Práctica 10.

Técnicas para la enumeración de

microorganismos
8. Técnicas para la enumeración de microorganismos: análisis
microbiológico del agua y de otras diversas muestras

Objetivos
• Aplicar las técnicas de turbidimetría y de recuento microscópico para la
cuantificación microorganismos totales.
• Determinar bacterias mesófilas aeróbias, Gram negativas y levaduras mediante
los métodos de cuenta en placa.
• Emplear la técnica de Número Más Probable para la detección de bacterias
coliformes en agua.
• Comparar los resultados obtenidos de una muestra analizada con las técnicas
de cuantificación de microorganismos viables y totales.

1ª. Sesión

Turbidimetría, recuento microscópico y cuenta en placa (asa calibrada)

Materiales
• Por equipo:
1 microscopio
1 micropipeta de 100 mL con soporte
1 tubo control 0.5 de McFarland
1 tarjeta de Wickerham
1 asa calibrada
1 cámara de Neubauer
1 ocular y 1 portaobjetos micrométrico
1 tubo ependorf de 100 mL
1 mechero*
1 gradilla*

• Medios de Cultivo:
4 matraz nefelómetricos con 70 mL de SSI
1 caja de Petri con agar Sabouraud

• Equipo:
1 nefelómetro
1 densímetro (McFarland)

• Cepa:
Saccharomyces cerevisiae

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 1

Metodología

• Nefelometría y cuenta en placa (asa calibrada)

1. Por mesa: realizar una suspensión 0.5 de la curva de Mac Farland de un cultivo
de Saccharomyces cerevisiae en un matraz nefelométrico con solución salina
isotónica estéril. Utilizar una tarjeta de Wickerham y un tubo estándar.
2. Confirmar la concentración en un densímetro (McFarland).

Cultivo de
Saccharomyces cerevisiae Suspensión
Tubo 0.5 Saccharomyces
MacFarland cerevisiae
0.5 MacFarland

Medir en el
densímetro

3. Determinar en el nefelómetro las unidades Klett (UK) del matraz nefelométrico

con la suspensión de levaduras.Usar como blanco un matraz nefelométrico con
solución salina isotónica
4. Utilizar los siguientes datos para graficar la curva en UK en el eje Y y número de
microorganismos en el eje X. Determinar la ordenada al origen (0) y la pendiente
de la recta y calcular el número de levaduras/mL.

Curva patrón de levaduras

UK UFC/mL
0 0
4 1500000
12 23000000
30 52000000
40 89000000
80 250000000
270 720000000
ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 2
5. Por mesa: con el nefelómetro determinar las Unidades Klett (UK) de la curva de
Mac Farland para bacterias y capturar los datos en la tabla correspondiente.

6. Graficar la curva de Mac Farland: UK en el eje Y y número de microorganismos

en el eje X. Determinar la ordenada al origen (0) y la pendiente de la recta.
7. Compara ambas Curvas Patrón.
8. De la suspensión de S. cerevisiae, inocular por estría continua (agotamiento) una
caja con agar sabouraud empleando un asa calibrada de 10 µL.
9. Incubar la caja (invertida) a 28°C+0.2 durante 5 días en condiciones aeróbicas.
10. Contar el número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) y calcular el
número de levaduras en un mililitro.

10 µL

• Cuenta de Breed

1. En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 2 cm2.

2. Con un asa calibrada transferir al portaobjetos 0.01 mL del cultivo de levaduras
y extender la muestra en el área marcada. Secar, fijar y teñir con cristal violeta
de Gram.
3. Observar en el microscopio con objetivo de inmersión y contar el número de
microorganismos por campo, obteniendo el promedio de 10 campos.
4. Calcular el factor microscópico (FM):
a. Medir el diámetro del campo microscópico por medio del objetivo
(portaobjetos) micrométrico.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 3

 b. Calcular el área del campo. Elevar el radio al cuadrado y multiplicar por
3.1416 (p). Convertir a milimetros.
c. Calcular el área de la muestra en milimetros.
d. Dividir el área de la muestra entre el área del campo para determinar el
número de campos.
5. Calcular el número de levaduras/mL en el matraz.

• Cámara de Neubauer
Espacio

Cubrehematimetro
Soporte
Cámara

1. Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas

por unidad de volumen de un líquido. Las partículas, leucocitos, eritrocitos,
trombocitos, bacterias, esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un
microscopio.
2. Existen distintas cámaras de conteo: Neubauer, Neubauer improved, Thoma,
Bürker, Bürker-Türk, Fuchs-Rosenthal, Malassez y Nageotte, cada una de ellas
con objetivos distintos.

Neubauer
La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1
mm2. El cuadrado grande central está dividido en 16 cuadrados medianos
con aristas de 0.2 mm estando cada cuadrado mediano subdividido en 16
cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025
mm2.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 4

 Neubauer improved
La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1
mm2. El cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos
con aristas de 0.2 mm estando cada cuadrado mediano subdividido en 16
cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm2.
http://biociencias.jodra.net/wp-
content/uploads/2019/04/GK900_05_Clinical_Lab_Zaehlkammern_s.pdf

3. Previamente lavar la cámara y el cubrehematimetro con alcohol al 96% y agua

destilada, secar con papel suave.
4. Colocar el cubrehematimetro sobre la cámara y en cada lateral del mismo
adicionar 10 microlitros del cultivo de levaduras previamente homogenizado
para que por capilaridad la muestra quede en el espacio.
5. Se puede emplear el colorante azul tripano mezclando volúmenes iguales del
colorante y la suspensión de células. Las células que se encuentran vivas tienen
su membrana intacta y no se tiñen. El tamaño de la molécula y, en especial,
su carga eléctrica impide que atraviese la membrana celular. Las células
muertas se tiñen de color azul por la entrada del colorante.

6. Con el objetivo de 40x contar las levaduras en cinco cuadros de manera

diferenciada (teñidas y no teñidas). Calcular el número de levaduras en un
mililitro.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 5

 10 µL 1. Teñir con Cristal Violeta.
2. Observar al microscopio.

S. cerevisiae

Contar las levaduras en 10 campos

100x
y obtener el promedio por campo.

Objetivo micrométrico Determinar el

100x diámetro del
campo
microscópico

FM = Área de la muestra/Área del campo

Levaduras/mL = Promedio de células por campo x FM x 100 (muestra)

Mezclar por partes 10 µL

30 µL iguales el cultivo de
por lado
levaduras y del colorante
azul tripano. Cámara de Neubauer

1. Contar las células en cinco 40x

cuadros del cuadro central y
obtener el promedio.
2. Calcular el número de levaduras.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 6

Registro de resultados y cálculos

• Turbidimetría. Curva de Mac Farland

Tubo Volumen (mL) Volumen (mL) Número de Unidades Klett

H2SO4 1% BaCl2 1% células/mL
0 10 0 0
1 9.9 0.1 3x108
2 9.8 0.2 6x108
3 9.7 0.3 9x108
4 9.6 0.4 12x108
5 9.5 0.5 15x108
6 9.4 0.6 18x108
7 9.3 0.7 21x108
8 9.2 0.8 24x108
9 9.1 0.9 27x108
10 9.0 0.1 30x108

Muestra Equipo Medición Número de

(unidades) células
Suspensión de Nefelómetro UK
S. cerevisiae
Suspensión de Densímetro McFarland
S. cerevisiae

• Nefelometría y cuenta en placa (asa calibrada)

Muestra Volumen de la UFC Levaduras /mL

muestra
Suspensión de
S. cerevisiae

• Cuenta de Breed

Promedio de 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
levaduras por campo

Área de la Diámetro Área del Factor Levaduras/mL

muestra del campo campo Área de la muestra Prom por campo
(10 mL) p x r2 / Área del campo x Factor x 100

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 7

• Cámara de Neubauer o Neubauer improved

Número de cuadros Tipo de cámara Levaduras Número de

en el cuadro central empleada por cuadro levaduras /mL

Imágenes de la cámara de Neubauer. https://blogceta.zaragoza.unam.mx/manualbct2/anexo-2-

camara-de-neubauer/

• Cálculos:

Opción 1

partículas contadas
Levaduras por µL = Superficie contada (mm2) x profundidad cámara (mm) x
dilución

Profundidad cámara: 0.1 mm

http://biociencias.jodra.net/wp-
content/uploads/2019/04/GK900_05_Clinical_Lab_Zaehlkammern_s.pdf

Opción 2

x levaduras # cuadros cámara 1000 mm3 x millones de células

x x =
y cuadros Volumen cámara 1 cm3 (o 1 mL) /mL

La cámara de Neubauer improved tiene 400 cuadros útiles.

Volumen útil de la cámara de Neubauer improved 0.2mm x 0.2mm x 0.1mm x 25 =
0.1 mm3
https://shop.gabsystem.com/data/descargas/Camara%20Thoma%20Neubauer_SP.pdf

Opción 3

a. Número de levaduras por cuadro (o promedio por cuadro)

b. Multiplicar por el número de cuadros en el cuadro central (25) = 0.2mm x
0.2mm x 0.1mm x 25 = 0.1 mm3.
c. Calcular el número de levaduras en un mililitro multiplicando x 104.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 8

 2ª. Sesión

Número Más Probable y Cuenta en Placa (Filtración y Vertido)

Materiales

• Por equipo:
1 micropipetas de 100 µL y 1000 µL con soporte
1 matraz millipore
1 vaso y embudo millipore estériles
1 manguera de vacío
1 pinzas para equipo millipore
1 pinzas de punta roma
1 vaso de precipitados de 250 mL
1 propipeta de tres vías*
1 pipeta Falcon estéril
1 mechero*
1 gradilla*

• Medios de cultivo:
5 tubos de 22x175 con medio CLSS
1 matraz de 250 mL con 100 mL de agar cuenta estándar
2 cajas con agar enriquecido
1 caja de Petri con agar ENDO
1 sistema NKS E. coli y coliformes
2 membranas de celulosa de 0.25 µm

• Muestra:
500 mL de agua de hielo raspado (sin sabor).

Metodología

• Toma de la muestra
1. Comprar con un día de anterioridad 3 vasos de hielo raspado (1.5 L) o
granizado de los carritos y colocarlo en la bolsa plástica.
2. Cerrar inmediatamente y refrigerar (no congelar).
3. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes
de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.

• Número Más Probable (NMP)

1. Prueba presuntiva. Determinación del NMP de coliformes en agua y hielo
potables:

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 9

 a. A partir de la muestra de agua inocular con una pipeta estéril 20 mL en cada
uno de 5 tubos con Caldo Lauril Sulfato de Sodio (CLSS) triple concentración,
rotular.
b. Incubar los tubos a 35°C + 0.5 °C durante 24 horas, observar si hay formación
de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa producción de gas, incubar durante 24 horas más.

• Vertido (cuenta en placa)

1. Colocar con una micropipeta 1mL de la muestra en cada una de dos cajas de
Petri estériles (duplicado), verter en cada caja aproximadamente 20 mL del
medio agar cuenta estándar, fundido y enfriado a 45°C, homogenizar y dejar
solidificar (etiquetar con el volumen utilizado).
2. Colocar con una micropipeta 0.1 mL de la muestra en cada una de dos cajas
de Petri estériles (duplicado), verter en cada caja aproximadamente 20 mL del
medio agar cuenta estándar, fundido y enfriado a 45°C, homogenizar y dejar
solidificar (etiquetar con el volumen utilizado).
3. En una caja de Petri estéril, verter aproximadamente 20 mL del medio agar
cuenta estándar, fundido y enfriado a 45°C y dejar solidificar (control).
4. Incubar las cajas invertidas a 35°C + 0.5 °C durante 24 horas y contar las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada una de ellas.

• Extendido (cuenta en placa) con muestra compleja

1. Utilizar agua de lavado de cilantro o con un poco de suelo.
2. Por lado de mesa: realizar 5 diluciones decimales en tubos con 9 mL de SSI.
3. Transferir con una pipeta estéril 0.1mL (100 µL) de la dilución 10-4 (1:10 000) en
una caja de Petri con agar enriquecido.
4. Extender con una varilla de vidrio el “L” esterilizada por incineración.
5. Repetir la inoculación y extendido con la dilución 10-5 (1:100 000).
6. Incubar las cajas invertidas a 35°C + 0.5 °C durante 24 horas y contar las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada una de ellas.

• Filtración (cuenta en placa)

1. Etiquetar la caja de agar ENDO y la caja NKS (Kits Microbiológicos Sartorius)
para Escherichia coli y coliformes (mFC o Teepol).
http://www.mercofras.com/images/35f90-Microbiologia-SistemasRapidos.pdf
2. Humedecer la almohadilla de la caja NKS con 2.5 a 3 mL de agua destilada o
SSI estéril.
3. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En
condiciones de asepsia instalar el equipo Millipore estéril. Antes de instalar el
vaso y las pinzas de pato, colocar una membrana de 0.45 µm estéril sobre la
base del filtro conector. Las pinzas de punta roma se esterilizan con alcohol y
a la flama antes de tomar la membrana.
4. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido de la muestra (100
mL), si presenta partículas en suspensión filtrar previamente con algodón y
gasa.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 10

 5. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que
hubo pasado todo el líquido, cerrar el vacío y retirar las pinzas de pato y el
vaso.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y transferir a la
superficie de la caja de Petri con Agar ENDO. Presionar ligeramente en la orilla
de la membrana para favorecer la adherencia de la misma.
7. Colocar una nueva membrana en el sistema y filtrar 100 mL del líquido con el
mismo procedimiento descrito anteriormente y transferir a la superficie de la
caja NKS.

8. Incubar las cajas (no invertir NKS) a 35°C + 0.5ºC durante 24 horas en
condiciones aeróbicas. En caso de que la placa NKS contengan medio mFC
incubar a 44.5ºC durante 48 horas
9. Contar el número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada una de
las cajas y calcular el número de bacterias en un mililitro.

• Número Más Probable (NMP)

20 mL a cada uno

Muestra
de hielo
Mezclar

Caldo Lauril Sulfato de Sodio Caldo Lauril Sulfato de Sodio

CLSS 3x CLSS 1x

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 11

• Vertido (cuenta en placa)

Vertido (duplicado)
Agar cuenta estándar

1 mL 0.1 mL

Muestra
de hielo

• Extendido (cuenta en placa) con muestra compleja

1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Muestra 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

compleja

0.1 mL

Extendido
Agar enriquecido

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 12

• Filtración (cuenta en placa)

Hidratar la placa con 3 mL

de agua estéril antes de
colocar la membrana

NKS E. coli y
coliformes
100 mL

Agar ENDO
Muestra de hielo

Registro de resultados

• Cuenta en placa

Muestra Técnica Dilución Volumen UFC Número de

empleado células/mL
Agua Vertido No 1000 µL
Cuenta estándar
Vertido No 100 µL
Cuenta estándar
Filtración ENDO No 100 mL
Filtración NKS* No 100 mL
Compleja Extendido 10-4 0.1 mL
enriquecido
Extendido 10-5 0.1 mL
enriquecido
*mFC o Teepol http://www.mercofras.com/images/35f90-Microbiologia-SistemasRapidos.pdf

3ª. Sesión

Número Más Probable

Materiales

• Por equipo:
1 mechero*
1 gradilla*
1 asa bacteriológica

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 13

• Medios de cultivo:
3 tubos de 16x150 de tapón de rosca con campana de Durham y 7 mL de BRILA
3 tubos de 16x150 de tapón de rosca con campana de Durham y 7 mL de EC
2 tubos de 13x100 con agar nutritivo inclinado (reactivar cepas)
1 caja con agar EMB o Tergitol 7

• Equipo:
4 cuenta colonias

Metodología

1. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

a. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva, a tubos que contiene caldo Verde Brillante Bilis Lactosa (BRILA),
con campana de Durham.
b. Mezclar suavemente los tubos e incubar a 35 ± 0.5°C durante 24 a 48 horas.
c. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación
de 24 a 48 horas.
d. Consultar la tabla de NMP correspondiente para conocer el número más
probable de organismos coliformes totales/100 mL.

2. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales

a. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva a tubos con caldo EC.
b. Mezclar suavemente los tubos e incubar a 44.5 ± 0.1°C durante 24 a 48 horas.

c. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez

(crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación
de 24 a 48 horas.
d. Consultar la tabla de NMP correspondiente para conocer el número más
probable de organismos coliformes fecales/100 mL.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 14

Muestra de hielo, 20 mL a cada tubo

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

35 ± 0.5°C

24 a 48 horas

Caldo Lauril Sulfato de Sodio Tubos positivos con

crecimiento y gas

1 3 4 1 3 4

Inocular de
tubo a
tubo con
tres asadas

Caldo Verde Caldo EC

brillante Bilis Lactosa
35 ± 0.5°C 44.5 ± 0.1°C
24 a 48 horas 24 a 48 horas

1 2 3 1 2 3

Tubos positivos con Tubos positivos con

crecimiento y gas crecimiento y gas
Coliformes totales Coliformes fecales

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 15

Registro de resultados e interpretación

• Número Más Probable (NMP)

Muestra _______________________________________________

Tubos positivos Número Más Probable /

100 mL
Prueba presuntiva ___
CLSS
Prueba confirmativa
Coliformes totales
Prueba confirmativa
Coliformes fecales

Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones
de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de
muestra de agua o hielo.

No. de Tubos 95% de Límite de Confianza

positivos NMP/100 mL (aproximado)
Inferior Superior
0 <1.1 0 3.0
1 1.1 0.05 6.3
2 2.6 0.3 9.6
3 4.6 0.8 14.7
4 8.0 1.7 26.4
5 >8.0 4.0 Infinito

Disposición de desechos

1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los

laboratorios.
2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una
solución sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y
colocarlos en un frasco con alcohol al 95 %.
3. Esterilizar los tubos y matraces, posteriormente retirar el medio estéril (agar)en
una bolsa, lavar y dejar secar al aire.
4. Las cajas de Petri desechables deberán atarse con masking en forma de cruz
y depositar en la bolsa o contenedor rojo para su incineración.
5. En el caso de ruptura de material, envolver los fragmentos con papel, esterilizar
el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 16

Cuestionario

1. ¿Cómo se prepara una curva de Mc Farland?

2. ¿Qué microorganismos corresponden al grupo coliforme? ¿Cuáles son sus
características?
3. Investiga la formulación y preparación de los siguientes medios de cultivo:
- Caldo EC
- Caldo Bilis Verde Brillante
- Caldo Lauril Sulfato de Sodio (CLSS)
- Teepol
- mFC

Vídeos
P8.Técnicas para la enumeración de microoganismos
https://amyd.quimica.unam.mx/course/view.php?id=57&section=8

ME1515 – 2023/2 - Práctica 10 - página 17