PRACTICA 5.
INOCULACIÓN DE BACTERIAS
I.- OBJETIVO. El estudiante aprenderá la técnica de siembra por estría en
diferentes medios de cultivo de uso común en Microbiología bajo condiciones
asépticas.
II.- INTRODUCCIÓN
Técnicas estériles
Las placas de Petri son un ambiente rico en nutrientes, por lo que es importante la
utilización de técnicas estériles en todo momento. Nunca dejes a una placa de
Petri abierta. Siempre expón a tu asa de inoculación a las llamas antes y después
de transferir las bacterias de un medio a otro. Algunos laboratorios pueden
requerir el uso de una máscara o trabajar dentro de una campana de tiro
descendente para reducir al mínimo los contaminantes ambientales.
Técnica de estriado básico
Calienta el asa de inoculación hasta que quede de color rojo intenso para eliminar
cualquier microorganismo. Deja que el asa se enfríe durante 20 o 30 segundos,
pero no lo soples para no reintroducir microorganismos. Recoge una muestra del
cultivo bacteriano a partir de un caldo o una placa de Petri. No necesitas de una
presencia bacteriana visible. Levanta la tapa de la placa de Petri que vas a
sembrar en un ángulo de 45 grados, coloca el asa en la parte de atrás del plato,
toca con el asa en el medio y pásalo a través de la superficie de la placa con un
movimiento en forma de S desde atrás hacia adelante. Algunos laboratorios
pueden querer que gires la placa a 90 grados y repitas el procedimiento de
inoculación para una cobertura completa.
Métodos
Estriar para aislar
Estriar para aislar implica una sola inoculación de una sección de la placa de Petri
y a continuación, disminuir la colonia arrastrando microorganismos de la sección
inicial de dos o tres secciones adicionales, achicando eficazmente la población de
microorganismos. Generalmente utilizado para separar un cultivo mixto de las
bacterias, los bacteriólogos también utilizan este método para aislar una línea de
bacterias que nacen de un solo progenitor.
Estriado en T
Para llevar a cabo con precisión un estriado en T, dibuja una "T" en la parte
posterior de la placa de Petri. Voltea la tapa de la placa hacia abajo y, con un
marcador permanente, divídela por la mitad. A continuación, dibuja una línea
divisoria en una de las mitades para dividirla hasta formar una "T". Gira la placa de
manera que la sección más grande quede a tu derecha. Inocula el asa de acuerdo
con el procedimiento anterior. Levanta la tapa e inocula el medio con el barrido en
forma de S, pero no cruces la línea media. Vuelve a calentar el asa para matar
cualquier microorganismo. Gira el asa a la izquierda hasta que la primera de las
secciones más pequeñas quede en la esquina inferior derecha. Comienza
barriendo en forma de S en la esquina derecha de la primera sección que
estriaste, en la nueva sección. Pon el asa al calor de la llama hasta que quede de
color rojo intenso para eliminar cualquier microorganismo. Gira la placa una vez
más y repite el barrido en S de la segunda sección a través de la tercera.
Estriado por cuadrantes
Este es también un método de estriado para el aislamiento, pero utiliza cuatro
secciones en lugar de tres. Divide la parte inferior de la placa de Petri en cuatro
partes iguales con un marcador permanente. Utiliza los procedimientos básicos de
estriado para inocular el primer cuadrante. Trabaja en el sentido de las agujas del
reloj, llevando los microorganismos de un cuadrante a otro, como lo hiciste con el
método del estratificado en T y calentando el asa antes de inocular el siguiente
cuadrante. Calienta el asa y barre en forma de S desde el primero hasta el
cuadrante adyacente.
En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones
mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se
llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los
microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas
en el laboratorio en cultivos puros (o axénicos). En ocasiones el estudio
molecular conduce a la caracterización de los microorganismos, aún en
poblaciones mixtas. Sin embargo, la identificación bacteriana y la caracterización
completa solo es posible tras el aislamiento de la bacteria y la obtención de
cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su
aislamiento del resto de los microorganismos presentes (enn una muestra
patológica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el
aislamiento es posible obtener la bacteria de interés en cultivo puro.
Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos
que le acompañan. El método más usual es la siembra por estría sobre un medio
de cultivo sólido adecuado dispuesto en una placa de Petri.
Para ello se toma una pequeña cantidad de muestra con un asa de platino y se
reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas
e inmovilizadas las células bacterianas. Tras la incubación en condiciones
adecuadas, cada célula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas
divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas características
determinadas en cuanto a su forma, borde, elevación, tamaño, consistencia,
etc.. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original es visible como tipos
diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible
obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la
muestra original..
El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la
superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el
mayor número de estrías posible. En las primeras estrías aparecerán colonias
confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estrías finales
deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un
reducido inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la población
sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de
cultivo, debe asegurar que finalmente algunas células queden suficientemente
separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie
III.- JUSTIFICACIÓN. Para estudiar debidamente a los microorganismos se
necesita como requisito previo el aislamiento selectivo mediante la utilización de
un medio de cultivo acorde a sus necesidades nutrimentales. Posteriormente, se
realiza la inoculación por estría cruzada para aislar por agotamiento a los
organismos microscópicos y así obtener colonias individuales.
IV.-MATERIAL Y EQUIPO:
5 cajas de Petri por equipo
1 matraz Erlenmeyer de 250 ml
Espátula
Asa de inoculación
Algodón
Gasa
Cinta masking tape o marcador permanente
Alcohol
Balanza
Autoclave
Mechero
Refrigerador
Incubadora bacteriológica
Agua destilada
Agar Dextrosa Sabouraud (ADS)
Agar rojo violeta bilis (RVB)
Agar de eosina y azul metileno (EMB)
Agar nutritivo (AN)
Agar base sangre (ABS)
Muestras proporcionadas por el profesor
V.- PROCEDIMIENTO
I.-Preparación del material y medios de cultivo
1.- Desinfectar la mesa con alcohol
2.- Calcular la cantidad necesaria de agar para preparar 5 cajas de Petri (100 ml
del medio que te asigne el profesor)
3.- Pesar el medio de cultivo y prepararlo en un matraz Erlenmeyer como en la
práctica anterior, teniendo cuidado de no sobrecalentar el medio en la ebullición.
4.- Envolver 5 cajas de Petri con papel de estraza.
5.- Esterilizar el medio y las cajas de Petri en autoclave a 121°C (15 Lb/in2 de
presión) durante 15 minutos.
6.- Rotular las cajas con marcador o cinta masking tape en la parte posterior
7.- Dejar enfriar el medio de cultivo a una temperatura entre 45-50° C (temperatura
soportable al dorso de la mano) y vaciar aproximadamente 20 a 25 ml en las cajas
de Petri estériles. Esto se realiza cerca de la flama del mechero; al destapar el
matraz se flamea la boca de éste y se procede a depositar el medio en la caja.
8.- Cerrar la caja en zona estéril y colocar cuidadosamente en la mesa de trabajo.
9.- Dejar solidificar el medio, colocar las cajas de forma invertida y guardar en el
refrigerador para su posterior siembra.
II.- Siembra
1.- Desinfectar la mesa de trabajo con alcohol.
2.- Esterilizar el asa de cultivo con mechero
3.- Enfriar el asa, introduciéndola por la orilla de los siguientes medios de cultivo:
RVB, EMB, AN, ADS, ABS.
4.- Sembrar por el método de estría cruzada.
5.- Incubar a 37°C durante 48 horas teniendo cuidado de colocar las cajas de Petri
con la tapa hacia abajo para que el agua de condensación no caiga sobre el medio
de cultivo.
VI.- CÁLCULOS y RESULTADOS:
Para esta práctica se utilizó una regla de 3 1000---40g
140-----5.4g de agar base sangre
Por lo tanto, preparamos la cantidad de 5.6g de agar base sangre en una cantidad
de 140ml de agua
VII.- OBSERVACIONES
Creo que nos hizo falta poner u poca más atención al maestro en el salón de
clase, también podríamos revisar nuestros apuntes de nuestra libreta, porque nos
dificulto un poco su comprensión, pero nada que no se pueda solucionar y
aprender de esos errores y no volverlos a cometer.
VIII.- CUESTIONARIO
1.- ¿Para qué microorganismos sirven los medios de cultivo que preparamos en la
práctica?
Los medios de cultivo para microbiología permiten el crecimiento y desarrollo de
diferentes microorganismos (bacterias, levaduras y mohos) necesarios para el
sector clínico e industrial.
El estudio de los microorganismos desde el área clínica es muy importante pues
gracias a este se pueden detectar cuales son los causantes de ciertas afecciones
en el organismo y así mismo crear métodos de prevención de las mismas ya sea
mediante vacunas y/o antibióticos. Es por eso que los medios de cultivo para
microbiología aportan gran fuerza en la búsqueda de soluciones efectivas.
2.- ¿Cuál es la finalidad de la siembra por estría en caja?
La siembra por estría permite aislar las bacterias que dan lugar a colonias
separadas y posteriormente, transfiriendo una sola colonia a un medio nuevo, se
permite el desarrollo de un cultivo puro bacteriano.
3.- ¿Por qué es importante que se encuentre estéril y fría el asa de inoculación? El
objetivo de la esterilización no es otro que el de evitar la contaminación cruzada de
muestras o el crecimiento de microorganismos no deseados.
IX.- CONCLUSIONES
Esta es de unas prácticas fundamentales para un buen aprendizaje en el futuro
porque si no sabemos elaborar esto se nos va a complicar en el futuro, creo que
yo y mi equipo no entendimos muy bien y nos gustó mucho hacer esta práctica es
tubo divertida
X.- BIBLIOGRAFÍA
Técnicas y métodos de estriado de una placa de agar - EXIGUSS VITA.
Microbiología e
innovación. (s. f.). http://microbiologiacbtis2.infored.mx/blog_584286_Tecnicas-y-
metodos-de-estriadode-una-placa-de-agar.html
Mdmadmin. (s. f.). ¿Por qué son importantes los medios de cultivo para
microbiología? https://mdmcientifica.com/medios-cultivo-para-
microbiologia/#:~:text=Los%20medios%20de%20cultivo%20para%20microbiolog
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