicas de los carbohidratos

Actividad 2. Análisis cromatográfico

Actividad 3. Cuantificación de lactosa en muestras de leche

88
 89

Fecha: _________________ Hora de inicio:________ Hora de término:_______

Conocimientos:____ 45 % Habilidades:_____ 25 % Aptitudes y valores :______30 %

89
 90

PROCEDIMIENTO:

Actividad 1. Identificación de las propiedades físicas de los carbohidratos

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS POR EQUIPO
21 Tubos de ensayo Agua destilada
3 Pipetas graduadas de 5 mL 0.2 g Carbohidratos en estado sólido:
glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa,
lactosa, almidón, celulosa.
1 Pizeta 25 mL de Alcohol etílico grado industrial.
7 Microtubos de 0.6 mL 3 mL Glucosa 2%
1 Espátula 3 mL Fructosa 2%
2 Pipetas graduadas de 5 mL 3 mL Maltosa 2%
2 Pipetas graduadas de 10 mL 5 mL Sacarosa 2%
1 Propipeta o perilla 3 mL Lactosa 2%
1 Parrilla de calentamiento 25 mL de almidón 2%
1 Vaso de precipitado de 250 mL 3 mL de celulosa 2%
1 Gradilla para tubos de ensayo 3 mL del Reactivo de Fehling A
2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL 3 mL del Reactivo de Fehling B
1 vidrio de reloj 1 mL HCl concentrado
1 Hielera 25 mL Almidón 2% en NaCl 0.9%
5 Perlas de vidrio Hielo
1 g Bicarbonato de sodio (s)

Preparación del Reactivo de Fehling

Reactivo de Fehling: Preparar 2 soluciones por separado en matraces de 500 mL;
para la solución A, se disuelven 35 g. de sulfato de cobre (CuSO 4) en 150 mL de
agua destilada. Se coloca a baño maría para favorecer la disolución. Luego se le
agrega 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4), y se completa hasta un volumen
de 500 mL con agua destilada. Para la solución B, se disuelven 173 g. de tartrato de
sodio y potasio (sal de Rochelle; KNaC4H4O6.4H2O) y 50 g. de hidróxido de sodio
(NaOH) en 400 mL. de agua destilada. Se coloca a baño maría para favorecer la
disolución. Finalmente, se completa el volumen con agua destilada a 500 mL.

a) Identificación de la solubilidad en agua y en alcohol.

1. Preparar dos series con 7 tubos de ensayo cada una.
2. Etiquetar cada tubo con el nombre del carbohidrato y el disolvente a utilizar: agua o
alcohol etílico grado industrial.
3. Colocar en cada tubo la porción de carbohidratos en estado sólido indicada por el
profesor. Las muestras a analizar son: glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa, lactosa,
almidón y celulosa.
4. Adicionar a la serie del disolvente Agua, 3 mL de esta, y 3 mL de alcohol etílico a la
otra serie.
90
 91

5. Homogenizar los tubos utilizando un agitador vortex a temperatura ambiente.

Registrar los resultados en la tabla 33.
5. Colocar en un baño maría en ebullición por 5 min, todas aquellas muestras que no
se solubilizaron a temperatura ambiente. Registrar los resultados en la tabla 33.
NOTA: Ten mucho cuidado con las muestras que contienen alcohol etílico, durante el
calentamiento podría llevarse a cabo una reacción de combustión de manera
espontánea..

b) Identificación del poder reductor mediante la prueba de Fehling

1. Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de cada uno de los carbohidratos a una
concentración del 2%.
2. Añadir en cada tubo 5 gotas del reactivo de Fehling A y 5 gotas del reactivo de
Fehling B.
3. Calentar en baño maría en ebullición durante 5 minutos y observar si hay un cambio
de coloración. Registra los resultados en la tabla 34.

c) Conversión de un disacárido no reductor en reductor.

1. Tomar 2 mL de sacarosa al 2% y añadir 10 gotas de HCl concentrado.
2. Calentar en un baño maría en ebullición durante 10 minutos.
3. Dejar que el tubo se ponga a temperatura ambiente. Adicionar bicarbonato de sodio
en polvo, la cantidad suficiente hasta lograr la neutralización.
4. Realizar la prueba de Fehling.

d) Conversión de un polisacárido no reductor en reductor.

1. Colocar 20 mL de almidón al 2% y 5 perlas de vidrio en un matraz Erlenmeyer de
125 mL.
2. Adicionar a la solución, 1 mL de HCl concentrado, mezclar y colocar en una parrilla
de calentamiento para que hierva suavemente.
3. Colocar en la boca del matraz un vidrio de reloj con hielo para evitar la pérdida de
volumen.
4. Cada 10 minutos, tomar 1 mL de la mezcla de reacción y colocarlo en un tubo de
ensayo.
5. Dejar que el tubo se ponga a temperatura ambiente. Adicionar bicarbonato de sodio
en polvo, la cantidad suficiente hasta lograr la neutralización.
6. Realizar la prueba de Fehling.
7. Repetir los puntos 4-6, dos veces más. En total se deberán hacer 3 tomas, lo que
involucra una hidrólisis de 30 minutos.

91
 92

RESULTADOS
a) Identificación de la solubilidad en agua y alcohol
Registra en la tabla 33, de acuerdo a la solubilidad de los azúcares: +++: soluble; ++:
parcialmente soluble; neg: insoluble. Incluye una fotografía para documentar los
resultados.

Tabla 33. Solubilidad de azúcares en agua y alcohol.

Carbohidrato Solubilidad Solubilidad

en agua en alcohol

Glucosa

Fructosa

Maltosa

Sacarosa

Lactosa

Almidón

Celulosa

b) Identificación del poder reductor. Registra en la tabla 34, pos positivo ó neg
negativo, si los carbohidratos reaccionaron durante la prueba de Fehling. Incluye una
fotografía para documentar los resultados.

Tabla 34. Identificación de azúcares reductores.

Carbohidrato Azúcar Azúcar no

reductor reductor

Agua

Glucosa

Fructosa

Maltosa

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 93

Sacarosa

Lactosa

Almidón

Celulosa

c y d) Conversión de un carbohidrato no reductor en reductor. Anote sus

resultados. Toma una foto y colócala en los espacios que le correspondan en la tabla
35 y 36. Registra sobre las tablas, de acuerdo a la reacción si el carbohidrato es
reductor o no reductor. En el caso del almidón, menciona en que tiempo inicia la
hidrólisis

Tabla 35. Reacción de Fehling con sacarosa antes y después de la hidrólisis.

Sacarosa Sacarosa hidrolizada

Tabla [Link]ón de Fehling con almidón antes y después de la hidrólisis.

Reacción de Fehling Reacción de Fehling después de

antes de adicionar HCl adicionar HCl (min)

10 20 30

Almidón

93
 94

CUESTIONARIO
1.- Defina carbono anomérico.
2.- Explique que es un azúcar reductor.
3.- ¿Cuál es la configuración y posición de enlace glucosídico que se hidroliza con el
HCl concentrado en la sacarosa y almidón?

CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Actividad 2. Análisis cromatográfico.

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO
10 Tubos de ensaye 16 x 150 por 1g Glucosa *Fruta de temporada (alumnos)
grupo
1 Vaso de precipitado de 50 mL 1 g Sacarosa *5 mL Jugo de caña de azúcar o
azúcar de mesa (alumnos)
1 Vaso de precipitados de 250 mL 1 g Lactosa *5 mL Refresco normal (alumnos)
1 Vidrio de reloj Agua destilada *5 mL Refresco light (alumnos)
1 Pizeta 5 mL Butanol *5 mL Leche descremada
(alumnos)
3 Pipetas graduadas de 5 mL 5 mL Ácido acético *5 mL Leche deslactosada
(alumnos)
2 Pipetas graduadas de 10 mL 5 mL Ácido sulfúrico
1 Probeta de 25 mL 1 mL Solución de lavado para
capilar
1 Regla 5 mL Solución reveladora de
carbohidratos
1 Cutter
1 Pinzas de disección
1 Estufa
1 capilar y algodón
1 Encendedor
4 Cromatofolios de 5x6 cm
5 capilares
1 Hielera
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

Solución de lavado para capilar: 200 L butanol, 100 L ácido acético y 100 L de
agua destilada.
Solución reveladora de carbohidratos: Para 41 mL se requiere 20 mL de etanol, 20
mL de agua destilada y 1 mL de ácido sulfúrico.
94
 95

1. Cada equipo escogerá una muestra problema a utilizar. Las muestras problema son:
jugo de caña de azúcar ó azúcar de mesa, refresco normal, refresco ligth, leche
descremada, leche deslactosada y alguna fruta de temporada. Cada equipo deberá
hacer una investigación previa a la sesión práctica para identificar los carbohidratos
presentes en la muestra seleccionada. Escoger dos de estos carbohidratos y utilizarlos
como carbohidratos estándar o de control.
2. Preparar los estándares de los carbohidratos al 5% en agua destilada.
3. Mezclar 1 mL de la muestra problema con 1 mL de etanol y 4 mL de agua destilada.
4. En una placa de silica gel de 5 x 6 cm, señalar una línea recta de referencia a menos
de 1.0 cm del extremo inferior de la placa. Cargar con un capilar una de las muestras
problema, así como todos los estándares. Cada vez que se vaya a cargar una muestra
diferente lavar el capilar en la solución de lavado. Las muestras tienen que estar
separadas entre sí por 1 cm, aproximadamente.
5. Cargar las muestras una vez, dejar que sequen y repetir la carga 2 veces más.
6. Seleccionar un vaso de precipitado, de acuerdo al tamaño del cromatofolio, para
que este quede inclinado. Medir el volumen de fase móvil que se requiere preparar en
función del volumen del vaso de precipitado seleccionado.
7. Preparar de la fase móvil en las siguientes proporciones [Link] de n-butanol:ácido
acético:agua destilada, en el vaso de precipitado seleccionado. NOTA: Mantener
tapada la fase móvil con papel aluminio.
8. Introducir las placas que han sido cargadas. Tapar el vaso de precipitado con papel
aluminio, colocarlo en un lugar en donde se pueda observar la migración de la fase
móvil y no moverlo. Retirar la placa del vaso de precipitado cuando la fase móvil no
avance. Marcar inmediatamente con un lápiz el frente del disolvente.
9. Secar al aire por 15 min y aplicar la solución reveladora de carbohidratos con un
cotonete de algodón preparado con una varilla de vidrio.
10. Revela colocando la placa en la estufa a 100ºC durante 5 min o el tiempo suficiente
para que las bandas de las muestras se observen de color café.

RESULTADOS:
1. En la tabla 37, incluye una foto de los cromatofolios, en donde señales el nombre
de cada uno de los carbohidratos presentes en las muestras utilizadas. Determinar el
factor de retención de las muestras analizadas (Rf) como se indica en la figura 12.
Incluye los cálculos del Rf para cada cromatofolio.

95
 96

Tabla 37. Factores de retención de las muestras problema evaluadas.

Muestra Foto Factor de retención

Cromatofolio (Rf)
1._______________
2._______________
3. Caña de azúcar
1._______________
2._______________
3. Refresco normal
4. Refresco ligth
1._______________
2._______________
3. Fruta
1._______________
2._______________
3. Leche deslactosada
1._______________
2._______________
3. Leche descremada

Figura 12. Cálculo del RF en cromatografía.

CUESTIONARIO
1. ¿Qué es el factor de retención en cromatografía?
2. ¿Por qué en una prueba cromatográfica se cargan estándares de carbohidratos?
3. ¿Qué fase móvil y qué revelador propones para poder ver el edulcorante del refresco
light?
96
 97

CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Actividad 3. Cuantificación de lactosa en muestras de leche

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO
2 Matraces volumétrico de 100 mL. 10 mL de Ácido acético glacial. * Leche deslactosada (dos marcas
diferentes)
1 Pipeta volumétrica de 5 y una de 20 mL de solución saturada de * Leche entera (dos marcas
10 mL. acetato de plomo diferentes)
1 Bureta. 20 mL de solución patrón de lactosa.
1 Embudo de filtración. Sulfato de sodio (s)
2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL 3 mL del Reactivo de Fehling A
2 Pipetas graduadas de 5 mL 3 mL del Reactivo de Fehling B
2 Pipetas graduadas de 10 mL Agua destilada
1 Propipeta 1 Potenciómetro
1 Parrilla de calentamiento Soluciones estándar de
potenciómetro
1 Pinzas para bureta Lactosa sólida
1 Soporte universal 5 mL solución acuosa de azul de
metileno al 0.2%
1 Papel filtro whatman # 3 30 mL de solución saturada de sulfato
de sodio
1 Espátula
1 Balanza analítica
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

Patrón de lactosa: Preparar la solución a una concentración de 2 mg/mL. Verificar

que el pH sea alcalino antes de llevarla al volumen final. 100 mL es volumen es
suficiente para 5 equipos.

a) Evaluación del factor de Fehling a partir del patrón de Lactosa.

1. Medir con una pipeta volumétrica 0.5 mL de solucion B y 0.5 mL de solución A y

pasar a un matraz Erlenmeyer de 100 mL.
2. Añadir 10 mL de agua destilada y unas perlas de vidrio.
3. Calentar en parrilla a ebullición y agregar poco a poco, con una bureta la solución
patrón de lactosa (2 mg/mL) hasta la casi reducción del cobre.

97
 98

4. Añadir una gota de solución acuosa de azul de metileno al 0.2% y continuar la

titulación hasta la desaparición del color azul, figura 13.
5. Calcular el factor de Fehling para lactosa de la siguiente forma:

𝐹 = 𝑉 𝑥 2 𝑚𝑔

Donde:

F=Factor de Fehling

V = mL gastados de solución patrón de lactosa

Figura 13. Identificación de azúcares reductores en leche.

b) Cuantificación de Lactosa en muestras de Leche.

NOTA: la mitad del grupo realizará leche deslactosada y la otra mitad leche no
deslactosada.
1. Colocar 20 mL de muestra en un matraz volumétrico de 100 mL con 25 mL de agua.
2. Añadir 6 mL de solución saturada de acetato de plomo, 10 mL de solución acuosa
saturada de sulfato de sodio y 2 mL de ácido acético glacial y mezclar.
3. Dejar reposar por 30 min.
4. Aforar con agua a 100 mL, filtrar y este filtrado colocarlo en una bureta y titular como
en el inciso a.
5. Calcular la concentración de lactosa con la siguiente fórmula:

𝑚𝑔 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎
= (𝐹 ∗ 100)/𝑉
100 𝑚𝐿 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Donde:
98
 99

F= Factor de Fehling

V= mL del filtrado gastados

RESULTADOS
Actividad 3: Cuantificación de Lactosa en muestras de leche
a) Realiza e incluye los cálculos para obtener el factor de Fehling a partir del patrón de
Lactosa.

b) Realiza los cálculos correspondientes, para obtener la concentración de lactosa en

las diferentes muestras de leche. Incluye los resultados en la tabla 38.

Tabla 38. Cuantificación de Lactosa en leches de diferentes marcas

Concentración de lactosa
Muestra
(mg/mL)

CUESTIONARIO
1. ¿Qué métodos se utilizan para la determinación de azúcares reductores además del
método empleado en la práctica?

99
 100

2. De acuerdo con la naturaleza química de los carbohidratos a que clasificación

pertenecen la sacarosa y la lactosa.

CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA
Nelson, D., Cox, M. M. y Lehninger, A. L. (2006) 7.1 Monosacáridos y diacáridos, 7.2
Polisacáridos en Principios de Bioquímica. (4ª Ed., pp. 238-255) Omega.
Nelson, D., Cox, M. M. y Lehninger, A. L. (2006) 7.1 Monosacáridos y diacáridos en
Principios de Bioquímica. (4ª Ed., pp. 238-239) Omega.
Nelson, D., Cox, M. M. y Lehninger, A. L. (2006) 7.1 Monosacáridos y diacáridos en
Principios de Bioquímica. (4ª Ed., pp. 244) Omega.
Gutsche, D., y Pasto, D. (1979) 13.7 Reacciones de oxidación-reducción de los
aldehídos y cetonas en Fundamentos de química orgánica. (1ª Ed., pp. 347-348) Ed.
Reverté, Barcelona, España
Herrera, C., Bolaños, N., y Lutz, G. (2003) Prueba de Benedict en 2.2 Extracción de
almidón en diferentes tejidos vegetales y estudio de algunas de sus propiedades en
Química de alimentos Manual de Laboratorio. (1ª Ed., pp. 12) Ed. De la Universidad
de Costa Rica, San José Costa Rica.
Durst, H., y Gokel, G. (2007) Ensayos de Fehling y Benedict en Química Orgánica
Experimental (1ª impresión digital, pp. 485) Ed. Reverté, España.
Herrera, C., Bolaños, N., y Lutz, G. (2003) 2.1 Identificación de azúcares por
cromatografía de capa fina en II. Carbohidratos en química de Alimentos, Manual de
laboratorio. (1ª Ed., pp. 5) Editorial de la Universidad de Costa Rica, San José, Costa
Rica.
Guarinizo, A., y Martínez, P. (2009) 15-2B Deshidratación de carbohidratos a furfural
e hidroximetilfurfural en Pruebas de características química de carbohidratos en
Experimentos de Química Orgánica con enfoque en ciencias de la vida.(pp. 137) Ed.
Elizcom, Colombia
González, M., Caballero, M., Santisteban, A., Serrano, M. (2003) 1. Reconocimiento
de glúcidos en Bioquímica en 2 Prácticas de Bioquímica, Biología Celular e Histología
(pp.18) Ed. Narcea, Madrid, España
Quesada, S. (2007) Experimento 9. Carbohidratos en Manual de Experimentos de
Laboratorio para Bioquímica (pp. 87-99) Ed. EUNED, San José, Costa Rica.
100
 101

Cano, H., Méndez, S., y Cruz, J. (s.f.) Práctica 10. Carbohidratos del Manual prácticas
de laboratorio de Bioquímica de la Escuela de Química de la Facultad de Ciencias de
la Universidad Industrial de Santander. (Código: MFOQ-BQ.01; Versión: 00; pp. 68-76)

101
 102

PRÁCTICA NO. 5
ANÁLISIS DE LÍPIDOS.

OBJETIVOS: Identificar el grupo de solventes en donde son solubles los lípidos,

ejecutar un método rápido y efectivo para la extracción de colesterol de diferentes
muestras biológicas, visualizar el colesterol y la presencia de otros lípidos mediante la
cromatografía en capa fina, así como identificar la rancidez de algunos aceites
comerciales.

INTRODUCCIÓN
Los lípidos forman un grupo de sustancias de estructura química muy heterogénea,
dividiéndose en lípidos saponificables e insaponificables.
Lípidos saponificables: son los lípidos que contienen ácidos grasos en su molécula y
producen reacciones químicas de saponificación (Ojea-Cárdenas, 2014). Éstos, a su
vez se clasifican en:
Lípidos simples: Son aquellos lípidos que sólo contienen carbono, hidrógeno y
oxígeno. Estos lípidos simples se subdividen a su vez en: Acilglicéridos o grasas
(cuando los acilglicéridos son sólidos se les llama grasas y cuando son líquidos a
temperatura ambiente se llaman aceites) y Céridos o ceras (Ojea-Cárdenas, 2014).
Lípidos complejos: Son los lípidos que además de contener en su molécula carbono,
hidrógeno y oxígeno, también contienen otros elementos como nitrógeno, fósforo,
azufre u otra biomolécula como un glúcido: Fosfolípidos y Glicolípidos (Katz, 2017).
Lípidos insaponificables: Son los lípidos que no poseen ácidos grasos en su
estructura y no producen reacciones de saponificación. Entre los lípidos
insaponificables encontramos a: Terpenos, Esteroides y Prostaglandinas (Ojea-
Cárdenas, 2014).
Los lípidos tienen la particularidad de ser hidrofóbicos y anfipáticos, es decir,
muestran una repulsión al agua, y tienen una parte polar y otra apolar (o no polar),
con lo cual pueden interactuar con sustancias de propiedades dispares. (Katz, 2017).
Los ácidos grasos son moléculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada de
tipo lineal, y con un número par de átomos de carbono. Tienen en un extremo de la
cadena un grupo carboxilo (-COOH) (Ojea-Cárdenas, 2014).
- Saturados sólo tienen enlaces simples entre los átomos de carbono. (figura 14;
Ojea-Cárdenas, 2014).
- Insaturados tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena y sus moléculas
presentan codos, con cambios de dirección en los lugares donde aparece un doble
enlace (figura 14; Ojea-Cárdenas, 2014).
Los lípidos, son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos, tales como
éter, cloroformo, hexano, benceno, acetona y alcoholes. (Katz, 2017). Esta
característica puede ser utilizada para distinguirlos en una muestra, cuando es teñida
102
 103

con el reactivo Sudán III. El compuesto Sudán III, por su baja polaridad, es más soluble
en los lípidos que en el solvente utilizado para su disolución (etanol). Este reactivo
forma puentes de hidrógeno e interacciones con la cadena hidrocarbonada con los
lípidos (Katz, 2017).

Figura 14. Tipos de ácidos grasos.

Es bien conocido que los lípidos están presentes en los aceites comestibles. Se puede
evaluar la calidad de un aceite en base al índice de ácidez. El índice de acidez, indica
la cantidad ácidos grasos libres. Este se define como la cantidad de mg de KOH
necesarios para neutralizar la acidez libre de 1g. de muestra (Rodríguez Arzave, 2016;
Norma NMX-F-101-1987).
La cromatografía de capa fina, se utiliza como un método para identificar lípidos. La
fase móvil consiste en una mezcla de disolventes, más o menos polares, según la
mayor o menor polaridad de los lípidos que se desea separar (Fried, 2003). Los lípidos
con lo Rf más altos, son los lípidos menos polares. Si se hiciera una mención de cómo
se llevaría una separación en una muestra, quedarían de los lípidos menos polares a
los más polares como sigue: Carotenos, Esteroles esterificados, triglicéridos, ácidos
grasos libres, esteroles libres, lípidos polares (Rodríguez,2008).
El revelado de las manchas puede hacerse con vapores de iodo, que tiñen a los lípidos
insaturados de color pardo sobre un fondo amarillento, mientras que la Ninhidrina,
revela solo a los fosfoaminolípidos (Rodríguez, 2008). También es posible detectar
glicolípidos con contenido de ácido siálico, conocidos como gangliósidos. Estos
glicolípidos son detectados mediante una reacción colorimétrica con el reactivo
resorcinol donde se observa un color violeta.

103
 104

DIAGRAMA DE FLUJO

Actividad 1. Análisis de lípidos

a) Solubilidad

b) Índice de acidez

104
 105

Actividad 2: Extracción e identificación del colesterol de diferentes fuentes

biológicas

105
 106

Actividad 3. Identificación de lípidos en cromatografía en capa fina

Fecha: _________________ Hora de inicio:________ Hora de término:_______

Conocimientos:____45 % Habilidades:_____25 % Aptitudes y valores :______30 %

106
 107

PROCEDIMIENTO

Actividad 1. Análisis de lípidos

a) Solubilidad

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL

BIOLÓGICO
6 tubos de ensayo 10 mL Etanol industrial *10 mL Aceite vegetal
1 pizeta 10 mL Cloroformo *6 g Mantequilla
4 pipetas de 5 mL 10 mL Agua destilada
2 pipetas de 10 mL 0.2 g Sudán III
2 vasos de precipitados de 50 mL
1 Parrilla de calentamiento
Baño maría
Papel parafilm
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

1. Etiquetar 3 tubos de ensayo con A para usar con aceite y 3 tubos de ensayo con M
para usar con mantequilla.
2. A los tubos etiquetados con A, adicionar 2 mL de aceite vegetal y a los tubos
etiquetados con M, adicionar 2 mL de mantequilla derretida.
3. Adicionar a un par de tubos (A y M) 2 mL de agua, a otro par de tubos 2 mL de
etanol, a otro par de tubos 2 mL de cloroformo.
4. Agitar fuertemente los tubos y dejar reposar a temperatura ambiente.
5. Observar los tubos, tomar fotos y registrar las observaciones correspondientes.
6. Adicionar una pizca de Sudán III, tapar los tupos con papel parafilm y homogenizar
cuidadosamente por inversión. Dejar reposar por unos 5 minutos aproximadamente
para observar mejor la distribución de los lípidos en los solventes utilizados.
7. Recuperar fotografías para que sean colocadas en la tabla 39.

b) Índice de acidez

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL

BIOLÓGICO
1 Bureta de 25 mL 100 mL Etanol absoluto *15 g Aceite de oliva
1 Pinzas para bureta 5 mL de Fenolftaleína al 1% *15 g Aceite de maíz
en etanol al 75%

107
 108

3 Matraces Erlenmeyer 125 mL 30 mL NaOH 0.01 N *15 g Aceite de ricino

(si es de farmacia usar
0.01 N para valorar)
1 Vasos de precipitado 250 mL *15 g Aceite de linaza
1 Baño maría *15 g Aceite de girasol
1 Barra magnética
1 Soporte universal
Baño maría
1 Parrilla de calentamiento
1 Termómetro
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes . Cada equipo escogerá un material
biológico a utilizar.

1. A 100 mL de etanol, agregar 5 gotas de indicador de fenolftaleína.

2. Colocar en la bureta NaOH 0.01 N, dejar caer gota a gota sobre el etanol hasta que
vire a una color rosa tenue persistente. Cuando esto suceda, se ha generado el alcohol
neutralizado, que está listo para usarse.
3. Pesar de 10 a 15 g de aceite en un matraz Erlenmeyer. Registrar lo pesado en la
tabla 40. Agregar 50 mL de Etanol neutralizado.
4. Introducir el matraz Erlenmeyer en un baño maría a 60°C. Agregar 10 gotas de
disolución de fenolftaleína.
5. Neutralizar la muestra mientras se adiciona NaOH 0.01 N. Suspender la adición
cuando la muestra obtenga un color rosa resistente. Registrar el volumen de NaOH
0.01 N gastado en la tabla 40. Realizar el experimento por duplicado. Compartir la
información con el resto de los equipos. Calcular el índice de acidez.

RESULTADOS

a) Solubilidad. Indica en la tabla 39, si el aceite vegetal utilizado o la mantequilla, es

soluble o no en el solvente propuesto. Incluye las fotografías de los resultados
obtenidos sin y con la tinción del Sudan III.

Tabla 39. Solubilidad de lípidos.

Agua Metanol Cloroformo

Aceite
________

Mantequilla

108
 109

b) Índice de ácidez. Llenar la tabla 40 con los valores experimentales obtenidos.

Calcular el índice de acidez de acuerdo a la fórmula dada, y comparar los valores
experimentales contra los teóricos reportados en la bibliografía, registrando los datos
en la tabla 41.

𝑉 ∗ 𝑁 ∗ 56.1
𝐼𝐴 =
𝑃
Dónde:
V= volumen gastado de NaOH ó KOH (mL)
N= Normalidad de la solución de NaOH ó KOH utilizada (equivalentes/L)
56.1= miliequivalente químico del KOH
P= peso de la muestra problema (g)
NOTA: Como se empleó NaOH en lugar de KOH para efectuar la titulación, se
convenirse el resultado a su equivalente en KOH.

Tabla 40. Registro de los aceites analizados

Muestra Masa (g) Etanol neutralizado

gastado (mL)

1 2 1 2

Aceite de oliva

Aceite de maíz

Aceite de ricino

Aceite de linaza

Aceite de girasol

Tabla 41. Índices de acidez teórico y experimental de aceites.

Muestra IA teórico IA experimental

Aceite de oliva

Aceite de maíz

109
 110

Aceite de ricino

Aceite de linaza

Aceite de girasol

Actividad 2: Extracción e identificación del colesterol de diferentes fuentes

biológicas

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL

BIOLÓGICO
1 vaso de precipitado de 250 mL 10 mL Cloroformo *1 huevo
2 vaso de precipitado de 100 mL 10 mL Metanol *2 g de mantequilla
1 pipeta serológica de 10 mL 10 mL Ácido clorhídrico *2 g de tocino
1 pipeta serológica de 5 mL 2 mL Ácido sulfúrico *2 g de aguacate
concentrado
3 pipeta serológica de 1 mL Hielo *2 g de queso
manchego
1 varilla de vidrio *Hígado de pollo,
cerdo o res fresco
2 tubos cónicos de 50 mL *10 g de cerebro de
res (comprar 1 por
grupo)
1 Centrífuga para tubos cónicos de 50 mL
2 pipetas Pasteur con bulbo
1 espátula delgada
2 tubos de ensayo
1 hielera
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes. Cada equipo escogerá un material
biológico a utilizar.

a) Extracción del colesterol.

1. Recuperar la yema de huevo cruda en un vaso de precipitado de 250 mL, ó puedes
utilizar 2 a 5 gramos de otras fuentes de lípidos.
2. Adicionar 15 mL de una mezcla de cloroformo:metanol:ácido clorhídrico ([Link].05),
y homogenizar cuidadosamente con una varilla de vidrio.
3. Colocar la mezcla en un tubo de cónico de 15 o 50 mL. Centrifugar a 3000 rpm por
10 min.
4. Al término de la centrifugación se obtendrán dos fases: Fase superior ó metanólica,
y la fase inferior ó clorofórmica. Recuperar cada una de las fases en un vaso de
precipitado de 100 mL. El colesterol deberá encontrarse en la fase clorofórmica. Tomar
110
 111

fotos de cada una de las etapas para documentar el proceso de extracción, y colocarlas
en la tabla 42.

b) Identificación del colesterol

1. Medir 1 mL de cada una de las fases recuperadas en la actividad anterior y colocarlo
en un tubo de ensayo. Hacer la prueba con ambas fases para identificar y corroborar
la fase en la que se encuentra el colesterol. Realizar lo mismo con agua destilada
usándola como control negativo. El resto de la muestra conservarla en hielo para
utilizarla en la siguiente actividad.
2. Inclinar el tubo y deslizar por la pared interna un volumen igual de ácido sulfúrico
concentrado, cuidando que los líquidos no se mezclen. Realizar lo mismo con las dos
fases y el agua.
3. Observar la formación de un anillo de color vino en la interfase. Si éste no se forma
inmediatamente, dejar reposar por 1 h o más. Tomar fotografías para que sean
incluidas en la tabla 42.

RESULTADOS:
En la tabla 42, incluye fotografías para documentar las diferentes etapas de la
extracción del colesterol a partir de la muestra biológica asignada. En la misma tabla,
incluye una fotografía en donde se evidencie la reacción química que se llevó a cabo
para la identificación de colesterol.

Tabla 42. Etapas de la extracción de colesterol a partir de ____________

Etapa:_________ Etapa:_________ Etapa:_________ Etapa:_________

Fotografía Fotografía Fotografía Fotografía

Identificación de colesterol en _________

111
 112

Actividad 3. Identificación de lípidos en cromatografía en capa fina

Solución de resorcinol. Pesar 0.2 g de resorcinol y disolver en 10 mL de agua

destilada. Utilizando un baño de hielo, adicionar a esta solución en baño de hielo 80
mL de HCl y 0.25 mL de sulfato de cobre 0.1 M. Almacenar a 4 ºC.

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

1 Espátula 10 mL Cloroformo *1 Hígado de pollo crudo.
1 Mortero 10 mL Metanol *5 g Hígado de res crudo o
cerdo.
1 Pipetas graduadas de 5 mL 5 mL HCl 1N *10 g de cerebro de res
(comprar 1 por grupo)
1 Pipetas graduadas de 10 mL 10 mL Ácido acético
1 Vaso de precipitados de 250 mL Cristales de yodo(s)
1 Regla 3 Cromatofolios de 4x5 cm
5 Tubos de ensaye 16 x 150 mm 5 mL solución de Resorcinol
1 Pinzas de disección 5 mL solución CaCl2 0.02%
*1 cutter 5 mL solución Ninhidrina 1%
*1 Encendedor
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes. Cada equipo escogerá un material
biológico a utilizar.

1. Homogeneizar 2 g de hígado (pollo o res/cerdo) y 2 g de cerebro de res, en un

mortero con 10 mL con una mezcla de cloroformo:metanol:ácido clorhídrico 1N
([Link].1) por 10 minutos.
2. Adicionar 3 mL de HCl 1N y mezclar, centrifugar 2000 rpm por 10 minutos.
3. Descartar la fase metanólica (superior), con el uso de una pipeta Pasteur remover
la fase clorofórmica inferior y transferirla a un tubo de ensaye.
4. Adicionar 0.5 mL de la fase de cloroformo en un tubo de ensaye y agregar 0.5 mL
de cloroformo.
5. Mediante una micropipeta aplicar 4 gotas de la dilución en 3 puntos equidistantes
en una placa de silica gel de 4x5 cm. Realizar una placa para revelar con resorcinol,
yodo y ninhidrina. Cada placa será eluída en sistemas diferentes. Cargar las muestras
que se obtuvieron en la actividad 2.
6. Colocar la placa para revelar con yodo y ninhidrina en vaso de precipitados de 250
mL que contenga como fase móvil el sistema de solventes cloroformo: metanol: ácido
acético:H2O (60:37.5:2.0:0.5).
7. Colocar la placa para revelar resorcinol en un sistema cloroformo: metanol:Cloruro
de calcio 0.02% ([Link] v/v).
8. Una vez que la muestra migró por completo, remover del vaso de precipitado y secar
a temperatura ambiente en la campana de extracción.
112
 113

9. Revelado con yodo: Colocar una placa en un recipiente que contenga cristales de
yodo, tapar y dejarlas hasta observar marchas color marrón-amarillas bien definidas.
El yodo forma complejos moleculares reversibles por adición a los dobles enlaces C=C
de los ácidos grasos componentes de los lípidos, lo cual permite su visualización.
Retirar la placa y marcar con lápiz las manchas observadas ya que el yodo se evapora
y la mancha desaparece.
Revelado con ninhidrina: Aplicar la solución de ninhidrina con un hisopo. Calentar
en la parrilla hasta que aparezca unas bandas de color rojo-violeta indicando la
presencia de grupos amino libres presentes en lípidos como fosfatidiletanolamina y
fosfatidilserina.
Revelado con resorcinol: Aplicar la solución de resorcinol con un hisopo. Calentar
en la parrilla hasta que aparezcan unas bandas de color azul-morado indicando la
presencia de los ácidos siálicos presentes en los gangliósidos.
10. Calcular los Rf para cada banda con la fórmula que se incluye en la figura 15, y
compararlos con los Rf para el sistema de solventes utilizado. Llenar la tabla 43, con
los Rf´s calculados.

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑐𝑚)

𝑅𝑓 =
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙 (𝑐𝑚)

Figura 15. A) Ejemplos de fosfolípidos presentes en la yema de huevo. B) Gangliósidos en

cerebro bovino. 1) Patrón de gangliósidos de cerebro bovino y 2) Extracto crudo de
gangliósidos.

113
 114

RESULTADOS:
1. Numera cada una de las bandas que se revelaron en el cromatofolio. Asigna el
número 1 a la banda que este más cercana a la zona de carga, usando números
sucesivos conforme se van alejando de la misma.
2. Calcular el Rf de cada muestra. Llenar la tabla 43 y 44 con los valores de Rf
calculados de los compuestos separados mediante la cromatografía. Suponer cuales
son los fosfolípidos que se pueden identificar, tomando como referencia la figura 15.

Tabla 43. Rf´s experimentales de las muestras de hígado.

Cromatofolio No de banda Rf’s

(Fase clorofórmica)

Tabla 44. Rf´s experimentales de las muestras de cerebro.

Cromatofolio No de banda Rf’s

(Fase clorofórmica)

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la diferencia química que existe entre un aceite vegetal, una mantequilla y
una margarina? ¿qué relación existe esto con el estado físico de estos productos?

114
 115

2. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua y aceite transcurridos unos minutos de

reposo?¿Distingues algunas diferencias de densidades?
3. ¿Qué tipo de lípidos identifica el resorcinol? Menciona el grupo funcional que los
caracteriza.

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA
Ojea Cárdenas. (2014). Biología celular y humana. ECOE ediciones. Bogota,
Colombia. Pags. 38-47.
Katz, M. (2017). Los lípidos en la industria. Ciudad Autónoma de Buenos Aires.
República Argentina.1 Ed. ISBN: CDD 540.
[Link]
_en_la_industria_quimica/links/5ad76c88aca272fdaf7ed80a/Los-lipidos-en-la-
[Link]?origin=publication_detail
Durazo, E. (2018). Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica. Facultad de
Ciencias Marinas UABC. Págs. 39, 45-46. [Link]
[Link]
Rodríguez Arzave, J. A., Ruiz Loaiza, L., Santoyo Stephano, M. A., Miranda Velásquez
L.G. (2016). Determinación del índice de acidez y acidez total de cinco mayonesas.
Investigación y Desarrollo en Ciencia y Tecnología de Alimentos. Vol. 1, No. 2, 843-
849. [Link]
Fried, B., 2003. Lipids. En: Sherma, J. Fried, B. (eds.), Handbook of Thin-Layer
Chromatography. 3rd edition. Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 826-875.
Rodríguez, J. (2008). Análisis de lípidos de biomembranas. Curso Práctico.
Universidad Nacional de Rosario, Argentina. UNR Editora. ISBN: 978-950-673-663-7.
Norma NMX-f-101-1987. Alimentos. aceites y grasas vegetales o animales.
determinación del índice de acidez. Foods. Vegetables or animals oils and fats. Acidity
index determination. Normas mexicanas. Dirección general de normas.
NMX-f-152-scfi-2011 Alimentos - aceites y grasas vegetales o animales.
Determinación del índice de yodo por el método ciclohexano Método de prueba
(cancela a la nmx-f-152-scfi-2005).
Guarnizo, A., y Martínez, P. (2013) 18. Características de un aceite o grasa en
Experimentos de química orgánica, con enfoque en ciencias de la vida. (pp. 175)

115
 116

Editorial Kindle Tomado de:

[Link]
&hl=es-419&sa=X&ved=0ahUKEwiqtKz4i-
zjAhULbKwKHX6lBtYQ6AEIKDAA#v=onepage&q=indice%20de%20yodo&f=false

116
 117

PRACTICA NO. 6
AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE ADN PLÁSMIDICO

OBJETIVOS: Conocer el fundamento de aislamiento de ADN plasmídico y realizar la

cuantificación del plásmido obtenido a partir de bacterias transformadas.

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de replicarse de

forma autónoma, independientemente del cromosoma. Son muy comunes en bacterias
y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células bacterianas en un número
elevado (hasta 100 copias por célula) (Caballero, 2004). Los plásmidos son una
herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se
pueden usar como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de
interés y de esta forma amplificar lo de forma natural dentro de la bacteria en la que el
plásmido se replica (es lo que se llama “clonar” un fragmento de DNA) Caballero,
2004). Existen muchos plásmidos disponibles para usar con este fin y la mayoría
contienen al menos los siguientes elementos: 1) Un origen de replicación autónomo
para E. coli (ej. ColE1) que permite la replicación autónoma en esta bacteria. 2) Un
gen que confiere a la bacteria portadora del plásmido resistencia a algún antibiótico,
generalmente ampicilina. 3) Un sitio de clonación múltiple en el que se encuentra
dianas únicas para varias enzimas de restricción y que permite la introducción del ADN
a clonar (Carrizosa, 2016).
La cuantificación de ADN se puede estimar con un espectrofotómetro a una longitud
de onda de 260 nm (luz ultravioleta), debido a que las bases púricas y pirimidinas del
ADN absorben la luz a esta longitud de onda. De acuerdo a la Ley de Lambert-Beert,
existe una relación lineal entre la absorbancia y la concentración de la muestra,
siempre y cuando la trayectoria de la luz que recorre la muestra sea de 1 cm. (Mancera,
2020). En la tabla 45, se incluyen las equivalencias que existen entre la absorbancia,
concentración y tipo de ácido nucleico cuantificado.

Tabla 45. Equivalencia entre la concentración y el tipo de ácido nucleico cuantificado.

Absorbancia Concentración (g/ mL) Ácido nucleico

1 50 ADN de doble cadena
1 40 ARN y ADN de cadena simple
1 20 Oligonucleótidos

117
 118

Es muy común que durante el proceso de purificación las muestras de ADN se

contaminen con proteínas, solventes o sales. La espectrofotometría nos permite
identificar la pureza del ADN al establecer la relación de las absorbancias a 230
(compuestos orgánicos: EDTA, TRIzol, derivados de guanidina, sales caotrópicas o
hidratos de carbono) y 280 nm (proteínas y fenol). Por lo tanto, una preparación pura
de ADN debe presentar una relación de A260/280 de 1.8, mientras que para el ARN
puro debe ser aproximadamente de 2 (Mancera, 2020).
Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la
electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan en función de su tamaño. Esta
técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de
agarosa a un campo eléctrico (Sambrook J, 2001). Las moléculas de ADN son atraídas
al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de
sus grupos fosfato (Ausbel FM, 2002). Las moléculas más pequeñas migran más
rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su
desplazamiento (Caballero, 2004). Cuando los fragmentos se han separado, el gel se
sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz
UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se
intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que fluorece cuando
está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que
corresponden a moléculas de ADN (Caballero, 2004).

118
 119

DIAGRAMA DE FLUJO:
Actividad 1: Aislamiento y purificación de plásmido.

Actividad 2: Cuantificación de ADN plasmídico.

119
 120

Actividad 3: Electroforesis de ADN

Fecha: _________________ Hora de inicio:________ Hora de término:_______

Conocimientos:____ 45 % Habilidades:_____25 % Aptitudes y valores :______30 %

120
 121

PROCEDIMIENTO:

Actividad 1: Aislamiento y purificación de plásmido.

MATERIALES REACTIVOS Y SOLUCIONES MATERIAL BIOLÓGICO

Micropipeta de: 1 mL Solución de glucosa fría Bacterias E. coli Match one

0.5-10 L (Glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, que contienen el plásmido
100-1000 L Tris 25 mM) TOPO 3.3 con el gen
SLC35A1.
Puntas de: 1 mL SDS 10%
0.5-10 L estéril
100-1000 L estéril
Microtubos de 1.5 mL estéril 1 mL NaOH 10 N
Gradilla para tubos de 1 mL Solución de acetato de
ensaye potasio fría (60 mL Acetato de
potasio 5M, 11.5 mL ácido acético,
28.5 mL agua destilada, ajustar
pH 4.8).
1 Microcentrífuga 1 mL Etanol absoluto frío
1 Asa bacteriológica 1 mL Etanol al 70% frío (preparar
a partir del absoluto)
1 Mechero fisher 1 mL agua milli Q estéril con 20
g/mL de RNAsa
1 Incubadora con agitación 2 tubos con 3 mL de medio LB con
ampicilina (100 g/mL)
1 Espectrofotómetro
1 Celda de 1 mL
1 Pizeta
1 Vaso de precipitado de 250
mL
Gradilla para microtubos
1 hielera
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: Se requiere 1 Caja Petri con medio LB con ampicilina (100 g/mL).

a) Cultivo de la bacteria E. coli Match one.

1. Estriar una caja de Petri con medio LB sólido con Ampicilina a una concentración
final de 100 g/mL con bacterias E. coli Match one que contienen el plásmido TOPO
3.3 con el gen SLC35A1 (figura 16). Dejar crecer por 12 h a 37°C. Una vez crecida
almacenar a 4°C hasta su uso.

121
 122

2. Picar una colonia de bacterias previamente sembradas e inocular 3 mL de medio LB

líquido con Ampicilina a una concentración final de 100 g/mL. Incubar a 37 ºC a 200
rpm durante 12 h.

Figura 16. Plásmido TOPO 3.3 con el gen SLC35A1

b) Purificación de plásmido por lisis alcalina

1. Recuperar lo crecido en un microtubo de 1.5 mL. Centrifugar de 1 mL en 1 mL a
11000 rpm.
2. Eliminar el sobrenadante con una punta de micropipeta asegurando que el botón de
células quede lo más libre posible de éste. Colocar el sobrenadante en un vaso con
cloro al 10% para inactivar las bacterias remanentes.
3. Adicionar 150 L de solución de glucosa fría (Glucosa 50 mM, EDTA 10 mM y Tris
25 mM) e incubar 5 min a temperatura ambiente. Nota: Mantener la solución de glucosa
en hielo.
4. Adicionar 150 L de solución de lisis recién preparada (4.4 mL agua destilada, 0.5
mL SDS 10%, 0.1 mL NaOH 10 N), mezclar por inversión 3 veces e incubar a
temperatura ambiente por 5 min.
5. Adicionar 150 L de la solución de acetato de potasio fría (60 mL cetato de potasio
5M, 11.5 mL cido acético, 28.5 mL gua destilada, ajustar pH 4.8). Mezclar por inversión
durante 10 segundos e incubar 5 min a temperatura ambiente.
6. Centrifugar durante 5 min a 12000 rpm.
122
 123

7. Recuperar el sobrenadante en un microtubo de 1.5 mL limpio con cuidado, sin

llevarse residuos.
8. Adicionar 1 mL de etanol absoluto frio. Mezclar por inversión e incubar 2 min a
temperatura ambiente.
9. Centrifugar 5 min a 11000 rpm
10. Eliminar el sobrenadante por aspiración con la punta de la pipeta.
11. Adicionar 1 mL de etanol absoluto al 70 % y resuspender el botón por inversión.
12. Centrifugar 5 min a 11000 rpm. Eliminar el etanol por aspiración con la punta de
la pipeta asegurándose que no queden gotas de alcohol. Dejar evaporar por 5 minutos
a temperatura ambiente.
13. Resuspender el botón en 30 L de agua milli Q tratada con 20 g/mL de RNAsa.
14. Incubar 15 min a 37ºC.

RESULTADOS:
En la tabla 46, las fotos más representativas del cultivo de las bacterias y del proceso
de purificación de ADN por lisis alcalina.

Tabla 45. Cultivo y purificación de ADN plasmídico por lisis alcalina.

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

123
 124

Actividad 2. Cuantificación de ADN plasmídico.

MATERIALES REACTIVOS MATERIAL
BIOLÓGICO
Micropipeta de: 5 mL de agua destilada 30 L de plásmido TOPO
0.5-10 L estéril ó agua inyectable. 3.3 con el gen SLC35A1
100-1000 L purificado en la actividad
1.
Puntas de:
0.5-10 L estéril
100-1000 L estéril
Microtubos de 1.5 mL estéril
1 Vaso de precipitado de 250 mL
Celda de plástico de 100 ó 1000 L
Espectrofotómetro
Gradilla para microtubos
1 hielera
1 Pizeta
*Papel secante
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

1. En un microtubo estéril, preparar 1 mL de una dilución 1/100 en agua destilada

estéril.
2. Colocar en una celda de plástico 100 L agua destilada estéril que se utilizará como
solución blanco.
3. Medir en el espectrofotómetro la densidad óptica (D.O) a 260 nm y a 280 nm.
Registrar los valores en la tabla 47.
4. Lavar la celda con agua destilada y secar con papel toalla.
5. Colocar la dilución de ADN en la misma celda y repetir los pasos 3 y 4.
6. Calcular la concentración de ADN de cada muestra.
Nota: La lectura a 260 nm permitirá calcular la concentración de ácidos nucleicos en
la muestra, revisar la tabla 45 donde se muestran las equivalencias a 260 nm.

RESULTADOS:
Calcula la concentración y pureza del ADN del plásmido. Incluye los cálculos.

124
 125

Tabla 46. Cuantificación de ADN plasmídico

Muestra D.O. 260 nm D.O. 280 nm Concentración Pureza
(g/L)

CUESTIONARIO:
1. Describe que datos te proporcionan la pureza del ADN plásmido.

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

Actividad 3: Electroforesis de ADN

MATERIALES REACTIVOS
10 microtubos de 1.5 mL 0.5 L Amortiguador TAE 1X
Micropipeta de: 6 L Marcador de peso molecular Thermo
0.5-10 uL Scientific GeneRuler 1 kb DNA Ladder
100-1000 uL #SM0311
Puntas de: 0.1 mL Bromuro de etidio 1mg/mL o
0.5-10 uL estéril SyBerGreen
100-1000 uL estéril

Pesa filtro Hielo

1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 0.5 g Agarosa

Probeta de 50 mL 100 uL 6X Mass ruler loading dye solution DNA
(Buffer de carga)
Guantes
Espátula
Balanza analítica
Mechero Fisher o horno de microondas
Cámara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Transiluminador UV.
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.

125
 126

SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE ADN

TAE 1X: Tris base 39 mM, Ácido acético glacial 18 mM, EDTA 10 mM
6X Mass ruler loading dye solution DNA: 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 0.03% Bromophenol
blue, 60% Glicerol, 60 mM EDTA.

1. Preparar 50 mL de agarosa al 1% en Buffer TAE 1X. Colocar la agarosa pesada en

el matraz Erlenmeyer de 125 mL. Adicionar el Buffer TAE 1X, y solubilizar la agarosa
por calentamiento en el horno de microondas con homogenización esporádica.
2. Adicionar 3 L el bromuro de etidio mezclando cuidadosamente ó preguntar a tu
profesor si se usará SyBrGreen.
3. Cuando la solución ya se encuentra tibia, vaciarla sobre el molde del gel que ya
debe contener el peine. Dejar que se polimerice por 15-20 min (el gel debe verse
opaco).
4. Calcular el volumen de buffer 6X Mass ruler loading dye solution DNA, que se le
debe adicionar a la muestra, para que esta quede a una concentración final de 1X.
Preparar la muestra.
5. Colocar el molde que contiene el gel en la cámara de electroforesis. Verter el buffer
TAE 1X en la cámara, hasta que este cubra el gel.
6. Colocar en el primer pozo, 4 L de marcador de peso molecular, y en el segundo
pozo, el plásmido.
7. Migrar el gel a 90 V por aproximadamente 35 min.
8. Revelar el gel exponiéndolo en un transiluminador UV y obtener una foto de buena
calidad.

RESULTADOS
Incluye la foto del gel. Diseña un mapa en donde se indica el orden en el que fueron
cargadas las muestras en el gel. Indicar el nombre del marcador de peso molecular
utilizado. Incluye los correspondientes pesos moleculares de las bandas más
representativas del marcador de peso molecular. Indica el tamaño del plásmido en pb
y analiza cuidadosamente el tamaño de la(s) banda(s) recuperadas. Registra los
resultados en la tabla 48.

126
 127

Tabla 47. Mapa de carga de las muestras extraídas por equipo

Gel de electroforesis Mapa de carga
No. Pozo Muestra
1

CUESTIONARIO
1. ¿De qué tamaño esperas la banda de ADN recuperada?
2. ¿Hay alguna diferencia en tamaño con el ADN que se recuperó en los otros equipos?
Si lo hay, ¿a qué se debe esta diferencia?

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

127
 128

BIBLIOGRAFÍA

Caballero Repullo, Moyano, E., Muñoz, J. (2004). Purificación de ADN plasmídico y

electroforesis del mismo en gel de agarosa. [Link]
mol/[Link]
Carrizosa, C., Chavira J. M., Hernández L., Torres, F. (2016). Aislamiento y ensayos
de restricción de plásmidos. Universidad Autónoma de México.
Matzumuara, D, González, L., Lopez, A. y Espino, N. (2013). Manual de Prácticas de
Laboratorio: Técnicas Básicas de Biología Molecular. Universidad Autónoma
Metropolitana Unidad Iztapalapa.
Sambrook J, Russell DW (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3ª ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Ausbel FM (Editor). (2002). Short Protocols in Molecular Biology. A compendium of
methods from Cur Short - rent Protocols in Molecular Biology. 2nd Edition. John Wiley
& Sons, NY, U SA.
Mancera P. 2020. Cuantificación de ácidos nucleicos mediante diferentes técnicas.
Institut de Recerca. tomado de: [Link]
06/[Link]

128
 129

129
 130

PRÁCTICA NO. 7
METABOLISMO CELULAR

OBJETIVOS:
-Observar las actividades reguladoras del pulmón y riñón en individuos que han consumido
altas dosis de bicarbonato mediante la medición del pH en orina durante el reposo o ejercicio
intenso.
- Relacionar el efecto del cianuro sobre la cadena respiratorio en cultivo bacteriano.
- Relacionar el consumo de glucosa con el cambio de pH producido por las levaduras.
- Describir las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH.
- Interpretar el efecto de los inhibidores y desacoplantes sobre la salida de protones.

INTRODUCCIÓN:
El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas catalizadas enzimáticamente y
llevadas a cabo en la célula, con la intención de cumplir cuatro objetivos
principalmente:
[Link] energía de los nutrientes presentes en los alimentos consumidos durante el
día,
2. Transformar las moléculas de los nutrientes en unidades constitutivas o precursores
de las estructuras celulares.
3. Construir de novo, todas las macromoléculas necesarias para finalmente general
estructuras celulares.
4. Realizar de manera continua la síntesis y degradación de biomoléculas con
funciones especializadas, siempre para la viabilidad y el mantenimiento celular (Teijón
R., J. M., et., al., 2006).
En base a esto, se han propuesto actividades cortas que nos permitirán identificar
algunos de los procesos metabólicos que se llevan a nivel celular. Estos procesos
tienen como producto final la generación de ácidos y como consecuencia la liberación
de protones. Estos ácidos se producen mediante una reacción de oxidación de
carbohidratos o lípidos dando lugar al ácido carbónico (H2CO3). Pero también por otras
vías se producen compuestos orgánicos que son capaces de aceptar los protones,
dándose así el equilibrio ácido-base en los líquidos corporales (Saíns, 2006).
El equilibrio ácido-base en el organismo se lleva a cabo:
*Soluciones amortiguadoras intra y extracelulares
*Compensación respiratoria.
*Eliminación a través de la vía renal del exceso de ácidos.
El pH de los líquidos extracelulares deben encontrarse entre 7.35-7.45. En el
metabolismos se presentan las acidosis o alcalosis metabólica, que consisten en la
disminución o en el aumento del pH, respectivamente. Estos cambios de pH pueden
130
 131

ser alterados por un incremento de la presión de CO 2 en sangre o el consumo de

bicarbonato (Saíns, 2006).
El organismo es capaz de regular o ajustar las alteraciones de pH, mediante los
mecanismos de compensación:
*Amortiguamiento plasmático, usando el bicarbonato como amortiguador.
*Ventilación a través de los pulmones,
*Eliminando los compuestos que modifica el pH por la vía renal (Saíns, 2006).

Por otro lado, la fosforilación oxidativa es la transferencia de electrones de los

equivalentes reducidos NADH, NADPH, FADH, obtenidos en la glucólisis y en el ciclo
de Krebs hasta el oxígeno molecular, acoplado con la síntesis de ATP. Este proceso
metabólico está formado por un conjunto de enzimas complejas, ubicadas en la
membrana interna de las mitocondrias, que catalizan varias reacciones de óxido-
reducción, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones y donde se forma
finalmente agua (figura 17; Cardella-Hernández 2019).

Figura 17. Metabolismo de la glucosa para la síntesis de ATP.

La fosforilación oxidativa es un proceso bioquímico que ocurre en las células. Es el

proceso metabólico final (catabolismo) de la respiración celular, tras la glicólisis y el
ciclo del ácido cítrico. De una molécula de glucosa se obtienen 36 moléculas de ATP
mediante la fosforilación oxidativa (López-Riojas, 2016).
Dentro de las células, la fosforilación oxidativa se produce en las membranas
biológicas. En procariotas es la membrana plasmática y en eucariotas es la membrana
interna de las dos de que consta la mitocondrial. El NADH y FADH2, moléculas
donadores de electrones que "fueron cargadas" durante el ciclo del ácido cítrico, se
utilizan en un mecanismo intrincado (que implica a numerosas enzimas como la
NADH-Q reductasa, la citocromo c oxidasa y la citocromo reductasa), gracias a la

131
 132

bomba H+ que moviliza los protones contra un gradiente de membrana (Cardella-

Hernández 2019).
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen
por gemación. En común con otras células eucariontes, las levaduras tienen un núcleo
en donde reside la información genética de la célula, mitocondrias en donde se lleva a
cabo la síntesis de ATP y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encarga
de la síntesis de proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el
exterior (Cañas, A. 2015).
A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla
la hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Esta proteína
es semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na+/K+
de las células animales y, al igual que la bomba de sodio/potasio, se inhibe con
concentraciones micromolares de vanadato (Cañas, A. 2015). Como resultado de la
actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente electroquímico
de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la
célula, proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o
uniportadores. Para darse una idea de la importancia de esta enzima en la economía
celular y en la energización de la membrana celular, basta decir que la ATPasa de H+
consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula (Peña, 1975).
Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen otra
bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que
se encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana
plasmática, el flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP
(Peña, 1975). Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina.
Así, se puede proponer uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la
levadura: por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP
sintasa, y a nivel de la membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para
bombear protones al exterior de la célula. El factor común en ambos casos es un flujo
de protones a través de la membrana. Por lo tanto si las levaduras consumen glucosa,
se observará una disminución progresiva de su concentración en el medio de cultivo
con el tiempo y cambios en el pH extracelular (Cañas, A. 2015).

132
 133

DIAGRAMA DE FLUJO:
Actividad 1: Mantenimiento del equilibrio acido-base del tampón bicarbonato.

Actividad 2: Actividad del tampón bicarbonato en el metabolismo durante el

ejercicio.

133
 134

Actividad 3: Análisis de la cadena transportadora de electrones y la fosforilación

oxidativa en E. coli.

Actividad 4. Efecto de los inhbidores y desacoplantes de la cadena

transportadora de electrones en levadura de panificación.

Fecha: _________________ Hora de inicio:________ Hora de término:_______

Conocimientos:____45 % Habilidades:_____25 % Aptitudes y valores :_____30 %

134
 135

PROCEDIMIENTO:
Actividad 1: Comportamiento del equilibrio acido-base durante el consumo de
bicarbonato en reposo.
MATERIALES REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO
1 Balanza analítica *10 g Bicarbonato de sodio *500 mL Agua natural para
(Para consumo humano) beber medido en una botella
limpia
1 Vaso de precipitado de 250 Solución estándar pH 4
mL
1 Potenciómetro Solución estándar pH 7
*4 Frascos para toma de orina Solución estándar pH 10
1 pizeta
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

Un alumno desayunará normalmente sin ingerir jugos ácidos:

1. Tomar 250 mL de agua 1 h antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar
esa orina.
2. Tomar 250 mL de agua al iniciar la clase.
3. Después de 30-60 minutos, orinar en un frasco para toma de orina. Medir el pH de
la orina y considerar este dato como el tiempo 0 (t0).
4. Ingerir 250 mL de agua con 7.5 g de bicarbonato de sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15 min, hasta tener por lo menos 5 muestras.
6. A cada muestra se le medirá el pH inmediatamente después de haber sido obtenida,
ya que con el tiempo el CO2 se resorbe. Registre el valor del pH en la tabla 49.
7. Decantar la orina en el sanitario, enjuagar el recipiente y reutilizarlo para la siguiente
muestra.
8. El control negativo será un estudiante que solo tome agua, en los mismos tiempos
que el alumno que consuma el bicarbonato. Los alumnos que participen no deben
tomar medicamentos, ni hacer ejercicio con frecuencia, ni estar menstruando.

RESULTADOS:

Tabla 48. Valores de pH de orina de estudiantes que se han mantenido en reposo.

Tiempo (min) 0 15 30 45 60
Estudiante pH
Bicarbonato
Sin bicarbonato

135
 136

1. Realiza un par de gráficas en donde se muestre cada una de las muestras de orina,
pH (eje y) contra tiempo (eje x).

2. Compara los resultados de las personas que tomaron bicarbonato vs los que
tomaron solo agua.

CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué es importante mantener el pH del organismo dentro de cierto rango?
2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H+ en el organismo?

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

Actividad 2: Comportamiento del equilibrio acido-base durante el consumo de

bicarbonato después de llevar a cabo ejercicio intenso.
MATERIALES REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO
1 Balanza analítica *10 gBicarbonato de sodio *500 mL Agua natural para
(Para consumo humano) beber medido en una botella
limpia
1 Vaso de precipitado de 250 Solución estándar pH 4 Orina
mL
1 Potenciómetro Solución estándar pH 7
*4 Frascos para toma de orina Solución estándar pH 10
1 pizeta
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

Un alumno desayunará normalmente sin ingerir jugos ácidos:

136
 137

1. Tomar 250 mL de agua 1 h antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar

esa orina.
2. Tomar 250 mL de agua al iniciar de la clase.
3. Después de 30-60 minutos, orinar en un frasco para toma de orina. Medir el pH de
la orina, considerar este dato como el tiempo 0 (t0).
4. Ingerir 250 mL de agua con 7.5 g de bicarbonato de sodio.
5. Realizar ejercicio muscular intenso, como correr varias vueltas en el circuito hasta
que se perciba sudoración intensa.
6. Obtener muestras de orina cada 15 min, mide el volumen de la misma, hasta tener
por lo menos 5 muestras.
7. A cada muestra se le medirá el pH inmediatamente después de haber sido obtenida,
ya que con el tiempo el CO2 se resorbe. Registre el valor del pH en la tabla 50.
8. Decantar la orina en el sanitario, enjuagar el recipiente y reutilizarlo para la siguiente
muestra.
9. El control negativo será un estudiante que solo tome agua, en los mismos tiempos
que el alumno que consuma el bicarbonato y que haga el mismo esfuerzo que el
alumno del estudio. Los alumnos que participen en esta actividad, me deben tener
problemas de presión arterial o del corazón, no deben tomar medicamentos, ni hacer
ejercicio con frecuencia, ni estar menstruando.

RESULTADOS:

Tabla [Link] de pH de orina de estudiantes que realizaron ejercicio intenso.

Tiempo (min) 0 15 30 45 60
Estudiante pH
Bicarbonato
Sin bicarbonato

1. Realiza un par de gráficas en donde se muestre cada una de las muestras de orina,
pH (eje y) contra tiempo (eje x).

137
 138

2. Compara los resultados de las personas que tomaron bicarbonato vs los que
tomaron solo agua.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son los sistemas reguladores que mantienen el amortiguamiento del pH
sanguíneo?
2. ¿Cómo participa el aparato respiratorio y el riñón en el control del pH sanguíneo?

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

Actividad 3: Análisis de la cadena transportadora de electrones y la fosforilación

oxidativa en E. coli.
Actividad previa: Preparar un inóculo 12 h previo a la práctica como se indica: Colocar
5 mL de medio LB en un tubo de 50 mL estéril, picar una colonia de bacterias DH5
previamente reactivadas en medio LB sólido. Incubar a 37°C a una velocidad de 200
rpm. Colocar 3 tubos de inóculo por equipo.

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

2 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 4 Tubos de centrífuga de E. coli DH5  previamente
50 mL con 5 mL de medio reactivadas en medio LB
LB sólido.
2 Pipetas serológicas de 5 mL 4 Matraces Erlenmeyer de
estériles 125 mL con 20 mL de
medio LB estéril.
3 tubos de centrífuga de 50 mL 2 mL de KCN 0.5%
estéril
1 Espectrofotómetro 2 mL Agua destilada
estéril.
2 Celdas para espectrofotómetro
de 1 mL
1 Pizeta
1 Potenciómetro
1 Mechero Fisher
1 Probeta de 50 mL
1 Crónometro
1 Caja de puntas azules estériles
1 Micropipeta de 100-1000 L
1 Incubadora con agitación orbital
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

138
 139

1. Tomar dos matraces Erlenmeyer de 125 mL que deben contener 20 mL de medio

LB estéril.
2. Adicionar 4 mL de bacterias crecidas en medio LB durante toda la noche.
3. A uno de los matraces adicionar 1.5 mL de KCN 0.5% y al otro 1.5 mL de agua.
4. Tomar 1 mL del cultivo, colocarlos en una celda de 1 mL para espectrofotómetro.
Leer a 585 nm.
5. Incubar ambos matraces a 37°C a una velocidad de 200 rpm.
6. Medir la absorbancia de los matraces cada hora a una longitud de onda de 585 nm.
Utilizar medio LB como blanco. Registrar los datos en la tabla 51.

RESULTADOS:
1. Calcula la concentración celular del cultivo si se sabe que 1 D.O. corresponde a
1.2x109 ufc/mL.
4. Realiza una gráfica en donde muestres en el eje y la concentración celular y en el
eje x el tiempo.

Tabla 50. Cinética de crecimiento de bacteria de E coli, con y sin KCN.

Tiempo (h) Acont AKCN Células/mlcont Células/mlKCN

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III?
2. Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis de ATP.
3. ¿Cómo fue el comportamiento de los cultivos con y sin KCN? Explica por qué aun
agregando el KCN, las bacterias pueden seguir creciendo.

139
 140

CONCLUSIONES:
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____________________________________________________________________
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Actividad 4: Efecto de los inhibidores y desacoplantes de la cadena

transportadora de electrones en levadura de panificación.
MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS
4 Vasos de precipitado de 250 mL *Levadura de panificación
1 Agitador de vidrio 15 mL Solución de glucosa al 10%
1 Pipeta serológica de 5 mL 1 mL Solución de 2-4 dinitrofenol 0.04 M en etanol (Se
puede utilizar termogenina)
1 Micropipeta de 1000 uL 1 mL Solución de azida de sodio 0.4 M
1 Caja de puntas azules
1 Potenciómetro
1 Cronómetro
NOTA1: El material, equipo y reactivos solicitados en la tabla son por equipo.
NOTA2: *El material biológico debe ser aportado por los estudiantes.

Para analizar el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la cadena

respiratoria en la levadura de pan, prepara una suspensión de levadura en agua a una
concentración de 200 mg/mL. Con esta suspensión se prepararán 3 vasos de
precipitados según las condiciones que se mencionan a continuación.

Experimento control:
1. Diluye 5 mL de la levadura en 40 mL de agua destilada.
2. Determina el pH de la solución y repite la medición 2 veces más con intervalos de 3
min para obtener la línea basal. Registrar el valor de pH en la tabla 52.
3. Adicionar 5 mL de glucosa a 10%, agitar y medir el pH. Registrar el valor de pH en
la tabla 52.
4. Determinar el pH de la solución cada 5 min 4 veces, y luego cada 10 min 2 veces
más. Registrar el valor de pH en la tabla 52.

Experimento dinitrofenol:
1. Diluir 5 mL de la levadura en 40 mL de agua destilada.
2. Añadir 0.2 mL de la solución de dinitrofenol 0.04 mM. Agitar cuidadosamente.
3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición 2 veces más con intervalos de
3 min para obtener la línea basal. Registrar el valor de pH en la tabla 52.
4. Esperar 5 min.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control. 140
 141

Experimento azida de sodio:

1. Diluir 5 mL de la levadura en 40 mL de agua destilada.
2. Añadir 0.5 mL de la solución de azida de sodio 0.4 M. Agitar cuidadosamente.
3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición 2 veces más con intervalos de
3 min para obtener la línea basal. Registrar el valor de pH en la tabla 52.
4. Esperar 5 min.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

RESULTADOS:
1. Realizar gráficas de cada uno de los experimentos realizados en donde se muestre
el pH vs el tiempo.
2. Analizar los cambios de pH del experimento control con respecto a los compuestos:
dinitrofenol y azida de sodio. Identifica el compuesto que funciona como desacoplante
y el compuesto que funciona como inhibidor.
3. Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en cuenta que
las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se
encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana
plasmática cuya función es similar a la bomba de Na+/K+ en las células de los
mamíferos.

Tabla [Link] de pH en el medio posterior a la adición de glucosa.

Tiempo pH
(min)

Glucosa Dinitrofenol Azida de

sodio

Adicionar 5 mL de glucosa

6.5

11.5

141
 142

16.5

21.5

26.5

36.5

46.5

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la fuentes de carbono de las levaduras?
2. ¿En qué consiste la glucólisis y la fosforilación oxidativa?
3. ¿Cuáles son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las
levaduras?

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA.
Cardella-Hernández (2019). Bioquímica Médica. Metabolismo intermediario y su
regulación. Tomo III. Págs 662-668.
[Link]
Garrido Pertierra, A., Teijón Rivera, J. M., (2006) Fundamentos de bioquímica
metabólica. Editorial Tébar, S.L.,3ª ed. ISBN digital: 978-84-7360-459-8
López-Riojas, B. Pérez-Flores, F., Montes-Quiroz, A., Vidales-Paz, J.,
Sanchez-Herrera, L., Bernal-Pérez, J., Bautista-Rosales, P., Zepeda-Carrillo, E.
(2016). Guía de Bioquímica Metabólica. Ecorfan. Universidad Autónoma de Nayarit.
ISBN 978-607-8324-62-0. Pág. 9.
Cañas, A. (2015). Estudio del bombeo de protones por levaduras. Manual de prácticas
de laboratorio. Bioquímica. Facultad de Medicina. UNAM.
[Link]
Peña A. (1975). Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch Biochem
Biophys. 167(2):397

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