Código: PT-04 1
Revisión 09
Vigencia: 02 – 04 – 2021
Recuento de Clostridium Perfringens
1. OBJETIVOS
1.1 Realizar recuento de colonias viables de Clostridium perfringens.
2. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACION
2.1 Aplicar esta técnica de análisis a todos los alimentos que en su formulación o
ingredientes incluyan carnes, para especies, condimentos y todo tipo de cecinas crudas y
frescas.
3. REFRERENCIAS
3.1 NCh: 3061 Of.2007: Microbiología de los alimentos de consumo humano y animal-
Método horizontal para la enumeración de Clostridium Perfringens- Técnica de recuento
en placa.
3.2 Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA) DTO. N° 977/96 (D.Of. 13.05.97).
3.3 IV-04 INFORME VALIDACIÓN Enumeración de Clostridium perfringens – Confirmación
de colonias presuntivas mediante PCR.
4. PRINCIPIOS
No aplica
5. TERMINOS Y DEFINICIONES.
5.1 Anaerobiosis: Ambiente en ausencia de oxígeno, este se genera agregando a la jarra
de anaerobiosis, un sachet el cual reduce la cantidad de oxigeno presente produciendo
dióxido de carbono.
5.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Técnica que sirve para amplificar un
fragmento de ADN de los organismos vivos con alta especificidad y sensibilidad.
6. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
a. Equipos, Materiales y Reactivos Generales.
- Campana de flujo laminar / mechero de gas.
- Baño termorregulado, o aparato similar (estufa), con capacidad de mantener a 46ºC
±1ºC.
- Estufa de Incubación (37 +/- 1 º C).
- Homogeneizador Stomacher.
- Cámara de anaerobiosis.
- Balanza granataria de al menos 0,1 g de precisión.
- Guantes de látex o vinilo.
- Hoja de bisturí, preferentemente número 22 o 23, para muestra de alimentos
- Jarra anaerobiosis, Anaerogen o Gas Pack con generador de H2 + CO2.
- Indicador de anaerobiosis.
- Micropipetas P2, P20, P200 y P1000.
- Placas petri estériles de 90mm
Página 1 de 5
Código: PT-04 2
Revisión 09
Vigencia: 02 – 04 – 2021
Recuento de Clostridium Perfringens
- Termociclador.
- Equipo de eletroforesis horizontal.
- Gel de Agarosa 2%.
- Solución amortiguadora de electroforesis SB 1x.
- Ladder
- Redgel
- Transiluminador
- Fuente de poder
- Cámara de fotos digital.
b. Equipos, Materiales y Reactivos Específicos.
- Agar TSC (Sulfato cicloserina).
- 4+n rxn Mix de PCR “C. perfringens Kit” (n= número de colonias a confirmar).
- 1Uxn Punta p2
- 1Uxn Puntas p1000
- 1Uxn Puntas p200
- 0,2 ml x n TEZBA
- 1Uxn Tubo 1,5ml.
- 2Uxn Tubo 2ml
- 1Uxn Tubo PCR
- 225 ml Medio de cultivo A (Agua Peptonada Tamponada).
- 1U Bolsa estéril 720 ml.
7. PROCEDIMIENTO
DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD Y RESPONSABLE
7.1 Dilución: Pesar y preparar la muestra según lo indicado en el instructivo IT01 de
preparación de muestras para análisis microbiológicos.
A partir de la muestra homogeneizada o de la muestra liquida directa, preparar diluciones
decimales 10-1, 10-2, etc. Para ello trasferir 1ml a un tubo con 9ml de agua peptonada. Agitar
y proceder de igual forma para las diluciones siguientes.
La selección de las diluciones que se vayan a preparar e inocular, dependen del número
esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y
de la información que se obtenga.
7.2 Dilución: Como referencia, utilizar el Reglamento Sanitario de los Alimentos,
preparando diluciones de acuerdo a los límites de cumplimiento de cada tipo de muestra de
acuerdo al siguiente ejemplo:
Límite Cumplimiento Dilución a Sembrar
100 – 101 100 (muestras líquidas)
101 – 102 10-1
102 – 103 10 – 10-2
-1
103 – 104 10-2 – 10-3
104 – 105 10-3 – 10-4
105 – 106 10-4 – 10-5
106 – 107 10-5 – 10-6
Página 2 de 5
Código: PT-04 3
Revisión 09
Vigencia: 02 – 04 – 2021
Recuento de Clostridium Perfringens
7.3 Siembra: Identificar las placas estériles a utilizar con el número de muestra y dilución,
agregue 1ml en el centro de la placa sembrando como mínimo dos diluciones consecutivas.
Controles del proceso:
7.3.1 Control Productividad: Sembrar 1 mL de un cultivo de C. perfringens ATCC
13124 a una concentración de 1x102 cfu/mL.
7.3.2 Control Esterilidad: Sembrar 1 mL del buffer de dilución utilizado durante el
ensayo.
7.4 Incorporación del medio: Verter en placa 15ml aproximadamente del agar Triptosa
Sulfito cicloserina mantenido a una temperatura aproximada de 46ºC ±1ºC en Baño
Termoregulado.
7.5 Mezclar: Mezclar la muestra con el agar, con movimientos giratorios procurando de no
levantar la placa del mesón. Dejar solidificar.
7.6 Crear ambiente anaerobio: Aplicar una segunda capa del mismo agar cubriendo toda
la superficie para favorecer la anaerobiosis. Dejar solidificar.
7.7 Incubación: Colocar las placas sin invertir dentro de la jarra de anaerobiosis, agregar
un sachet generador de anaerobiosis y adosar a la pared de la jarra un indicador de
anaerobiosis, colocar la tapa de la jarra inmediatamente e incubar ésta en estufa durante 20
±2 horas a 37ºC ±1ºC.
7.8 Recuento: Después de la incubación, se debe verificar que el indicador de anaerobiosis
haya virado de color celeste a blanco, lo que indica que se produjo la anaerobiosis en forma
correcta, de lo contrario (sin cambio de color) se deberán repetir las muestras.
Una vez verificado lo anterior, se debe retirar las placas de la jarra de anaerobiosis y
seleccionar las placas que contengan menos que 150 colonias sospechosas.
Las colonias son de negro con precipitado negro producido por la reducción de sulfito a
sulfuro.
Seleccionar si es posible, placas representativas de las diluciones sucesivas.
Calcular el número de células de clostridium / g de alimento.
En el caso que obtenga un bajo n° de colonias sospechosas, se deben confirmar todas
hasta un máximo de 5 colonias por dilución.
7.9 Confirmación de colonias: Seleccionar las colonias presuntivas (Máximo 5 colonias) e
inocule cada una de ellas en tubos con 0,1 ml de agua libre de nucleasa.
Colocar tapa de seguridad, colocar el tubo en gradilla, y hervir en baño termoregulado a
100º C durante 15 minutos.
Enfriar a temperatura ambiente.
Centrifugar a 16000 g/ 3 minutos.
Posteriormente, traspasar 50 ul del sobrenadante a un tubo de 1.5 ml.
7.10 Confirmación de colonias PCR: A partir de cada tubo, realizar confirmación de las
colonias de Clostridium perfringens a través de PCR, según lo indicado en el PT-07
“Procedimiento de amplificación y semi-cuantificación por PCR, y detección de productos
para la pesquisa de patógenos humanos”
7.11 Amplificación De ADN: Realizar Mix y adicionar muestra según lo que se indica en la
planilla de PCR para Clostridium perfringens RPT-07-12, entregar los tubos al responsable
del área de detección junto con una copia del registro para que los coloque en el
termociclador.
7.12 Programa de Amplificación: Colocar los tubos dentro del termociclador y cerrar.
Seleccionar el programa indicado en el registro de trabajo, verificar tiempo y temperatura del
ciclo.
Página 3 de 5
Código: PT-04 4
Revisión 09
Vigencia: 02 – 04 – 2021
Recuento de Clostridium Perfringens
7.13 Programa de Amplificación: El programa de amplificación es “Food SERVICIO” y
corresponde a lo siguiente:
Desnaturación inicial: 95°C por 10 minutos.
40 ciclos de:
• Desnaturación: 95°C por 30 segundos.
• Annealing: 63°C por 30 segundos.
• Elongación: 65°C por 1 minuto.
Elongación final: 65°C por 10 minutos.
Presionar start y registrar la hora de inicio y término.
7.14 Detección de ADN Una vez terminada la amplificación, sacar los tubos del
termociclador.
Preparar un gel de agarosa al 2% en buffer SB, según indica IT-18. Una vez gelificado,
sumergirlo en la cámara de corrida en buffer SB.
En un trozo de “parafilm” colocar gotas de 1,5ul de buffer de carga y luego agregar 5 ul del
PCR a la gota, mezclar por pipeteo y luego cargar en un pocillo del gel. Repetir esto para
cada muestra.
Agregar en un pocillo un marcador de tamaño tipo “ladder de 100pb”. Anotar el orden de
carga en la copia del registro. Colocar los electrodos y encender la fuente de poder y fijar en
250 mV las condiciones de corrida. Dejar migrando aproximadamente 25 min o hasta que el
frente de corrida llegue al borde del gel. Apagar y trasladar el gel a un transiluminador UV.
Sacar una foto digital, enviar una copia la carpeta de “fotos-PCR” del servidor central, una
segunda copia a la carpeta “Respaldo fotos PCR”. Avisar mediante e-mail que la
electroforesis se encuentra lista, en el asunto del correo indicar el código de PCR realizado,
en el cuerpo del correo indicar el orden de carga de las muestras en el gel, adjuntar la foto
correspondiente y luego enviar.
7.15 Expresión de resultados de presencia/ ausencia: El tamaño de las bandas
obtenidas se debe extrapolar por comparación con el ladder de 100pb y/o con los controles
positivos. Los tamaños esperados son:
• 220 pb para Control Interno.
• 113 pb para Clostridium perfringens.
Posibles resultados:
1. Si una muestra presenta una banda del tamaño esperado para el patógeno, se
debe informar como presencia de éste.
2. Si solo se observa una banda de tamaño equivalente al control interno, se debe
informar como ausencia de los patógenos.
Si una muestra no presenta ninguna banda, se debe informar que la muestra está inhibida
procediéndose a repetir el PCR con una dilución del ADN utilizado. En la nueva bitácora de
PCR indicar la dilución del DNA, la que dependerá del tipo de matriz a analizar.
7.16 Expresión de resultados: Se considerarán las colonias pasadas a confirmación
como el 100% del total del recuento de colonias presuntiva. El resultado final se determina
considerando el porcentaje de colonias efectivamente positivas.
Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonias (ufc) /gr.
Cuando las colonias no sean confirmadas como Clostridium perfringes, informar:
<10 UFC/gr, si la muestra corresponde a la dilución 10-1
8. ANÁLISIS Y APROBACIONES DE RESULTADOS
Página 4 de 5
Código: PT-04 5
Revisión 09
Vigencia: 02 – 04 – 2021
Recuento de Clostridium Perfringens
No aplica
9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
No aplica
10. INFORME
No aplica
11. TABLA DE CONTROL DE CAMBIOS
Motivo de la
Revisión Cambios
modificación
- Creación y cambios no especificados
01-08 No aplica
- Se agregan puntos 4, 7, 8, 9, 10 y 11, según
nuevo formato.
- Se actualiza información en puntos 7.9, 7.11
09 y 7.14 Actualización
- Se elimina información que no corresponde
en punto 7.15
Elaborado
Aprobado por:
por: Jefe de Calidad Director Técnico
12. ANEXOS
Registro de resultados Recuento de Clostridium perfringens RPT-04-01
Preparación y Resultados PCR Monoplex Clostridium perfringens RPT-07-12
Registro liberación controles positivos para ensayos microbiológicos RIT-11-05
Página 5 de 5
