UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

Prá ctica N° 001: MICROORGANISMOS INDICADORES

DE CONTAMINACIÓ N FECAL (Coliformes, Colifecales y
E coli) Y DETERMINACIÓ N DE A. MESÓ FILOS

CURSO:
MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL I
DOCENTE:
MSc. CARMEN GISELA MINDANI CACERES
PRESENTADO POR:
LUIS ENRIQUE ARACA YARANGA
CODIGO: 214724

PUNO - PERÚ
Práctica N° 001: MICROORGANISMOS INDICADORES DE CONTAMINACIÓN FECAL (Coliformes,
Colifecales y E coli) Y DETERMINACIÓN DE A. MESÓFILOS | PRÁ CTICA DE LABORATORIO´

INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

I. OBJETIVO

 aprender las técnicas e interpretaciones de los microorganismos en los

alimentos

II. INTRODUCCIÓN

Dentro de los microorganismos patógenos se encuentran el grupo de bacterias

coliformes el cual está conformado por dos subgrupos: los coliformes totales y
los termotolerantes. A estos últimos antes se los denominaba coliformes
fecales.

El cambio de nombre se debe a que se demostró que en el grupo de coliformes

que se detectaban en siembras incubadas a temperaturas de 44.5 C y en
medios de cultivo específicos, solo una parte del grupo eran bacterias de origen
fecal; el resto eran bacterias ambientales

La contaminación de los alimentos es una consecuencia directa de las

deficiencias sanitarias durante su proceso de elaboración, manipulación,
transporte, almacenamiento y las condiciones en que son suministrados al
consumidor. Los microorganismos provenientes de diferentes fuentes de
contaminación, son transferidos a la superficie de los alimentos donde
encuentran los nutrientes necesarios para proliferar. Aunque la exposición a
bajas temperaturas durante el periodo de almacenamiento de algunos
alimentos, como los cárnicos, revela un descenso de la biomasa bacteriana
estos valores logran variaciones conforme aumenta las condiciones de calor y
la exposición a nuevos factores ambientales.

En el presente informe, evaluaremos la presencia de estas bacterias de

coliformes estimando las cantidades presentes tanto en la leche cruda como en
el yogurt.

II.1. LUGAR DE LA PRACTICA

 Laboratorio de microbiología UNA - PUNO

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II.2. GENERALIDADES
Los microorganismos, indicadores de la contaminación fecal, principalmente
son: Coliformes, Colifecales, Escherichia coli. Enterobacterias totales y
Streptococcus del Grupo D de Lancefield, por cuanto normalmente se les
encuentra en " el tracto digestivo del hombre y de animales de sangre caliente”.

 Coliformes

El término Coliformes, comprende los géneros Escherichia, Enterobacter.

Klebsiella y Citrobacter. las cuales se caracterizan por utilizar la Lactosa como
fuente de Carbono Los Coliformes distintos a la E. coli, persisten en el suelo o
sobre las superficies. tales como los granos. frutas y otros productos del
campo.

 Colifecales

Son un grupo de microorganismos procedentes de la incubación del inoculo a

la temperatura de 44 ºC a 45 5ºC, que contiene por lo general un alto
porcentaje de E. coli tipo I y II, por lo que son muy indicativos de la
contaminación fecal.

 Escherichia coli

Este microorganismo habita naturalmente en el tracto digestivo del hombre y de

otros animales de sangre caliente La presencia de este microorganismo en un
alimento dado se interpreta como contaminación directa o indirecta de origen
fecal, por lo que se considera a la E coli como el indicador clásico de la
presencia simultanea de bacterias patógenas entéricas entre ellas Salmonella
tiphy, otras Salmonelas, Shigella sp., vibrios, parásitos diversos y virus
entéricos. Sin embargo, la presencia de E coli en un alimento no indica que
existan también, necesariamente patógenos, sino simplemente, advierte el
riesgo de que pudieran estar presentes.

III. MATERIALES

III.1. MATERIALES

 Agar Maconlli

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 Agar plate de count/recuento en placa

 Papel Kraft, pitas
 Papel de aluminio
 Placas Petri de vidrio
 Tubos de ensayo
 Pipetas de 1ml y 10 ml
 Agua destilada
 Balanza de sensibilidad
 Frascos o erlenmeyers
 Estufa de incubació n (37°C)
 Caja de autoclave
MUESTRAS
 Leche fresca
 Leche evaporada
 Yogurt

III.2. MÉTODOS

MEDIO DE CULTIVO.

A. Para la prueba del recuento estándar de Coliformes

Se empleara el método de recuento de placas, aplicado para los límites de

20-200 Se utilizara el agar rojo violeta con sales biliares

Después de la disolución llevar el ph del medio a 7.3. El calentamiento se

realiza a más o menos a 100°C para la disolución de los ingredientes y para
eliminar las bacterias vivas que pueden dificultar la numeración de
Coliformes. Esto hace que no haya necesidad de esterilizar el medio, solo
se le conserva a -50-60°C después de lograr la disolución

Este método permite enumerar no solamente los bastones Gram (-) que
fermentan la lactosa (denominadas bacterias Coliformes o coli-Aero genes),
como la E. Coli, citrobacter freundi, Enterobacter Aero genes, etc. Sino
también las bacterias intestinales lactosa positiva; conocidas como

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Colifecales patógenos indeterminados, como la salmonella, Arizona y

shigella y las especies denominadas ¨paracolonbactrum¨. El medio se
caracteriza porque lleva consigo un colorante apropiado y sales biliares que
no son Coliformes.

B. para la determinación el N.M.P de Coliformes, Colifecales y E. Coli

Se empleará el método del número más probable

Para la prueba se utiliza el caldo lactosado verde brillante bilis al 2%

(CLVBE) a doble y simple concentración cuya composición es la siguiente:

Peptona__________ 10g

Lactosa ___________10g

Bilis deshidratada ___20g

Verde brillante ______0.0133g

Agua destilada _______1000ml

Esta fórmula es a simple concentración para obtener a doble concentración

se adiciona el doble del peso de cada componente en un litro de agua
destilada.

Después de la disolución llevar el pH a7,0 -7,2 y repartir en tubos de ensayo

a razón de 9ml provistos de una campana Durham y esterilizadas a 121°C x
15 minutos.

PROCEDIMIENTO Y LECTURA A. Método de recuento en placas para

Coliformes

La forma de sembrar es como sigue:

Mezclar en placas Petri estériles 1 ml de la serie de diluciones con más o

menos 15 ml del medio

Recubrir la mezcla una vez solidificado con más o menos 5 ml del medio
estéril

Luego de la solidificación incubar a 37°C x 24-48 hrs

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Al cabo de este tiempo, contar las colonias de las placas que contienen
entre 20 y 200 colonias y que sean colonias violetas rodeadas de un
precipitado rojo violeta Deducir el N° de Coliformes por g de muestra
aplicando las reglas del REP

B. método del número más probable para Coliformes, Colifecales y

Escherichia coli b.1 determinación del n. m. p. para Coliformes

Pipetear tres veces 1 ml del homogenizado del alimento (SM o MO) en tres
tubos de ensayo de CLVBB 2% doble concentrado para E col i

Pipetear tres veces 1 ml del homogenizado de alimento (SM o MO) en tres

tubos de ensayo con CLVBB 2% a simple concentración.

Pipetear tres veces 1 mi de cada una de las diluciones siguientes del

homogenizado en

tres tubos de ensayo con CLVBB 2% a simple concentración

Agitar cada tubo de ensayo, e incubar a 36 6 37 Cx 24-48 horas.

Pasadas las 24 horas anotar los tubos de ensayo que muestran producción
de gas más de 1/3 del volumen de la campana de Durham

Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestran producción de gas
más de 1/3 del volumen de campana de Durham

b.2 determinación del n.m.p para Colifecales

Para determinar el NUMERO DE COLIFECALES, se sigue el Test de

Eijkman

Este consiste en dos tubos de ensayo, uno conteniendo CLVBB 2% a

simple concentración, y Caldo peptonado (CP) el otro, en los que se
siembran por anzadas el inóculo de cada tubo positivo de la prueba anterior,
luego se incuban en baño maría a 44 °C x 24 hr.

Para el cálculo se anotan los tubos de CLVBB 2% con formación de gas

(aquí no interesa ya la condición de más 1/3 de gas) y su respectivo CP con
formación de Indol (formación de anillo rojo grosella con 3 gotas del reactivo
de Kovacs) Cualquier variación contraria, se considera prueba negativa

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Luego del triple número obtenido, se logra el valor respectivo de la tabla del
NMP y se procede igual que para el anterior caso visto.

b.3 determinación del n. m.p. para e coli

Por último, se hace uso de la Galería Bioquímica IMVIC para determinar el

número de E coli, a partir de tubos positivos con CLVBB 2% procedente del
Test de Eijkman La siembra se realiza por picadura profunda y estría
superficial en el medio kligler Iron Agar, y se incuban a 37°C por 24 hr.

Seguir trabajando sólo con aquellos tubos con kligler que hayan virado at
"amarillo" la parte superior o todo el medio (lactosa positiva) Descartar
aquellos que presentan además un precipitado negruzco o la parte superior
del tubo o todo el medio de color rojo.

De los kligler positivos, se siembran por azadas en 4 tubos que contienen

caldo peptonado, caldo rojo de metilo, Proskauer y el último Agar inclinado
de Citrato de Simmons. Luego se Incuban a 37°C x 24 hr.

Se consideran para las lecturas, los siguientes resultados: caldo

(i): caldo peptonado

Se investiga el indol formado después de la incubación, agregando gotitas

del reactivo de Kovacs, formado por la mezcla de alcohol isoamílico y de
ácido nítrico-nitroso (10 ml y 5 ml respectivamente), y agitarlo

La reacción es positiva si la fase alcohólica, está coloreada de rojo claro y

oscuro y constante.

(m): caldo rojo de metilo

Después de haber incubado la siembra a 37°C por 24 horas, agregar 5

gotitas de una solución al 0.04% de rojo de mecilo.

La reacción se considera positiva si la coloración es roja y negativa si es

amarilla.

(vi): caldo voges proskauer

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Al tubo con el medio respectivo inoculado e incubado a 37°C x 24 hr, se le

agrega unos miligramos de Creatinina pa y 0.5 ml de una solución de soda
al 40% y agitar fuertemente por 3 min La reacción es positiva, si una
coloración roja carmín aparece al cabo de 10 minutos. (c): agar citrato de
Simmons

Una vez sembrado el inoculo por estría superficial en el agar Citrato de

Simmons inclinado, e incubado a 37 C x 24 hr. la reacción es positiva si el
medio presenta una coloración azul

IV. PROCEDIMIENTO
1. Primero se envolvió en papel filtro las 4 placas Petri a utilizar y se
amarro con pabilo.
2. Se pesó los dos agares a utilizar de acuerdo a lo necesitado

• Peso e agar Mackenzie: 1.999g

• Peso del otro agar 0.9g

3. Seguidamente se puso a introducir al matraz los dos pesos en un

matraz junto con 40 ml de agua destilada respectivamente

1.999g (agar mackenzie)+ 40ml de agua destilada

0.9g (otro agar) +40 ml de agua destilada

4. Una vez diluido se procedió a envolver la parte de arriba con papel

aluminio y pabilo
5. Juntamente con las placas Petri (4) más el matraz (2) se llevó al baño
maría a

121°C durante 15 a 20min aproximadamente

6. Terminado el tiempo se sacó y la solución se puso a las placas Petri

20ml del primer matraz y 20 al siguiente y se hizo lo mismo con el otro
matraz 20ml y 20ml de la solución a las dos placas Petri
respectivamente.
7. Luego utilizando una pipeta de 10ml absorber 9ml de agua destilada y
poner al tubo de ensayo, se absorbió un 1ml de la muestra(leche);

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una vez disuelta, de la muestra madre se absorbió 1ml y se puso a

otro tubo de ensayo añadiéndolo 9 ml de agua destilada

8. Luego con la ayuda de la pipeta se absorbió 1 ml del ultimo tubo de

ensayo, poniéndolo a las 4 placas Petri respectivamente con la ayuda
del mechero
10−2 ; 10−3 ; 10−4 Y 10−5

9. Finalmente, las 4 placas Petri se llevó a la estufa eléctrica a

35°Cdurante 24 hrs.

V. RESULTADOS

DETERMINACIÓN DILUCIONES NUMERO DE

DE COLIFORMES BACTERIAS
Leche gloria(lata) 10
−1
Es la muestra
inicial
10
−2
0
10−3 15
10
−4
50

DETERMINACIÓN DILUCIONES NUMERO DE

DE COLIFORMES BACTERIAS
−1
Leche gloria(lata) 10 Es la muestra
inicial
10−2 0
10
−3
15
−4
10 50

RESULTADOS DE YOGURT

DETERMINACIÓ DILUCIONES RESULTADOS

N DE
COLIFORMES
YOGURT 10
−1
La muestra
10−2 0
10
−3
80
−4
10 50

DETERMINACIÓN DILUCIONES NUMERO DE

DE COLIFORMES BACTERIAS

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−1
Leche gloria 10 Es la muestra
inicial
−2
10 0
10
−3
0
10−4 0

COLIFORMES 15

AEROBIOS MESOFILOS 18

VI. DISCUSIONES
En el presente informe, al evaluar la calidad sanitaria de muestras de leche
gloria, según resultados, se observó una gran variabilidad entre los recuentos
de bacterias coliformes, aerobias mesófilas obtenidos, sin embargo, el grado de
aceptabilidad de las muestras de leche, según lo establecido por la normativa
criterios-microbiológicos, fue satisfactorio. Los resultados obtenidos en este
estudio son similares a los de otros investigadores, quienes refieren, en leche
pasteurizada, recuentos promedios de bacterias aerobias mesófilas. Por
ejemplo, (Da Silva,2001) reportaron valores entre 8 x104 y 3,0 x105 UFC/mL.
Asimismo, (Tahiri,200) encontró un recuento de 3 x104 UFC/mL de bacterias
aerobias mesófilas en las muestras de leche pasteurizada analizadas. En otros
trabajos como el de (Chatterjee,2006), las muestras de leche pasteurizada no
excedieron los límites microbiológicos permitidos.

VII. CONCLUSIÓN·
Podemos considerar lo siguiente:

 Escherichia coli es una bacteria muy conocida pero sumamente

peligrosa es por ello que debemos saber muy bien en qué lugar
compramos nuestros alimentos así como tener mucho cuidado al
momento de prepararlos. 
 Los Coliformes fecales tienen una mayor probabilidad de contener
organismos de origen fecal, por lo que son organismos indicadores

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mucho más seguros de la contaminación fecal que los Coliformes

totales.
 Los demás coliformes son buenos indicadores de una
limpieza y desinfección no adecuadas, o de una industrialización o
procesamiento de los alimentos no correctos.

El conteo microbiano de bacterias mesófilas y coliformes en la leche fue

bajo. Quienes trabajan en el sector lácteo deben comprender las buenas
prácticas de higiene y producción para reducir la carga microbiana y
adherirse a las prácticas establecidas para garantizar la salud de los
consumidores.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

 Kumar P, Mishra HN. 2004. Yoghurt powder — a review of process. 82:133-

142.
 Sánchez, B. M., & Vázquez, R. C. (2010). Calidad de la leche cruda. Primer
foro sobre ganadería lechera de la zona alta de Veracruz.
 Da Silva A, Da Cunha M, Carneiro L, Almeida A, Queiroz M. Isolation and
serological identification of enteropathogenic Escherichia coli in
pasteurized milk in Brazil. Rev Saúde Pública 2001; 35:375-379
 Tahiri R. A. comparison on microbial conditions between traditional dairy
products sold in Jarak and same products produced by modern dairies. Pakistan
J Nut 2005; 4: 345- 348. 
 Chatterjee N, Bhattacharjee I, Chatterjee S, Chandra G. Microbiological
examination of milk in Tarakeswar, India with special reference to
coliforms. Afric J Biotechnol 2006; 5: 1383-1385.
 Tuorilla H, Montelone E. 2009. Sensory science in the changing society:
opportunities, needs and

IX. ANEXOS

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