Código: PT-06 1
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Recuento de Bacillus cereus
1. OBJETIVOS
Establecer las directrices para la realización de ensayos por la técnica de recuento en placa para
el recuento de unidades formadoras de colonias de Bacillus cereus, con su posterior
confirmación por PCR con partidores exclusivos para Bacillus cereus, en muestras de alimentos.
2. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACION
2.1 Este procedimiento especifica un método horizontal para la enumeración de colonias viables
presuntivas de Bacillus cereus, por medio de la técnica de recuento de colonias en placa a
una temperatura de 30°C, en el cual, la fase de confirmación se realiza mediante técnicas de
PCR.
2.2 Este método es aplicable a las muestras de alimentos de consumo humano que en su
formulación o ingredientes incluyan cereales, leche, budines, cremas pasteurizadas y
especias, entre otros alimentos y que han sido preparadas de acuerdo al IT-01.
3. REFERENCIAS
3.1 NCh 3116 Of.2008: Microbiología de los alimentos de consumo humano y animal - Método
horizontal para la enumeración presuntiva de Bacillus cereus - Técnica de recuento en placa
a 30ºC.
3.2 Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA) DTO. N° 977/96 ([Link]. 13.05.97).
3.3 IV-06.2 INFORME VALIDACIÓN Enumeración de Bacillus cereus – Confirmación de
colonias presuntivas mediante PCR.
4 PRINCIPIOS
4.1 El Bacillus cereus es una bacteria que forma colonias típicas en la superficie del agar del
medio de cultivo selectivo MYP. El B. cereus no utiliza el manitol del medio, por lo que su
fermentación es detectada por el indicar de pH rojo fenol, a su vez esta bacteria produce
fosfolipasa C (lecitinasa) cuya actividad es detectada por la yema de huevo formando un
precipitado, es así como se obtienen colonias características rosadas con un precipitado a
su alrededor.
Este medio contiene Polimixina B, que inhibe a microorganismos Gram negativos.
5 TERMINOS Y DEFINICIONES
5.1 Bacillus cereus presuntivo: bacterias que forman colonias típicas sobre la superficie de
medios de cultivos selectivos y que dan reacciones de confirmación positivas bajo
condiciones especificadas en este procedimiento.
NOTA: Se utiliza el término “presuntivas” para indicar que en la fase de enumeración de colonias
en placa no se permite la distinción entre B. cereus y otras especies de este género.
6 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
6.1 Área Microbiología:
▪ Campana de flujo laminar.
▪ Estufa de incubación (30 +/- 1 ° C).
▪ Homogeneizador Stomacher.
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▪ Balanza granataria de al menos 0,1 g de precisión.
▪ Guantes de látex o vinilo.
▪ Hoja de bisturí, preferentemente número 22 o 23, para muestra de
alimentos
▪ Micropipetas P2, P20, P200 y P1000.
▪ Placas de Petri estériles de 90mm
▪ 225 ml Medio de cultivo MultiEbroth FOOD
▪ Bolsa estéril 720 ml.
▪ Agar MYP adicionado con Yema de Huevo y Antibiótico Polimixina
▪ Rastrillo estéril
▪ Cepa control
▪ 1 tubo ependorf de 1,5 ml por cada colonia presuntivamente positiva.
6.2 Área Biología Molecular.
▪ Termociclador.
▪ Equipo de electroforesis horizontal
▪ Gel de Agarosa 2%.
▪ Solución amortiguadora de electroforesis SB 1x.
▪ Ladder
▪ Redgel
▪ Transiluminador
▪ Fuente de poder
▪ Cámara de fotos digital.
▪ 4+n rxn Mix de PCR "B. cereus Kit" (n= número de colonias a confirmar).
▪ 1 U x n Punta p2
▪ 1 U x n Puntas p1000
▪ 1 U x n Puntas p200
▪ 0,2 ml x n TEZBA
▪ U x n Tubo 1,5ml
▪ U x n Tubo 2ml
▪ 1 U x n Tubo PCR
▪ Baño termorregulado o Termobloque
7 PROCEDIMIENTO
7.1 Preparación campana de bioseguridad
7.1.1 Limpiar con desinfectante y alcohol al 70%, encender la luz UV por 15 minutos.
Antes de trabajar apagar la luz UV.
7.2 Preparación de las muestras: pesaje, hidratación, homogeneización y diluciones para
siembra:
• Pesar y preparar las muestras (hidratar y homogeneizar) de acuerdo al IT-01.
• A partir de la muestra hidratada y homogenizada, o desde la muestra líquida directa,
preparar las diluciones decimales consecutivas necesarias para obtener un
recuento contable en placa:
Para ello, transferir 1 ml de la preparación a un tubo de 9 ml de APT al 0.1%, agitar
en vortex, y repetir para las siguientes diluciones.
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La selección de las diluciones que se vayan a preparar e inocular, dependen del
número esperado de microorganismos en la muestra, con base en los resultados
de análisis previos y de la información que se obtenga. Como referencia, utilizar el
Reglamento Sanitario de los Alimentos, preparando diluciones de acuerdo a los
límites de cumplimiento de cada tipo de muestra de acuerdo al siguiente ejemplo:
Límite Cumplimiento Dilución a Sembrar
100 – 101 10-1
101 – 102 10-1
102 – 103 10 – 10-2
-1
103 – 104 10-2 – 10-3
104 – 105 10-3 – 10-4
105 – 106 10-4 – 10-5
106 – 107 10-5 – 10-6
7.3 Siembra en medio MYP
• Utilizar guantes sin talco y micropipetas con puntas con filtro
• Identificar las placas de agar MYP con el ID de la muestra y la dilución sembrada.
a) Transferir en duplicado a través de una micropipeta con punta estéril, 0,1 ml de la
muestra de ensayo si el producto es líquido, o en caso de ser un alimento sólido o
semi sólido, la misma cantidad de la muestra ya hidratada y homogeneizada (IT-01),
a la superficie del agar contenido en las placas. Repetir el procedimiento, usando otras
diluciones decimales, si es necesario.
b) Para ciertos productos en que se solicita estimar un recuento de ufc de B. cereus bajo,
el límite de detección puede ser disminuido en un factor de 10 = dilución 101 o 100,
esto dependiendo de si el alimento es sólido o líquido, respectivamente. Para esto, se
siembra 1 ml de la suspensión inicial, distribuyéndolo en 3 placas de 90 mm, de la
siguiente forma: 0.3 ml, 0.3 ml y 0.4 ml, usando un rastrillo estéril. A esto lo llamaremos
B. cereus crítico y se realizan en duplicado
• Cuidadosamente diseminar cada inóculo con un rastrillo estéril lo más rápidamente
posible sobre la superficie de cada placa (siembra por extensión con rastrillo).
1) Se coloca el inóculo de la muestra en el centro de la placa.
2) Apoyar sobre la placa, la parte acodada del rastrillo, y realizar movimientos
circulares sobre esta, sin levantar el rastrillo hasta haber cubierto toda la superficie,
teniendo cuidado de no tocar sus bordes.
3) De esta manera cada célula diseminada sobre la placa generará una colonia.
Fig. 4
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• Utilizar un rastrillo estéril por cada placa. Dejar las placas tapadas por
aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, para que el inóculo se
absorba en el agar.
7.4 Control de calidad del método de ensayo
Por cada set de análisis realizar, a la par con las muestras los siguientes controles:
• Control de esterilidad
Se debe incubar en paralelo una placa con agar MYP, del mismo lote a utilizar
durante el ensayo. (agar sin inocular).
• Control de productividad
Sembrar 0,4 mL de un cultivo de B. Cereus ATCC 10876 a una concentración de
1x102 ufc/ml, la productividad de este control debe ser mayor al 70%, lo que
indicaría una incertidumbre máxima del 30%.
7.5 Incubación
• lnvertir las placas (colocarlas boca abajo, con las tapas apoyadas en la superficie)
para evitar contaminación e incubarlas por 18- 48 horas a 30°C ±1°C; si a las 18
horas no hay crecimiento se debe seguir incubando hasta 48 horas ±2 horas, si hay
crecimiento se pasan a confirmación.
7.6 Selección de colonias presuntivas de Bacillus cereus.
• Seleccionar las placas con menos de 150 colonias.
• Contar colonias características presuntivas de Bacillus cereus de cada placa. Las
colonias presuntivas son grandes, de color rosado (indica que no ha ocurrido la
fermentación del manitol) y generalmente rodeada por una zona de precipitación
(indica la producción de lecitinasa).
• Las colonias serán confirmadas por PCR con partidores exclusivos para Bacillus
cereus según la siguiente indicación:
a. Seleccionar 5 colonias presuntivas desde cada placa. Si hay menos que 5
colonias sobre la placa deben seleccionarse todas.
b. Para placas sobrepobladas, si no es posible seleccionar y aislar
colonias, sembrar por diseminación 5 colonias presuntivas sobre la
superficie de placas con el medio MYP. Desde cada placa seleccionar al
menos una colonia de color rosado, tratando de que esta se encuentre
aislada del resto.
c. Tomar cada una de las colonias, por separado, y colocar en 0,1 ml de agua
libre de nucleasas, en tubo ependorf de 1,5 ml, cerrar la tapa de seguridad,
llenar la planilla RIT-08-07 de entrega de colonias a el área de Biología
Molecular.
A continuación, se presenta un diagrama de flujo, en Microbiología, para el recuento
de Bacillus cereus:
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Preparación de la muestra:
• Bcer: 25 g de muestra + 225 ml de diluyente (dilución 1/10).
• Bcer crítico: dilución 0.
Inoculación e incubación:
• Transferir por duplicado 1,0 o 0,1 ml según corresponda de las
diluciones preparadas en placas de Petri con agar MYP.
• Incubar a 30°C ± 0,5ºC, 18 h a 48 h.
Selección de colonias presuntivas:
• Recuento y selección de las colonias presuntivas: seleccionar
las placas con menos de 150 ufc, contar como B. cereus
presuntivo.
• Seleccionar 5 colonias características.
• Colocar c/u individualmente, en 0,1 ml de agua libre de
nucleasas.
• Entregar a Biología Molecular para confirmación.
Fig. 2
7.7 Extracción de ADN.
a. Una vez recibida la muestra en la sala de extracción de Biología Molecular,
revisar que estén todas las colonias indicadas y correctamente rotuladas; y
colocar el tubo en la gradilla del baño termorregulador, y hervir durante 15
minutos. Enfriar a temperatura ambiente. Centrifugar a 16000 g/ 3 minutos.
Posteriormente, traspasar 50 µl del sobrenadante a un tubo de 1.5 ml.
b. A partir de cada tubo, realizar confirmación de las colonias de Bacillus
cereus a través de PCR, según lo indicado en el PT-07: Procedimiento de
Amplificación y semi-cuantificación de productos de PCR, y detección de
productos para la pesquisa de patógenos humanos en alimentos,
manipuladores y superficies.
c. Una vez realizada la extracción de ADN y su adición al mix de PCR
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específico para la detección de Bacillus cereus, entregar los tubos al
responsable del área de Detección Molecular junto con el registro RPT-07-
14, para ser colocados en el termociclador.
7.8 Amplificación y determinación por electroforesis de ADN.
a. Una vez en el área de Detección Molecular, verificar que las posiciones
indicadas en el formulario de entrega correspondan con las posiciones de la
placa o tiras entregadas; en caso de que falten, haya mayor cantidad, se
hayan abierto las tapas y secado la muestra de alguno de los pocillos,
informar o consultar al área de Biología Molecular.
b. Colocar los tubos dentro del termociclador y cerrar. Seleccionar el programa
indicado en el registro de trabajo, verificar tiempo y temperatura del ciclo. El
programa de amplificación es "Food SERVICIO" y corresponde a lo
siguiente: Desnaturalización inicial: 95°C por 10 minutos. 40 ciclos de:
Desnaturalización: 95°C por 30 segundos. Alineamiento: 63°C por 30
segundos. Elongación o extensión: 65°C por 1 minuto. Extensión final: 65°C
por 10 minutos.
c. Presionar start y registrar: la identificación del termociclador, la hora de inicio
y la hora de termino. Una vez terminada la amplificación, sacar los tubos del
termociclador. Preparar un gel de agarosa al 2% en buffer SB, según IT-18,
Una vez gelificado, sumergirlo en la cámara de corrida en buffer SB 1%. En
un trozo de "parafilm" colocar gotas de 1,5 µl de buffer de carga y luego
agregar a ésta, 5 µl del ADN ya amplificado según metodología mencionada
en puntos 7 y 8 del presente documento, mezclar por pipeteo y luego cargar
5 µl en una de las ranuras o pocillos del gel. Repetir esto para cada muestra
y control. Agregar en un pocillo un marcador de tamaño tipo "ladder de
1000pb, con un intervalo de 100pb". Anotar el orden de carga en la copia del
registro. Colocar la tapa con los electrodos y encender la fuente de poder,
fijar en 250 mV las condiciones de corrida. Dejar migrando
aproximadamente 18 minutos + 2 min o hasta que el frente de corrida llegue
al borde del gel. Apagar y trasladar el gel a un transiluminador UV.
d. Sacar una foto digital, descargar en el computador del área una copia en la
carpeta de "fotos-PCR" del servidor central, una segunda copia a la carpeta
"Respaldo fotos PCR". Avisar mediante e-mail que la electroforesis se
encuentra lista, en el asunto del correo indicar el código de PCR realizado,
en el cuerpo del correo indicar el orden de carga de las muestras en el gel,
adjuntar la foto correspondiente y luego enviar al área de Resultados.
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8 ANÁLISIS Y APROBACIÓN DE RESULTADOS
8.1 Análisis e interpretación de Resultados
a. El tamaño de las bandas obtenidas se debe extrapolar por comparación con
el ladder de 1000pb, revisando en primera instancia los controles positivos.
Los tamaños esperados son: 120 pb para Control Interno, 228 pb para
Bacillus cereus, esta información se encuentra en el RPT-07-14.
b. Si una muestra presenta una banda del tamaño esperado para el patógeno,
se debe considerar positiva para este. Si solo se observa una banda de
tamaño equivalente al control interno, se debe considerar como negativa
para el patógeno a confirmar. Si una muestra no presenta ninguna banda,
se debe informar que la muestra esta inhibida procediéndose a repetir el
PCR, por Precipitación (IT-08). En la nueva bitácora de PCR indicar la
dilución del DNA, la que dependerá del tipo de matriz a analizar. Si la
amplificación de DNA se inhibe nuevamente, se procede a repetir la
extracción desde la contramuestra ya enriquecida, (IT-08).
c. Antes de evaluar los resultados en las muestras a analizar, es necesario
verificar los controles de esterilidad y productividad realizados en el proceso.
En caso de que los controles de productividad y/o esterilidad presenten
señales que no cumplan con el criterio de interpretación, los análisis
deberán ser repetidos, así mismo deben ser confirmados los controles
empleados en el PCR de confirmación.
A continuación, se anexa una imagen de la corrida de PCR de un B. cereus:
Ladder
Muestras -
Control -: Mix
Control +
+
Control + Muestras +
+Control +
Fig. 3
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8.2 Cálculo y emisión de Resultados
8.2.1 Muestras generales: Bacillus cereus (RPT 06-01)
Registrar el número de colonias por cada dilución.
Si las placas no contienen colonias características, informar según lo siguiente:
• <10 ufc/g cuando se ha sembrado directo desde una muestra líquida
• <100 ufc/g en caso de productos sólidos, donde se ha sembrado 0.1 ml desde
la dilución 10-1, según IT-01
• N x 10x ufc/g, considerando a N como el número de colonias y X la dilución
más baja utilizada.
8.2.2 Muestras Críticas
Cuando se realicen siembra de muestras críticas, realizar el cálculo del resultado
final de UFC tratando las 3 placas sembradas como una. (0.3 ml, 0.3 ml y 0.4 ml).
Luego registrar el número de colonias de cada dilución, determinar el promedio
del recuento bacteriano entre las tres placas y multiplicar por el inverso de la
dilución.
Si las placas no contienen colonias características, informar según lo siguiente:
- <1 / ml (productos líquidos) o
- <1/d / g, (otros productos) donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial.
8.2.3 Cálculos
[Link] Para recuentos generales debe considerar la siguiente formula:
∑𝐶
𝑁=
𝑉 𝑥 1,1 𝑥 𝑑
∑C = Suma de las colonias contadas en las dos placas escogidas de las dos diluciones
consecutivas, de las cuales al menos una de las placas contiene un mínimo de 10
colonias
V = Volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros
d = Dilución correspondiente a la primera dilución escogida
[Link] Para recuentos luego de una confirmación, del total de colonias identificadas (A)
se seleccionan máximo 5 para confirmación y se realiza el siguiente calculo:
𝑏
𝑎= 𝑥𝐶
𝐴
b = Número de colonias que cumplen los criterios de identificación dentro de las colonias
identificadas A
C = Número total de colonias sospechosas contadas en cada placa
El resultado calculado se redondea al número entero más próximo.
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[Link] Para recuentos menores a 10 colonias y mínimo 4 colonias se debe realizar el
siguiente calculo:
𝐶
𝑁𝐸 =
𝑉𝑥𝑑
Expresando el valor como número estimado de microorganismos por ml o gr.
[Link] Para recuentos entre 1 y 3 colonias, la precisión del análisis es demasiado baja y
el resultado debe expresarse como:
“Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 4/Vd por gramo o ml”
Donde
d = Factor de dilución de la suspensión inicial, o de la primera dilución inoculada o
escogida.
V = Volumen de inóculo utilizado en cada placa en ml
A continuación, se presenta una imagen con la vista general que da el sistema al
momento de hacer el reporte en este análisis:
Fig. 4
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9 EXPRESIÓN DE RESULTADOS
No aplica
10 INFORME
El informe del análisis debe contener la información siguiente:
a) la identificación precisa de la muestra, incluyendo lugar, día y hora del muestreo y
tiempo de almacenamiento;
b) los resultados obtenidos según se indica en cláusula 8 de esta metodología
c) la referencia a este método de ensayo
d) cualquier modificación del procedimiento especificado
11 TABLA DE CONTROL DE CAMBIOS
Motivo de la
Revisión Cambios
modificación
- Creación y cambios no especificados
01-11 No aplica
- Se agregan puntos 9, y 11, según nuevo
formato.
- Se detallan los puntos de siembra, controles,
12 interpretación de resultados y se actualiza Actualización
punto de cálculos.
Elaborado
Aprobado por:
por: Encargado de gestión de
calidad Director técnico
12 ANEXOS
Registro de resultados Recuento de Bacillus cereus por NCh 3116 RPT-06-01
Of.2008.
Registro de resultados Recuento de Bacillus cereus por NCh 3116 RPT-06-02
Of.2008. Alimentos críticos.
Preparación y Resultados PCR Monoplex Bacillus cereus RPT-07-14
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