Código: PT-20 1
Revisión 08
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Clonalidad de Microorganismos
1. OBJETIVOS
1.1 Establecer las directrices para la realización de los ensayos de clonalidad para: Listeria
monocytogenes y Salmonella spp a través de la técnica reacción en cadena de la
Polimerasa (PCR), seguida de secuenciación de ADN.
2. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACION
Se aplica a:
2.1 Muestras de alimentos presumiblemente contaminados.
2.2 Colonias ya aisladas, desde muestras de alimentos presumiblemente contaminados.
3. REFERENCIAS
3.1 Patchanee P, Chokboonmongkol C, Zessin KH, Alter T, Pornaem S, Chokesajjawatee N.
Comparison of multilocus sequence typing (MLST) and repetitive sequence-based PCR
(rep-PCR) fingerprinting for differentiation of Campylobacter jejuni isolated from broiler in
Chiang Mai, Thailand. J Microbiol Biotechnol. 2012 Nov;22(11):1467-70.
3.2 Achtman M, Wain J, Weill FX, Nair S, Zhou Z, Sangal V, Krauland MG, Hale JL,
Harbottle H, Uesbeck A, Dougan G, Harrison LH, Brisse S; S. Enterica MLST Study Group.
Multilocus sequence typing as a replacement for serotyping in Salmonella enterica. PLoS
Pathog. 2012;8(6):e1002776.
3.3 Renier S, Hébraud M, Desvaux M. Molecular biology of surface colonization by Listeria
monocytogenes: an additional facet of an opportunistic Gram-positive foodborne pathogen.
Environ Microbiol. 2011 Apr;13(4):835-50.
3.4 IV-20 INFORME VALIDACIÓN Procedimiento de Clonalidad de Microorganismos.
4. PRINCIPIOS
No aplica
5. TERMINOS Y DEFINICIONES
5.1 MLST: Corresponde a la tipificación multilocus de secuencias (de sus siglas en inglés
Multi Locus Sequence Typing) utilizada para la caracterización taxonómica de bacterias y
microorganismos. Esta metodología compara las secuencias de ADN de fragmentos
internos de varios genes de mantenimiento de entre 450 y 500 pares de bases. Se asignan
como diferentes alelos las distintas secuencias presentes para cada gen de mantenimiento,
y para cada muestra los alelos en cada uno de los loci definen el perfil alélico o tipo de
secuencia.
6. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
6.1 Estufa de incubación regulada a 35°±1°C.
6.2 Asa de inoculación estériles.
6.3 Placas Petri estériles de 90mm
6.4Agar Chromogenico/similar para Listeria monocytogenes (o agar cromogénico
equivalente).
6.5 Agar Chromogenico/XLD para Salmonella spp. (o agar cromogénico equivalente).
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6.7 Stomacher y Bolsas para Stomacher estériles.
6.8 Balanza.
6.9 Etiquetas (identificación de muestras).
6.10 Campana de flujo laminar.
6.11 Mechero.
6.12 Contador de colonias o equivalente.
6.13 Guantes sin talco.
6.14 Micropipetas P2, P20, P200 y P1000.
6.15 Puntas P2, P20, P200 y P1000, con filtro
6.16 Tubos de 1,5 y/o 2 mL
6.17 Vortex
6.18 Micro-centrífuga para tubos de 1,5 o 2 mL, que alcance 13000rpm o 16000g.
6.19 Dispensador de volumen variable
6.20 Termociclador.
6.21 Equipo de eletroforesis horizontal.
6.22 Gel de Agarosa 2%.
6.23 Solución amortiguadora de electroforesis SB 1x.
6.24 Ladder
6.25 Redgel
6.26 Transiluminador UV
6.27 Fuente de poder
6.28 Cámara de fotos digital.
6.29 Tezba (Reactivo de extracción (IT-08)
6.30 Tezbeads (Kit de extracción) (PT-61)
6.31 Kit PURE DNA (PT xx)
6.32 Pipeta Pasteur
Materiales de Referencia
Listeria monocytogenes (serotype 4b) ATCC 19115
Salmonella entérica serovar Typhimurium ATCC 14028
7. PROCEDIMIENTO
DESCRIPCION DE LA ACTIVIDAD
7.1 Pre-enriquecimiento selectivo: Una vez requerido el ensayo de clonalidad desde
muestras positivas, se deben inocular entre 50-500 uL en los caldos especificos para cada
microorganismo a analizar.
Incubar durante 24 hrs o hasta que se observe el crecimiento bacteriano, con un máximo de
72 hrs. Transcurrida la incubación, confirmar mediante PCR la presencia del
microorganismo, con el PCR esecifico según corresponda. (Tabla 3)
7.2 Aislamiento de colonias: Desde contramuestras positivas, confirmadas mediante PCR,
realizar un estriado con un asa estéril, en campana de flujo laminar, sobre placas de agar
específicas para cada microorganismo, según lo dispuesto en la tabla 3 de este documento.
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7.3 Incubación de colonias: Incubar las placas en forma horizontal, e invertida, durante 24
a 48 ± 3 horas a 35°C ±1°C o hasta que las colonias sean visibles y presenten sus
características típicas para el agar utilizado.
Luego de la incubación, revisar el crecimiento de las placas buscando colonias aisladas
cuyas características sean típicas para el agar utilizado, informadas según el proveedor de
los agares utilizados (Tabla 3).
Para confirmar la identidad de los microorganismos aislados, se deben tomar entre 2 a 5
colonias presuntivas e inocular tubos con 2 ml del caldo de cultivo utilizado inicialmente para
el enriquecimiento de la muestra. Pasado el tiempo de incubación, tomar 1ml del cultivo y
realizar la confirmación mediante PCR (Tabla 3).
7.4 Confirmación de Colonias: Extraer el ADN desde 1ml de cultivo. Para esto, centrifugar
la muestra a 16000g por 3 minutos, con el fin de precipitar las células bacterianas.
Posteriormente, eliminar el sobrenadante y adicionar 200ul de reactivo de extracción Tezba
(ver IT-08) rompiendo las membranas que pueden interferir en el PCR.
A continuación, colocar la muestra en un baño a 99°C ± 0.2°C, centrifugar la muestra a
16000g por 3 minutos y confirmar el DNA de los microorganismos a utilizar, mediante Nplex
(PT-42).
En caso de no conseguir un DNA puro se sugiere probar con los métodos de extracción de
Tezbead y/o Pure DNA.
7.5 MLST – PCR: Después de obtener un resultado positivo para el microorganismo a
analizar mediante PCR, utilizar ese ADN para la amplificación de los diferentes locus de
acuerdo a la tabla1 del Anexo 2.
Terminado el PCR, en un trozo de “parafilm” colocar gotas de 1 ul de buffer de carga y
luego agregar 5 ul del producto PCR a la gota, mezclar por pipeteo y luego cargar en un
pocillo del gel. Repetir esto para cada muestra. Agregar en un pocillo un marcador de
tamaño tipo “ladder de 100pb”. Anotar el orden de carga en la copia del registro. Colocar los
electrodos y encender la fuente de poder y fijar en 250 mV, las condiciones de corrida. Dejar
migrando aproximadamente 25 min o hasta que el frente de corrida llegue al borde del gel.
Apagar y trasladar el gel a un transiluminador UV.
Sacar una foto digital, enviar una copia la carpeta de “fotos-PCR” del servidor central, una
segunda copia a la carpeta “Respaldo fotos PCR”. Avisar mediante e-mail que la
electroforesis se encuentra lista, en el asunto del correo indicar el código de PCR realizado,
en el cuerpo del correo indicar el orden de carga de las muestras en el gel, adjuntar la foto
correspondiente y luego enviar.
8. ANÁLISIS Y APROBACIONES DE RESULTADOS
Análisis de Secuencia: Una vez confirmada la amplificación mediante electroforesis de
todos los genes del MLST, traspasar todo el contenido del producto de PCR de cada mix a
un tubo rotulado con el número de la muestra y su locus correspondiente. Dichos tubos
deben ser enviados a Macrogen ([Link] para su purificación
y posterior secuenciación; de los genes.
Los partidores utilizados para realizar esta secuenciación se encuentran en la tabla 2 del
anexo 2.
Una vez obtenidas las secuencias, compararlas según las bases de datos disponibles en:
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Instituto Pasteur: [Link]
Universidad de Oxford, UK: [Link]
Warwick University, UK:
[Link]
Para el análisis de Listeria monocytogenes, utilizar las siguiente página
[Link]
Seleccionar Sequences and profiles database. Luego seleccionar Sequence query. En el
cuadro que se abrirá, pegar la secuencia obtenida de cada partidor, y analizar una a la vez.
Luego de procesar, el portal emitirá un resultado, indicando el número de locus para cada
secuencia analizada. Anotar estos resultados en la planilla de cepario de Listeria. Con todos
los locus identificados, nuevamente ir a
[Link] , y luego entrar a Isolates Database. En esta
página, seleccionar Search by combinations of loci (profiles). En Schemes, debe aparecer
MLST. Luego copier en cada locus los números obtenidos del análisis anterior ( abcZ, bglA,
cat, dapE, dat, ldh y lhkA). Seleccionar Submit, y la página emitirá el o los resultados con las
cepas y clones que mayor similitudes de locus presenten al insertado. Seleccionar el que
posea mayor identidad. Obtenido el resultado, notificar al área de reporte el resultado obtenido
de la clonalidad.
Para el análisis de Salmonella spp., ir a la página [Link] .
Seleccionar Sequence/ profile definitions database. Luego seleccionar Sequence query. En el
cuadro que se abrirá, pegar la secuencia obtenida de cada partidor, y analizar una a la vez.
Luego de procesar, el portal emitirá un resultado, indicando el número de locus para cada
secuencia analizada. Anotar estos resultados en la planilla de cepario de [Link] todos
los locus identificados, nuevamente ir a [Link] y seleccionar Isolates
database. Luego, seleccionar Search by combinations of loci (profiles). En Schemes,
seleccionar MLST. Anotar cada uno de los valores obtenidos para los diferentes locus (aroC,
dnaN, hemD, hisD, purE, sucA, thrA). Después de ingresar los valores de cada locus,
seleccionar Submit , y la página emitirá el o los resultados con las cepas y clones que mayor
similitudes de locus presenten al insertado. Seleccionar el que posea mayor identidad.
Obtenido el resultado, notificar al área de reporte el resultado obtenido de la clonalidad.
9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
No aplica
10. INFORME
No aplica
11. TABLA DE CAMBIOS
Motivo de la
Revisión Cambios
modificación
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- Creación y cambios no especificados
01-06 No aplica
- Se agregan puntos 4, 7, 8, 9, 10 y 11, según
nuevo formato.
07 Actualización
Se actualizan microorganismos para este
procedimiento y se agrega información para
08 Actualización
análisis de resultados.
Elaborado
Aprobado por:
por: Supervisor Biología
Molecular Director Técnico
12. ANEXO
PCR Clonalidad Salmonella RPT-20-01
PCR Clonalidad Listeria RPT-20-02
Tabla 1. Partidores utilizados para la amplificación de los diferentes loci.
Microorganismo Locus Partidor
Lis-abcZoF
abcZ
Lis-abcZoR
Lis-bglAoF
bglA
Lis-bglAoR
Lis-catoF
cat
Lis-catoR
Lis-dapEoF
dapE
Lis-dapEoR
Listeria monocytogenes
Lis-datoF
dat
Lis-datoR
Lis-ldhoF
ldh
Lis-ldhoR
Lis-lhkAoF
Lis-lhkAoR
lhkA
Lis-lhkA-F3
Lis-lhkA-R2
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Sal-thrAF-Prin-F
thrA Sal-thrAF-Prin-R
Sal-thrAR
Sal-purEF-F
Sal-purEF-Prin-F1
purE Sal-purER-R
Sal-purER-R1
Sal-purER-Prin-R2
Sal-sucAF-F
Sal-sucAF-Prin-F1
sucA
Sal-sucAR-R
Sal-sucAR-Prin-R1
Salmonella spp.
Sal-hisDF-F
Sal-hisDF-Prin-F1
hisD
Sal-hisDR-R
Sal-hisDR-Prin-R1
Sal-aroCF-Prin-F
aroC
Sal-aroCR-Prin-R
Sal-hemDF-F
hemD Sal-hemDF-Prin-F1
Sal-hemDR-Prin-R
Sal-dnaNF-Prin-F
dnaN Sal-dnaNR-Prin-R
Sal-dnaNR-R1
Tabla 2. Partidores utilizados para la secuenciación de los diferentes loci.
Microorganismo Partidores
Seq-F
Listeria monocytogenes
Seq-R
Seq-F
Salmonella spp.
Seq-R
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Tabla 3. Caldos, agares y PCRs especificos para la confirmacion de microorganismos, en los
ensayos de MLST.
Microorganismo Caldo Cultivo PCR para confirmar Agar especifico Caracteristica de la colonia
Listeria Monocytogenes LEE RPT-18-02 Chromagar Verdes con Halo blanco
Salmonella sp MKTTn RPT-07-02 XLD Rojas con centro negro
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