Preparaciones
fijas y en fresco
Alga verde
Bacteria roja
Tinción de microorganismos
La tinción es un método fácil y rápido que mejora el contraste de la
imagen que es observada en un microscopio óptico compuesto.
Tinciones
Simples
Diferenciales
Selectivas o Específicas
Utilidad de las tinciones
▪ Permiten hacer visibles a los organismos
microscópicos y transparentes.
▪ Nos revela su forma, agrupación y
tamaño.
▪ Muestran la presencia de estructuras
internas y externas
▪ Producen reacciones químicas
específicas.
▪ Permite clasificar a las bacterias.
Colorantes
GRUPOS
CROMÓFOROS GRUPOS
-N=N- Azo AUXÓCROMOS
-S=S- Disulfuro -OH hidroxilo
-C=C- Etilénico
C=O Carbinol -NH2 amino
-COOH carboxilo
ortoquinona
SO3H sulfónico
paraquinona -SR Sulfuro
Cl, Br, I halógenos
Clasificación de los colorantes
CATIÓNICOS O BÁSICOS ANIÓNICOS o ÁCIDOS
Grupos cargados Grupos cargados negativamente
positivamente. como hidroxilos (-OH) o
carboxilos (-COOH).
Azul de metileno Eosina
Frotis: Consiste en una capa de muestra que se extiende sobre la superficie de un
portaobjetos libre de grasa, se deja secar al aire y posteriormente se fija.
Cultivo
líquido
Cultivo
sólido
Debe ser lo
suficientemente delgada
para permitir el paso de
la luz a través de ella.
Fijación
Proceso por el cual se conservan y adhieren en su posición las estructuras externas
e internas de las células.
Objetivos:
•Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología
•Endurece las estructuras celulares, de manera que no cambien durante la tinción ni la
observación.
•Matar al microorganismo, coagula sus proteínas y lo adhiere firmemente al
portaobjetos.
Fijación Física con calor
▪ Consiste en calentar a la flama del mechero la fina película
de bacterias secada previamente al aire.
Inconvenientes:
▪ Si el frotis no se ha secado completamente, al pasarlo por el mechero se
provoca la ebullición del microorganismo, lo que podría afectar su forma.
▪ Si la fijación es insuficiente, la fina película de bacterias no se pegará al
portaobjetos y será fácilmente arrastrada en los pasos subsecuentes.
▪ Si se fija en exceso incineraremos a los microorganismos.
Preparación fija
Fijación Química
▪ Los fijadores químicos penetran las células y reaccionan
con los componentes celulares, normalmente proteínas y
lípidos para inactivarlos y convertirlos en insolubles e
inmóviles.
▪ Entre las sustancias comúnmente utilizadas como
fijadores químicos se encuentran el etanol, cloruro
mercúrico, ácido acético, formaldehído, ácido tánico y
glutaraldehído.
Preparación fija
Ventajas
▪ Podemos guardarla por un tiempo considerable (permanente).
▪ Me permite observarla en varias ocasiones.
▪ Lista para tinción
Desventajas
▪ Microorganismos muertos
▪ Los microorganismos pueden sufrir alteraciones
Tinción simple
Utiliza un solo colorante.
Ej. Azul de metileno, cristal violeta,
safranina, fucsina.
Permite observar:
▪ el tamaño
▪ la forma
▪ la agrupación
▪ la presencia de endosporas
bacterianas
Tinción simple de Saccharomyces cerevisiae
100X
Azul de metileno Cristal violeta
Safranina Verde de malaquita
Tinciones diferenciales
Los métodos de tinciones diferenciales clasifican a las
bacterias en grupos distintos según sus propiedades
tintoriales.
•Las tinciones diferenciales más comúnmente utilizadas son la
tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen.
Tinción de Gram
La tinción de Gram desarrollada por el médico danés Christian
Gram en 1884, es el método de tinción más utilizado en
bacteriología.
Divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas
(G+) y Gram negativas (G-)
Pared celular
Pared celular
Componentes de la pared celular
Composición de la pared celular de una bacteria
Gram positiva
Composición de la pared celular de una bacteria
Gram negativa
Pasos de la tinción de Gram
15 seg 1min
1min
1min
Pasos de la Tinción de Gram
Cuadro comparativo entre una bacteria Gram positiva y una bacteria Gram negativa
GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
Resultado a la tinción de Morada Rosa
Gram
Géneros representativos Bacillus, Escherichia,
Staphylococcus, Neisseria,
Streptococcus Pseudomonas
Peptidoglicano Capa gruesa 20-80nm Capa delgada 10nm
Ácidos teicoicos Presente Ausente
Periplasma Ausente Presente
Membrana externa Ausente Presente
Lipopolisacárido Ausente Presente
Porinas Ausente (no necesarias) Presente
Sensibilidad a penicilina Generalmente más Generalmente menos
susceptible susceptible
Sensibilidad a la lisozima Si No (Poco)
La tinción de Gram se emplea con frecuencia para
determinar:
▪ Tamaño
▪ Forma
▪ Agrupación
▪ Presencia de endosporas
▪ Pureza de un cultivo
▪ Clasificar a la bacterias en Gram positivas y
Gram negativas
▪ Identificar a una bacteria
Tinción de Gram
Escherichia coli Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Tinción de Ziehl-Neelsen
La tinción de Ziehl Neelsen desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de
manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosis en muestras clínicas
de pacientes.
Esta técnica aprovecha las cualidades de bacterias de los géneros Mycobacterium y
Nocardia que no son decoloradas por soluciones de alcohol ácido, por eso se les
denomina bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR)pero que se pueden teñir con
colorantes básicos con una pequeña cantidad de fenol y calentando suavemente por
unos minutos.
Paul Ehrlich
Franz Ziehl Friedrich Neelsen
Tinción de Ziehl-Neelsen
Estos géneros presentan en su estructura un alto contenido de ácidos grasos de
cadena muy larga, constituidos por ceras, ácidos micólicos y/o nocárdicos.
Lipoarabinomanano
Lípidos
externos
Pared
Ácidos celular
micólicos
arabinogalactano
peptidoglicano
Membrana
plasmática
Fosfatidilinositol
Tinción de Ziehl-Neelsen
Características de estas bacterias:
▪ Ácido alcohol resistencia
▪ Crecimiento lento
▪ Resistentes a detergentes
▪ Resistencia a antibióticos
Pasos de la tinción de Ziehl Neelsen
Tinción de Ziehl-Neelsen
BAAR +
BAAR +
Tinciones selectivas o específicas
Tinción de Schaeffer y Fulton (esporas)
Estructuras muy resistentes a los agentes físicos y químicos debido a su
composición de peptidoglicano, calcio, ácido dipicolínico y SASP(proteínas ácido
solubles). Los géneros más conocidos que presentan esporas son: Bacillus,
Clostridium y Geobacillus.
Pasos de la tinción de esporas
1.- Verde de malaquita 5 minutos a emisión de vapores
2.- Enfriar y enjuagar con agua
3.- Safranina 1 minuto
4.- Enjuagar con agua
Verde de Enfriar y
malaquita 5´ enjuagar Safranina 1´
Otras tinciones específicas
• Cápsula: Rojo congo, tinta china (Criptococcus, Klebsiella)
• Pared celular. Knaysi
• Flagelos: Leifson
• Inclusiones: Azul de Löeffler
Cápsula
Cápsula: tinta china Cápsula: Rojo congo
Flagelo
base
Flagelo Tinciones
Flagelos: Leifson
Inclusiones
Inclusiones: Löeffler
Preparación
en fresco
Preparación en fresco
Es una preparación que
se realiza al momento
de hacer la observación
•Preparación en fresco simple
•Preparación en gota pendiente
PREPARACIÓN EN FRESCO SIMPLE
Preparación en fresco
Colocación del cubreobjetos con
pinzas de disección
Preparación en fresco
Sellado de la preparación con barniz de uñas
Preparación terminada
Preparación en gota pendienPtre
e
a) Se realiza colocando una gota de
la suspensión bacteriana en un
cubreobjetos en el cual se ha
hecho previamente un círculo con
vaselina o parafina . La vaselina
actúa como sellador.
b) Sobre el cubreobjetos se coloca
un portaobjetos con una
exc avación central que qued a
adherido gracias a la vaselina .
c) Se invierte la preparación y se
observa colocándola en la platina
del microscopio.
40X
40X
40X
Preparación en fresco de
Aspergillus niger
Teñido con azul de algodón lactofenol
Preparación en fresco
Ventajas: Desventajas:
• Fácil y rápida • Observación a 10X y 40X
preparación • No permite aumentar contraste
• Observar movilidad
• Reproducción
• Nutrición
