UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES

BIOTECNOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

INGENIERÍA QUÍMICA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

CINÉTICA DE CRECIMIENTO- CULTIVO BATCH

Prof. Adjunta: Dra. María Alicia Martos

JTP.: Bqca Mgter Emilce Roxana Zubreski

Auxiliar docente de Primera: Dra. Ana Paula Butiuk

Alumnos: Aliprandini Federico

Ramirez Martin

Pfeiffer Belen

Viera Paula

2019
 Cinética de crecimiento- Cultivo batch

Introducción

Describiremos en el presente informe las experiencias realizadas en laboratorio y

planta piloto para la obtención de biomasa, a partir de Saccharomyces Cereviseae, por
medio de un proceso discontinuo conocido como proceso “batch”.

Realizamos el seguimiento de la cinética de crecimiento del microorganismo de

interés, dando inicio con la preparación de los medios de cultivo hasta el agotamiento total
del sustrato, acontecimiento que determina la finalización del experimento.

Como resultado final, obtuvimos la curva de calibración correspondiente;

aprovechamos el procedimiento para medir glucosa, y así tener idea de la velocidad de
consumo del sustrato.
Materiales y Métodos

 Erlenmeyers
 Vasos de precipitados
 Pipetas y Micropipetas
 Varillas de vidrio
 Tubos de ensayo
 Probetas
 Jeringa

Equipos e Instrumentos

 Biorreactor
 Estufa
 Autoclave
 pHmetro
 Agitador magnético
 Shaker
 Espectrofotometro
 Centrifuga
 Mechero
 Filtro Satorius
 PARTE I: Preparación de medios de cultivo

Preparamos los medios y esterilizamos de manera individual, para evitar reacciones

químicas o precipitaciones.

1. Preparación de fuente de Nitrogeno: Urea

Luego de pesar, diluimos en 200 mL de agua destilada 11,26g de Urea.

Valiéndonos del agitado magnético, pHmetro y soluciones de NaOH y HCl regulamos el

pH en 5.

Finalmente, filtramos en filtro Sartorius previamente esterilizado (filtro de 0.2 micras)

2. Agua para el inóculo

Colocamos 30mL de agua destilada en dos Erlenmeyers de 50mL.

3. Solución de extracto de levadura (1g/L).

Se agrega al medio de cultivo para aportar aminoácidos y vitaminas necesarias para el

crecimiento óptimo de nuestra levadura.

Pesamos y disolvimos 5g de extracto de levadura en 400mL de agua destilada, al igual que

en 1. Regulamos el pH hasta 5.

Distribuimos nuestra solución en dos Erlenmeyers, 240mL en uno y 160mL en otro.

Llevamos a esterilizar las soluciones en autoclave a 121 °C durante 15 min.

PARTE II:

A. Masa celular por absorbancia:

A partir de 500 mL de fermentación, transvasamos con micro pipeta 5mL a un tubo de

ensayo y enrasamos con agua destilada hasta 10 mL. A continuación realizamos diluciones
sucesivas, transvasando 5 mL de cada tubito al siguiente y enrasando nuevamente a 10mL.
(Teniendo en cuenta la rápida precipitación de las levaduras, entre dilución y dilución
 agitamos la mezcla con un VORTEX para poder
homogeneizarla y tener lecturas correctas)

Finalmente, medimos con espectrofotómetro, la absorbancia de cada dilución, obteniéndose

los siguientes resultados:

Tabla 1- Medidas de Abosrbancia

Dilución Absorbancia (620nm)

SB 1,369
1/2 1,244
1/4 0,711
1/8 0,505
1/16 0,299
1/32 0,166
1/64 0,086

Datos que, junto a la medición de concentración en peso seco, se utilizarán para

obtener y graficar la curva de calibración

B. Determinación de biomasa por peso seco:

De la misma solución se extrajeron cuatro muestras de 10mL en tubos plásticos que se
llevaron a centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos.
Luego de eliminar el sobrenadante, transvasamos la levadura con ayuda de agua destilada a
4 frascos de vidrio que ingresaron a estufa durante 24-48 h a 45°C.
Transcurrido el tiempo, se realizó la pesada de los mismos:
Tabla 2- Medidas de concentración

N° de Vaso Peso Vacio Peso seco (muestra) Peso muestra (P*)

13 8,6001 8,654 0,0539

14 8,9156 8,978 0,0624
15 8,8168 8,9049 0,0881
 16 8,835 8,9005 0,0655

Promedio 0,067475

0,067475 10 mL
x [g/L] 6,7475 1000 mL

Finalmente, completamos la tabla 1, graficamos y obtuvimos la curva de calibración

correspondiente a éste cultivo:
Tabla 3- Tabla completa - Curva de calibración

Concentración Absorbancia
SB 6,747 1,369
1/2 3,374 1,244
1/4 1,687 0,711
1/8 0,843 0,505
1/16 0,422 0,299
1/32 0,211 0,166
1/64 0,105 0,086
 PARTE III: Determinación de la cantidad de
Glucosa durante el proceso fermentativo

Para preparar el inóculo destinado al fermentador, primero en cuatro erlenmayers de 500 ml

se colocan a cada uno 60 ml de glucosa, a su vez se preparan para cada uno de ellos una
suspensión del microorganismo con 40 ml de agua destilada, y se lo deja incubar a 28-30
°C un aproximado de 18 horas.

Luego se transvasan el contenido de los mismos en un erlenmayer acodado especial para

alimentar el reactor.

Con el medio de cultivo preparado, se vierte en el vaso del fermentador dejándolo caer por
gravedad, se enciende el agitador, el aireador y una vez introducido el medio se siembra
con el inóculo de igual manera que con el medio del cultivo.

Pasado un tiempo necesario para que el microorganismo se asiente al medio, se procede a la

toma de muestras con jeringas cada 30 minutos las cuales serán de 15ml; previamente se
extraen 10ml antes de la toma de la muestra con el objetivo de no contaminar la muestra
siguiente. Con estas muestras se pueden medir la cantidad de biomasa producida y glucosa
consumida durante el proceso de fermentación.

Determinación de Glucosa:

Se determina por el método de glucosa oxidasa-peroxidasa, el cual se basa en la oxidación

enzimática de la glucosa a ácido glucónico y agua oxigenada, el H2O2 en presencia de
peroxidasa produce la copulación oxidativa del fenol con (4-AF), formando un cromógeno
rojo cereza la cual servirá para con el espectrofotómetro determinar la cantidad de glucosa.

Cada muestra tomada debe pasar con una centrifugación de un tiempo aproximado de 10
minutos, y solo se trabaja con el sobrenadante de las mismas.

En tres tubos de ensayos marcados como B (blanco), S (standard), D (desconocido), a cada

uno de ellos se le adiciona 2 ml de reactivo de trabajo, al tubo S se agrega 20 ml de
standard, y al tubo marcado como D se agrega 20 ml de muestra, teniendo esto se pasa a
 baño de 37°C por 10 minutos y una vez alcanzado la
coloración rojo cereza se mide en el espectrofotómetro a 505nm.

Y se procede al cálculo con ayuda de la curva de calibración de la cantidad de biomasa, se

toma para estos cálculos la curva que mejor ajuste tenía la cual es: Y=0.2125*X+0.0794, la
concentración de la glucosa se calcula a partir de la siguiente expresión:

Concentración de glucosa [g/l]= D (absorbancia de la muestra) [nm]* 1/S (val. de conc. de

una unidad de absorbancia del standard) [g/l*nm]

Obteniendo así el siguiente cuadro:

Tabla 4- datos obtenidos al medir biomasa y glucosa

Nº Tiempo Absorbancia X Ln x Absorbancia Dilución Concentración

Muestra (620nm) (505nm)
1 0 (9:10) 0,377 1,4 0,33 0,26 1/5 7,22
2 1 (9:45) 0,378 1,41 0,34 0,272 1/5 7,56
3 2 (10:21) 0,428 1,64 0,49 0,256 1/5 7,12
4 3 (10:51) 0,506 2 0,69 0,241 1/5 6,7
5 4 (11:21) 0,584 2,37 0,86 0,197 1/5 5,48
6 5 (11:55) 0,657 2,72 1 0,194 1/5 5,39
7 6 (11:25) 0,781 3,3 1,19 0,111 1/5 3,08
8 7 0,935 4,02 1,39 0,041 1/5 1,14
9 8 1 4,33 1,46 0,063 S/D 0,35
10 9 1,044 4,54 1,51

NOTA: durante la toma de muestras, se produjo algún error, el cual marcaba un incremento
de glucosa a media que se determinaba la biomasa, por ende, se descartó las mediciones
hechas y se volvieron a hacer, pero con diluciones.

Practico: Cinética del crecimiento microbiano

1-

C6H12O6+aNH3+bO2 --------> yx/s CH1,79O0,5N0,2 +yp/s C2H6O+yco2/s CO2

CH2O+aNH3+bO2 --------> yx/s CH1,79O0,5N0,2 +yp/s CH3O+yco2/s CO2

c−molx
ymtx/s=4/4.16=0,96
c −mols
 c−molx
yrealx/s=0,96*0,6=0,576 ---------------->
c −mols
25,8 gx
Yrealx/s=0,576* =0,5
30 gs
c−molp
ymtp/s=4/6=0,66
c−mols
c−molp
ymtp/s=0,66*0.6=0,396
c−mols
2-

xf −xo gx
Yrealx/s= =--------> xf= Yrealx/s*so=0,5*10=5
so−sf l
3- Suponiendo que no se forma producto

Balance de nitrógeno:

molN
a = yx/s*0,2= 0,576*0,2=0,1152
C−molS
10gs=1/3 C-molS

molN
0,1152 *1/3C-molS=0,0384molN=0,54gN
C−molS
0,54 gramos de nitrógeno será la cantidad necesaria como fuente de nitrógeno

Masa molar del sulfato de amonio= 132g/mol

132gsulfato--------------->28gN

3gsulfato-------------------> 0.6363gN

El nitrógeno que se agrega al medio es suficiente

4-

4,54−1,4
el rendimiento experimental es de: Y x/s= =0,44gx/gs
7,22