TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
Instituto Tecnológico de Tehuacán
MICROBIOLOGÍA
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
EQUIPO 6
PRÁCTICA No. 9
TINCIÓN SIMPLE Y DIFERENCIAL
(TINCIÓN GRAM)
PRESENTAN:
PACHECO FLORES ARELY 20360438
ORTIZ MARTINEZ AIDEE JACQUELINE 20360609
MARROQUÍN REMIGIO ALEJANDRA 19361430
MONFIL CANSECO JULIO LIZANDRO 20360424
CASTRO VILLEGAS JAIR 20360348
ASESORA:
ING. ROSA MARÍA ZAVALETA MARTÍNEZ
ENERO – JUNIO
TEHUACÁN, PUEBLA, MARZO DEL 2023
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Instituto Tecnológico de Tehuacán
Objetivo
Comprender el fundamento de la tinción de Gram.
Fundamento teórico
Para poder observar las características morfológicas de las bacterias, se
utilizan las preparaciones fijas y teñidas, debido a que estas permiten que las
células se visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar las distintas
especies por su coloración. La tinción es el proceso por el cual las moléculas de
un colorante se adsorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar
el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en
microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan
contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden
observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a la reacción
que ocurre, existen diferentes tipos de tinción;
Tinción simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología
celular.
Tinción diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias
entre células bacterianas o entre partes de una misma célula.
Estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción. Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-
Neelsen, etc Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal violeta,
safranina, son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares
cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacaridos ácidos
(las envueltas externas de los microorganismos están por lo general cargadas
negativamente).
La Tinción de Gram se denominada así por el bacteriólogo danés Christian
Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de
Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que
ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos
distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de
forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y
forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la
pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de
peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la
pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-
negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la
célula gram-negativa es peptidoglicano.
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Materiales
5 Porta objetos
5 Cubre objetos
Asa bacteriológica
Mechero Fisher
Frascos goteros pequeños
Encendedor
Agua inyectable (1 ámpula)
Torundas con alcohol
Reactivos tinción de Gram
Aceite de inmersión
Microscopio óptico
Puente de tinción
Piseta con aoogua destilada
REACTIVOS
Lugol
Azul violeta
Acetato
Zaframina
Fucsina básica
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Metodología
Preparación de un frotis bacteriano para tinción
1. Antes de comenzar con nuestra práctica lavamos muy bien nuestra área de trabajo al igual
que nuestras manaos para así sacar nuestros material y pedir nuestros cubre y porta objetos
para poder lavarnos bien y dejarlos secar
Cultivo Sólido
1. Colocamos una pequeña gota de solución salina fisiológica con el asa de siembra sobre un
portaobjetos limpio y seco.
2. Con el asa de siembra flameada transferir una pequeña cantidad de colonia a la gota
resuspendiendolas por frotamiento, está no se debe de quedar bien homogénea y extendimos
circularmente la gota por el portaobjetos, está no debe de quedar conglomerada.
3. Después de eso dejar que se seque completamente para así con ayuda de unas pinzas que
en nuestro caso no las utilizamos pasamos dos o tres veces durante un segundo el porta
objetos con la cara del frotis hacia arriba por la parte baja de la flama del mechero. Dejar
enfriar el portaobjetos entre los pases, para evitar que se queme la muestra.
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Tinción Simple
1. Preparamos y fijamos nuestro frotis procedente del cultivo o muestra que se requiere
analizar.
2. Colocamos el puente de tinción sobre el fregadero y colocamos el frotis sobre el puente de
tinción, cubrimos completamente el frotis con colorante fucsina básica y dejamos actuar
durante 1-2 minutos.
3. Lavamos con agua destilada para quitare el exceso de colorante. Dejar secar al aire.
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4. Ya que se secó ahora si podemos observarla por el microscopio
Tinción de Gram
1.- Preparar y fijar un frotis procedente del cultivo o muestra que se requiere analizar. (pasos
1-3).
2.-Cubrir con solución de cristal violeta durante un minuto, posteriormente escurrir el colorante
y lavar el frotis con agua destilada.
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4.- Aplicar lugol durante un minuto, se escurre y
lava con agua destilada.
5. Decolorar con la mezcla alcohol-acetona (5 a 15 segundos), hasta que ya no escurra líquido
azul. escurrir y lavar con agua destilada.
6. Cubrir con solución de safranina durante 0,5 -1 minuto escurrir y se lavar con agua destilada.
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7. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Cuestionario
1.- Realice un cuadro donde incluya los colorantes y reactivos utilizados en la
tinción de Gram y su acción sobre la célula bacteriana.
Tinción de Gram
Gram Pasos Gram -
+
blanco Fijació blanco
n
Violeta Cristal violeta
violeta
Violeta Morde violeta
nte: Lugol
violeta Decolo blanco
ración:
alcohol/a
cetona
violeta Colora rojo
nte de
contraste:
safranina
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2.- ¿Cómo se pueden teñir las endosporas, capsulas y flagelos
bacterianos? ¿Qué tipo de tinciones son?
Para la tinción de capsulas, estas se pueden teñir con un Tinte primario, el
cual es el Cristal Violeta 1% en el que se tiñe todo el frotis color oscuro, después
se le agrega Decolorante y Contratinte, el cual es el Sulfato de Cobre 20%, este
se usa para enjuagar el tinte primario.
Para la tinción de endosporas, se utiliza un tinte primario, el cual es el Verde
Malaquita, este requiere calor para la penetración de este tinte, para el agente
decolorante se utiliza agua, el cual remueve el exceso de tinte y decolora la célula
vegetativa, para el Contratinte, se utiliza Safranina, la cual tiñe las células
vegetativas.
Para la tinción de los flagelos, se utiliza Ácido tánico (agente mordante:
engruesa los flagelos) y Rosalina (colorante que los define).
Todas estas, son un tipo de tinciones específicas.
3.- ¿Qué pasaría si no se esteriliza el asa antes de tomar la muestra?
Se contaminaría nuestro medio de cultivo con otros microorganismos no
deseados.
4.- ¿Qué pasaría si se realiza una tinción de Gram a un cultivo de 48 horas?
Fundamente la respuesta.
Primero decir que las bacterias deben de ser jóvenes, (12 a 18 h) con células
en fase exponencial de crecimiento, ya que si están son de un tiempo mas
elevado, las bacterias Gram + darían un resultado irregular
5.- Investigar lo colorantes empleados para la tinción Ziehl-Neelsen y tinción
especial.
Para los colorantes de la tinción Ziehl-Neelsen, se utiliza Fucsina, para la
decoloración, se utiliza alcohol o HCl y azul de metileno para el color de contraste.
Para la tinción especial, en el caso de capsulas, se utiliza el Cristal Violeta,
después se le agrega Decolorante y Contratinte, el cual es el Sulfato de Cobre
20%.
Para la tinción de endosporas, el colorante es el Verde Malaquita.
Para la tinción de flagelos, el colorante a utilizar, es el ácido tánico.
Sanz Cervera, prácticas de microbiología, Universidad de la Rioja.
Tinción de microorganismos:
https://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio4.pdf
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Conclusión
La tinción de Gram es utilizada para detectar una bacteria específicamente
patógena, es decir, que por eso se clasifican en Gram positiva o Gram negativa,
por supuesto lleva mas proceso que una tinción simple, ya que esta se logra
poniendo sobre la muestra fucsina o cristal violeta se logra, pero con este otro
tipo de tinción primero se usa el cristal violeta, posteriormente lugol, luego
alcohol-acetona y por ultimo Safranina, para llevar a observar en el lente de
inmersión (100), si la bacteria se mantiene en color purpura es Gram positiva y
si se torna roja o rosada es Gram negativa
Referencias web
https://docs.google.com/document/d/1oSjsl8oXh9zhxnriIWXMhnxB2AMZ5Dja/ed
it?rtpof=true&sd=true
https://ttehuacantecnmmy.sharepoint.com/:w:/g/personal/l20360348_tehuacan_t
ecnm_mx/EYE0g9MAkLNCul80tNGqkAcBZHBf57xsFEsPEOMkrL5Ygg?rtime=5
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La práctica fue realizada en dos sesiones el día 9 de marzo del presente año, en
el laboratorio de biología de las instalaciones académicas.
