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BIOLOGÍA  PLoS

Genoma  mitocondrial  completo  y  filogenia  del  
mamut  del  Pleistoceno  Mammuthus  primigenius
Evgeny  I.  Rogaev1,2,3,4*,  Yuri  K.  Moliaka1,5,  Boris  A.  Malyarchuk6 ,  Fyodor  A.  Kondrashov7  , Miroslava  V.  Derenko6,
Ilya  Chumakov8 , Anastasia  P.  Grigorenko2,3
1  Instituto  de  Investigación  Neuropsiquiátrica  Brudnick,  Departamento  de  Psiquiatría,  Facultad  de  Medicina  de  la  Universidad  de  Massachusetts,  Worcester,  Massachusetts,  Estados  Unidos  de  América,
2  Laboratorio  de  Genética  Molecular  del  Cerebro,  Centro  de  Investigación  de  Salud  Mental,  Academia  Rusa  de  Ciencias  Médicas,  Moscú,  Rusia,  3  Facultad  de  Bioingeniería  y
Bioinformática,  Universidad  Estatal  Lomonosov  de  Moscú,  Moscú,  Rusia,  4  Instituto  Vavilov  de  Genética  General,  Academia  Rusa  de  Ciencias,  Moscú,  Rusia,  5  Investigación
Centro  de  Genética  Médica,  Academia  Rusa  de  Ciencias  Médicas,  Moscú,  Rusia,  6  Laboratorio  de  Genética,  Instituto  de  Problemas  Biológicos  del  Norte,  Academia  Rusa  de
Ciencias,  Magadan,  Rusia,  7  Sección  de  Ecología,  Comportamiento  y  Evolución,  Universidad  de  California  San  Diego,  La  Jolla,  California,  Estados  Unidos  de  América,  8  Serono  Genética
Instituto  SA,  Evry  Cedex,  Francia

Las  relaciones  filogenéticas  entre  el  extinto  mamut  lanudo  (Mammuthus  primigenius)  y  los  elefantes  asiáticos  (Elephas  
maximus)  y  de  la  sabana  africana  (Loxodonta  africana)  siguen  sin  resolverse.  Aquí,  informamos  la  secuencia  del  genoma  
mitocondrial  completo  (16.842  pares  de  bases)  de  un  mamut  lanudo  extraído  de  restos  conservados  en  permafrost  de  la  
época  del  Pleistoceno,  la  secuencia  del  genoma  mitocondrial  más  antigua  determinada  hasta  la  fecha.  Demostramos  que  
los  fragmentos  del  genoma  mitocondrial  bien  conservados,  de  hasta  1600­1700  pares  de  bases,  se  pueden  recuperar  de  
los  restos  anteriores  al  Holoceno  de  una  especie  extinta.  La  reconstrucción  filogenética  del  clado  Elephantinae  sugiere  que  
M.  primigenius  y  E.  maximus  son  especies  hermanas  que  se  separaron  poco  después  de  que  su  ancestro  común  se  separara  
del  linaje  L.  africana.  La  baja  diversidad  de  nucleótidos  encontrada  entre  secuencias  genómicas  mitocondriales  determinadas  
independientemente  de  mamuts  lanudos  separadas  geográficamente  y  en  el  tiempo  sugiere  que  el  noreste  de  Siberia  estuvo  
ocupado  por  una  población  relativamente  homogénea  de  M.  primigenius  a  lo  largo  del  Pleistoceno  tardío.
Cita:  Rogaev  EI,  Moliaka  YK,  Malyarchuk  BA,  Kondrashov  FA,  Derenko  MV,  et  al.  (2006)  Genoma  mitocondrial  completo  y  filogenia  del  mamut  del  Pleistoceno  Mammuthus  primigenius.  PLoS  Biol  4(3):  e73.

esta  filogenia,  pero  hasta  ahora  solo  se  han  recuperado  fragmentos  
Introducción
cortos  de  ADN  de  M.  primigenius.
Mammuthus,  Elephas  y  Loxodonta  (familia  Elephantidae,  
subfamilia  Elephantinae)  son  géneros  estrechamente  relacionados   Resultados/Discusión
que  evolucionaron  en  el  Plioceno  africano,  posiblemente  del  género  
Primelephas  [1–4].  El  mamut  lanudo  Mammuthus  primige  nius  se   La  pata  de  mamut  lanudo  con  músculo  intacto  y  tejido  de  la  piel  
extinguió  en  la  mayor  parte  de  su  área  de  distribución  anterior  junto   se  encontró  en  el  valle  del  río  Enmynveem  (Chukotka)  en  el  noreste  
con  otra  megafauna  del  Pleistoceno  tardío,  aunque  pequeñas   de  Siberia  en  1986  (Figuras  1  y  S1).  Desde  entonces,  los  
poblaciones  aisladas  de  mamut  sobrevivieron  hasta  mediados  del   especímenes  musculares  recolectados  del  mamut  (en  adelante  
llamado  Enmyn)  se  mantuvieron  congelados.  El  método  de  
Holoceno  [5].  La  filogenia  de  Elephantinae  no  se  ha  resuelto.  Los  
radiocarbono  fechó  los  especímenes  entre  33,750  y  31,950  años  AP  (antes  del  pr
análisis  morfológicos  han  arrojado  filogenias  contradictorias  para  M.  
Un  examen  inicial  sugirió  que  el  tejido  blando  estaba  notablemente  
primigenius,  Elephas  maximus  y  Loxodonta  africana  [1–4].  Los  
bien  conservado,  y  no  se  notaron  signos  de  descomposición  del  
caracteres  dentales  sugieren  una  relación  más  cercana  entre  M.  
tejido  cuando  se  excavó  el  espécimen  del  permafrost.  Debido  a  que  
primigenius  y  E.  maximus,  la  morfología  de  la  punta  del  tronco  apoya  
no  se  observaron  daños  en  los  tejidos  por  insectos  u  otros  animales,  
una  agrupación  de  M.  primigenius  y  L.  africana,  y  los  caracteres  
se  presume  que  los  restos  se  enterraron  rápidamente  y  nunca  se  
inmunológicos  y  de  estructura  del  cabello  no  pudieron  resolver  con   descongelaron.  Las  células  con  núcleo  se  observaron  en  epitelio  y  
seguridad  la  filogenia  de  estos  tres  taxones  [1–4 ].
tejido  muscular.  El  tratamiento  con  DAPI  tiñó  eficientemente  los  
Los  análisis  moleculares  también  han  generado  conclusiones  
núcleos,  indicando  la  existencia  de
contradictorias  [1–4].  Los  datos  sobre  secuencias  cortas  de  ADN  
mitocondrial  (ADNmt)  han  respaldado  de  diversas  formas  un  clado  
monofilético  de  las  especies  de  elefantes  existentes,  han  agrupado   Editor  académico:  David  Penny,  Massey  University,  Nueva  Zelanda

a  M.  primigenius  con  E.  maximus  [6]  o  L.  africana  [7–9],  o  no  han   Recibido  el  7  de  diciembre  de  2005;  Aceptado  el  10  de  enero  de  2006;  Publicado  el  7  de  febrero  de  
2006
sido  concluyentes  [10].  ,11].  Las  modificaciones  de  la  plantilla  de  
ADN  causadas  por  oxidación  o  hidrólisis  son  una  fuente  potencial   DOI:  10.1371/[Link].0040073

de  mutaciones  artificiales  y  pueden  explicar  en  parte  el  alto   Derechos  de  autor:  2006  Rogaev  et  al.  Este  es  un  artículo  de  acceso  abierto  distribuido  bajo  los  
polimorfismo  observado  inicialmente  para  algunas  secuencias  cortas   términos  de  la  licencia  de  atribución  de  Creative  Commons,  que  permite  el  uso,  la  distribución  y  la  
reproducción  sin  restricciones  en  cualquier  medio,  siempre  que  se  acredite  al  autor  original  y  la  fuente.
de  ADN  de  mamut,  aunque  los  pseudogenes  de  origen  mitocondrial  
ubicados  en  el  genoma  nuclear,  que  son  comunes  en  los  elefantes,  
Abreviaturas:  pb,  par  de  bases;  ML,  máxima  verosimilitud;  ADNmt,  mitocondrial
también  pueden  ser  un  factor  potencial  [10].  Un  metanálisis  que  tuvo   ADN;  núm,  ADN  mitocondrial  nuclear;  UMASS  MS,  Universidad  de  Massachusetts
en  cuenta  la  secuenciación  potencial  y  otros  errores  favoreció  a  M.   Escuela  de  Medicina;  VNTR,  número  variable  de  repeticiones  en  tándem

primigenius–L.  clado  africana  [9].  Claramente,  es  necesario  un   *
A  quién  debe  dirigirse  la  correspondencia.  Correo  electrónico:  [Link]@
análisis  completo  de  secuencias  genómicas  más  largas  para  resolver [Link]

PLoS  Biología  |  [Link] 0403 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73

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Genoma  mitocondrial  completo  de  mamut

Se  utilizaron  extractos  de  ADN  de  tejido  muscular  de  mamut  para

generar  productos  de  PCR  y  reconstruir  el  genoma  mitocondrial  
completo  en  Moscú  (''MOS  contig'',  completado  en  2000)  e,  
independientemente,  en  los  laboratorios  de  la  Facultad  de  
Medicina  de  la  Universidad  de  Massachu  setts  (UMASS  MS)  (''UM  
contig'',  completado  en  2005)  (ver  Materiales  y  Métodos).  No  se  
encontró  contaminación  por  ADN  extraño  en  múltiples  experimentos  
de  PCR.  Aparte  de  un  número  variable  de  repeticiones  en  tándem  
(VNTR)  en  la  región  de  control  caracterizada  por  una  alta  
hipervariabilidad  somática,  las  secuencias  de  mtDNA  obtenidas  de  
diferentes  extractos  y  diferentes  laboratorios  coincidieron
Figura  1.  Pata  trasera  derecha  del  mamut  lanudo  (M.  primigenius) exactamente.  Esta  precisión  se  logró  con  el  siguiente  protocolo.  (I)  
Encontrado  en  siberia Se  diseñaron  y  probaron  cebadores  de  oligonucleótidos  
El  fragmento  de  cuerpo  de  mamut  bien  conservado  con  pie  (33  3  36  cm),  espinilla  y   redundantes  para  producir  una  cantidad  suficiente  de  productos  de  
articulación  del  tobillo  (la  longitud  total  es;  88  cm)  se  encontró  en  el  valle  del  río  
PCR  (Figuras  S2–S4  y  Tabla  S1).  Se  realizaron  pruebas  
Enmynveem  (noreste  de  Siberia,  Chukotka).  El  material  tisular  (huesos,  músculos  y  
piel)  no  tenía  marcas  visibles  de  daño  tisular  por  insectos  u  otros  animales.  La   preliminares  con  estos  cebadores  para  demostrar  la  aplicabilidad  
datación  por  radiocarbono  de  la  piel  y  el  tejido  muscular  determinó  que  el  mamut   de  los  extractos  de  ADN  para  PCR.  Encontramos  consistentemente  
vivió  hace  32  850  6  900  años  [12]. una  recuperación  eficiente  de  al  menos  fragmentos  de  PCR  de  
DOI:  10.1371/[Link].0040073.g001
500  a  700  pb  de  extractos  de  ADN  de  mamut.  Además,  la  PCR  de  
secuencias  de  genes  completas  de;  1200–1700  pb  también  fue  
ADN  genómico  bien  conservado  (Figura  2A).  Hasta  donde   eficiente,  pero  la  secuencia  de  mtDNA  de  más  de  3000  pb  no  fue  
sabemos,  este  es  el  primer  núcleo  detectable  citogenéticamente   amplificable  (Figura  2C  y  2D  y  Métodos  y  materiales).  Los  datos  
documentado  con  ADN  genómico  en  un  tejido  tan  antiguo  (.30,000  años   AP).consistentes  con  una  excelente  conservación  junto  con  cierta  
son  
De  acuerdo  con  estas  observaciones  primarias,  se  extrajo  y   degradación  debido  al  antiguo  origen  del  ADN.  (II)  La  gran  cantidad  
detectó  una  cantidad  sustancial  de  ADN  genómico  en  un  gel  de   de  ADN  nos  permitió  obtener  productos  de  PCR  suficientes  para  
electroforesis.  Aunque  aparentemente  el  ADN  extraído  se  degradó,   la  secuenciación  después  de  la  primera  ronda  de  reacción  de  PCR  
todavía  es  de  una  calidad  y  cantidad  notables.  Por  ejemplo,  la   y  minimizó  el  riesgo  de  que  surgieran  errores  de  secuencia  debido  
fracción  principal  de  fragmentos  de  ADN  de  un  extracto  (que  se   al  cambio  de  plantilla  durante  la  PCR,  debido  a  la  baja  cantidad  de  
muestra  en  la  Figura  2B)  osciló  entre  100  pares  de  bases  (pb)  y   plantillas  de  ADN  originales  [13  ,14].  (III)  La  secuenciación  directa  
600  pb,  con  cantidades  decrecientes  a  pesos  moleculares  más   de  los  productos  de  PCR  proporcionó  lecturas  de  cromatograma  
altos.  El  ADN  microbiano  puede  contribuir  potencialmente  a  la   limpias  (Figura  S5).  En  todos  los  casos,  la  replicación  de  la  
fracción  de  ADN  de  alto  peso  molecular.  Sin  embargo,  el  análisis   secuenciación  en  cada  posición  de  nucleótido  se  realizó  a  partir  de  
de  PCR  que  se  describe  a  continuación  (Figura  2C  y  2D)  respalda   diferentes  productos  de  PCR  utilizando  los  protocolos  descritos  en  
la  afirmación  de  que  este  gigantesco  espécimen  contiene  ADN   Materiales  y  Métodos.  Además,  se  clonaron  los  productos  de  la  
preservado.  La  replicación  independiente  en  el  análisis  de  PCR  es   PCR  y  también  se  secuenciaron  los  clones  independientes.  Como  
absolutamente  imprescindible  para  el  estudio  del  ADN  antiguo.   era  de  esperar,  los  fragmentos  de  mtDNA  clonados  ocasionalmente  
Por  lo  tanto,  se  obtuvieron  varios  extractos  de  ADN  de  las  muestras   contenían  mutaciones  aleatorias  con  una  tasa  promedio  de  6/1000  
de  tejido  para  el  análisis  del  genoma  mitocondrial. pb.  No  se  identificaron  secuencias  clonadas  con  conjuntos  idénticos  
Es  importante  destacar  que  la  replicación  en  este  estudio  no  se   de  mutaciones.  Estas  modificaciones  de  secuencia  fueron  en  su  
limitó  a  regiones  seleccionadas  del  genoma  mitocondrial,  y  todo  el   mayoría  transiciones  correspondientes  a  mutaciones  de  tipo  I  (A!G/
genoma  mitocondrial  se  secuenció  por  duplicado.  Diferente T!C)  y  tipo  II  (C!T/G!A),  que  se  habían  detectado  previamente  en  ADN  antiguo  (F

Figura  2.  Núcleos  de  ADN  de  mamut  excepcionalmente  bien  
conservados  (A)  con  ADN  claramente  detectable  mediante  tinción  DAPI  en  células  musculares  de  M.  primigenius  de  33  000  años  de  edad.  (B)  ADN  genómico  total  aislado  del  
tejido  muscular  de  mamut  (el  carril  1  es  una  dilución  1/10  del  ADN  en  el  carril  2);  ADN  de  control  de  muestras  de  sangre  humana  fresca  en  los  carriles  3  y  4.  (C)  Ejemplos  de  
productos  de  PCR  (;300–600  pb)  para  el  genoma  mitocondrial  de  mamut.  (D)  La  amplificación  por  PCR  recupera  secuencias  largas  para  genes  mitocondriales  completos  (1317  
pb  CytB  y  1613  pb  genes  ATP6),  pero  falla  la  PCR  de  fragmentos  más  grandes  (3054  pb  ND5).
DOI:  10.1371/[Link].0040073.g002

PLoS  Biología  |  [Link] 0404 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73

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Genoma  mitocondrial  completo  de  mamut

Como  se  describió  anteriormente  para  el  ADN  antiguo,  las  mutaciones  de  
tipo  II  predominaron  en  las  secuencias  de  ADNmt  de  mamut  clonadas  
(0,70  %).  Las  modificaciones  de  secuencia  no  fueron  detectables  en  
secuencias  de  productos  de  PCR  directas  de  la  misma  región  (Figura  
S5).  Los  datos  indican  que  las  mutaciones  en  el  ADN  clonado  fueron  
aleatorias  y  raras  en  cada  sitio  de  las  moléculas  individuales.  No
se  encontró  contaminación  con  ADN  mitocondrial  nuclear  (numt)  para  
cualquier  producto  de  PCR  de  ADN  de  mamut  (Materiales  y  Métodos).  La  
secuenciación  directa  de  múltiples  productos  de  PCR  y  clones  
independientes  proporcionó  evidencia  de  una  reconstrucción  precisa  de  
la  secuencia  del  genoma  mitocondrial  auténtico  de  M.  primigenius.

La  secuencia  de  la  región  pequeña  (VNTR)  en  la  región  de  control  
(bucle  D)  no  pudo  determinarse  mediante  la  secuenciación  directa  de  
los  productos  de  la  PCR.  Por  lo  tanto,  se  llevó  a  cabo  el  análisis  de  los  
fragmentos  de  PCR  clonados.  El  análisis  de  secuencias  demostró  
heteroplasmia  somática  y  heterogeneidad  de  alto  peso  molecular  en  
esta  región.  La  heterogeneidad  resultó  de  la  hipervariabilidad  en  varias  
repeticiones  en  tándem  de  hexanucleótidos  cortos  (CGCATA)  n  que  se  
asemejan  a  VNTR  (Figura  S4).
También  se  encontró  un  VNTR  similar  en  la  región  de  ADNmt  de  control  
en  Loxodonta  y  Elephas.
Para  determinar  la  historia  evolutiva  del  mamut  lanudo,  secuenciamos  
genomas  mitocondriales  completos  de  L.  africana  y  E.  maximus.  Para  
excluir  la  posibilidad  de  contaminación  del  ADN,  las  muestras  de  elefante   Figura  3.  Genoma  mitocondrial  del  mamut  lanudo  M.  primigenius  El  genoma  

se  obtuvieron  solo  después  de  completar  la  secuencia  del  genoma   mitocondrial  completo  se  determinó  de  forma  independiente  en  dos  laboratorios  
diferentes  utilizando  diseños  con  múltiples  cebadores  para  fragmentos  de  PCR  
mitocondrial  primario  de  M.  primigenius  (Materiales  y  Métodos).  La  PCR   superpuestos  que  oscilaron  entre;  325  y;  650  pb;  los  fragmentos  de  PCR  más  largos  
de  largo  alcance  se  usó  inicialmente  para  la  amplificación  de  fragmentos   también  se  produjeron  y  secuenciaron.  Los  productos  de  PCR  superpuestos  
superpuestos  de  ADNmt  de  3–5  kb  de  elefantes  africanos  y  asiáticos.  El   utilizados  para  la  secuenciación  y  la  clonación  se  muestran  en  el  círculo  interior.
Solo  se  muestran  los  fragmentos  de  PCR  producidos  a  partir  de  diferentes  pares  de  cebadores.
análisis  de  secuencia  también  se  realizó  para  fragmentos  de  PCR  
Dos  genes,  ATP6  y  ND4L,  se  superponen  con  genes  vecinos.
clonados  y  fragmentos  de  PCR  cortos  como  se  describe  en  el  análisis  de   DOI:  10.1371/[Link].0040073.g003
ADNmt  de  mamut.  Los  genomas  mitocondriales  de  E.  maximus  y  L.  
africana  secuenciados  en  este  estudio  fueron  muy  similares  pero  no  
Los  genomas  secos  de  los  taxones  existentes  más  cercanos  [16],  el  
idénticos  a  los  enviados  a  GenBank.
dugongo  (Dugong  dugon)  y  el  hyrax  (Procavia  capensis),  se  utilizaron  
como  grupos  externos.  La  misma  topología  se  recuperó  mediante  una  
previamente.
variedad  de  métodos  de  reconstrucción  de  árboles  (Figura  4).  Como  era  
Al  igual  que  en  otros  mamíferos  placentarios,  el  genoma  mitocondrial  
de  esperar,  individuos  de  la  misma  especie,  E.  maximus  y  L.  africana,  se  
del  mamut  contiene  13  genes  que  codifican  proteínas,  22  genes  de  ARNt  
agruparon  en  el  árbol.  Se  determinó  que  M.  primigenius  era  una  especie  
y  dos  de  ARNr,  y  la  región  de  control  del  bucle  D  (Figura  3).  La  longitud  
hermana  de  E.  maximus,  es  decir,  el  mamut  lanudo  compartía  un  ancestro  
del  genoma  varió  debido  a  la  variabilidad  somática  de  las  repeticiones  de  
común  con  el  elefante  asiático  más  recientemente  que  con  el  elefante  
ADN  en  tándem  (CGCATA)n  en  la  región  de  control.  La  longitud  del  
africano.  Una  prueba  de  relación  de  máxima  verosimilitud  (ML)  que  
genoma  mitocondrial  del  mamut  fue  de  16  842  pb,  si  se  incluía  el  tracto  
compara  las  tres  posibles  topologías  de  las  especies  de  Elephantinae  
VNTR  más  largo  (Figura  S4).  Los  codones  de  inicio  y  finalización  fueron  
corrobora  esta  conclusión  (p,  0,01;  consulte  Materiales  y  métodos).  
idénticos  en  M.  primigenius,  L.  africana  y  E.  maximus;  sin  embargo,  
También  reconstruimos  la  filogenia  de  estas  especies  utilizando  solo  
encontramos  una  sustitución  (G!A)  en  el  gen  ND4  que  conduce  a  un  
proteínas  individuales  y  genes  de  ARNr  (los  genes  de  ARNt  son  
codón  de  parada  prematuro  en  el  extremo  C  de  la  proteína.  Por  lo  tanto,  
demasiado  cortos  y  contienen  muy  pocas  sustituciones).  La  mayoría,  
la  proteína  ND4  es  cuatro  aminoácidos  más  corta  en  M.  primigenius  que  
en  elefantes.  Una  alineación  múltiple  de  este  gen  mostró  que  el  extremo   pero  no  todos  (Tabla  S3),  de  los  árboles  reconstruidos  con  la  secuencia  
C­terminal  de  la  proteína  ND4  es  variable  en  secuencia  y  longitud  en   de  genes  individuales  apoyaron  la  topología  recuperada  usando  el  
otras  especies  animales.  Las  sustituciones  en  el  linaje  de  los  mamuts   genoma  completo.  Aunque  la  topología  de  este  árbol  parece  robusta,  la  
fueron  predominantemente  transiciones  (relación  de  transversión/ falta  de  disponibilidad  de  un  grupo  externo  más  estrechamente  relacionado  
transición  de  19/339  en  mamuts  versus  13/351  en  E.  maximus  cuando que  el  dugongo  y  el  hyrax  exige  la  secuenciación  de  genes  nucleares  de  
M.  primigenius  para  probar  más  los  resultados  informados  aquí.
polarizado  con  L.  africana).  El  número  total  de  diferencias  de  nucleótidos  
y  aminoácidos  entre  el  mamut  y  E. La  resolución  de  la  filogenia  de  Elefantinae  permite  estimar  el  tiempo  
maximus  fue  722  y  100,  y  entre  los  genomas  de  mamut  y  L.  africana  780   de  divergencia  de  M.  primigenius  de  su  especie  hermana  E.  maximus.  
y  107,  respectivamente  (Tabla  S2). Tal  estimación  generalmente  se  basa  en  la  existencia  de  un  reloj  
molecular,  es  decir,  una  tasa  de  evolución  uniforme  de  todos  los  clados  
La  filogenia  de  Elephantinae  se  infirió  utilizando  las  secuencias  recién   comparados,  y  en  tener  puntos  de  calibración  del  registro  fósil.  Sin  
obtenidas  de  M.  primigenius,  E.  maximus  y  L.  africana,  y  otras  secuencias   embargo,  estudios  previos  sugirieron  que  la  evolución  de  los  genomas  
completas  del  genoma  mitocondrial  de  E.  maximus  y  L.  africana,  mientras   mitocondriales  de  Elephantinae  puede  ser  inconsistente  con  la  molec
que  la  mitocona

PLoS  Biología  |  [Link] 0405 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73

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Genoma  mitocondrial  completo  de  mamut

La  tasa  de  evolución  implícita  en  el  análisis  ML  debe  tratarse  con  
precaución.  Sin  embargo,  un  simple  ensayo  de  parsimonia  
corroboró  la  posibilidad  de  que  los  genomas  mitocondriales  de  
diferentes  especies  de  Elefantinas  evolucionen  a  diferentes  
velocidades  (Tabla  S4).  Una  estimación  de  ML  del  número  de  
sustituciones  por  linaje  arrojó  resultados  cuantitativamente  similares  (datos  no  pu
Estas  observaciones,  junto  con  informes  previos  [3,8],  implican  
que  la  suposición  de  un  reloj  molecular  puede  ser  inapropiada  al  
estimar  el  tiempo  de  divergencia  de  las  especies  de  Elephanti  nae.  
Por  lo  tanto,  utilizamos  un  procedimiento  heurístico  de  suavizado  
de  tasas  para  las  estimaciones  de  ML  [17],  que  tiene  en  cuenta  las  
diferentes  tasas  de  evolución  entre  las  diferentes  ramas  del  árbol.  
Utilizando  los  puntos  de  calibración  de  6  millones  de  años  para  E.  
maximus–L.  africana  y  65  millones  de  años  para  la  división  de  
Elephanti  dae–Sirenia  (ver  [8]  y  las  referencias  dentro),  el  tiempo  de  
divergencia  de  M.  primigenius  y  E.  maximus  se  estimó  en  4  millones  
de  años  atrás  (60,01  se).  Esta  estimación  debe  tratarse  con  cautela  
porque  se  basa  en  la  correcta  datación  paleontológica  de  E.  
maximus–L.  divergencia  africana.  Sin  embargo,  estos  datos  indican  
claramente  que  la  divergencia  del  mamut  lanudo  del  elefante  
asiático  ocurrió  poco  después  de  la  divergencia  de  su  linaje  
ancestral  de  los  elefantes  africanos.
Para  verificar  aún  más  la  precisión  de  nuestra  secuencia  e  
investigar  el  nivel  de  diversidad  de  nucleótidos  en  la  población  de  
mamuts  lanudos,  comparamos  nuestra  secuencia  con  las  secuencias  
más  largas  disponibles  del  genoma  mitocondrial  de  mamuts  de  
otros  individuos.  Dos  secuencias  del  gen  CytB  de  individuos  mamut  
encontrados  en  el  noreste  de  Siberia  (región  de  Mag  adan,  
Figura  4.  Árbol  Paenungulata  y  relación  filogenética  del  mamut  lanudo
Kirgilyakh  Creek  cerca  del  río  Kolima)  [18]  y  el  centro­norte  de  
Siberia  (valle  del  río  Pyasina  en  la  ínsula  de  Taimyr  Pen)  [19]  
El  análisis  de  secuencias  completas  de  mtDNA  ubica  a  M.  primigenius  con  E.   muestran  una  gran  similitud,  mientras  que  el  gen  12S  RNA  [19]  era  
maximus  en  el  árbol.  La  Sirenia  (D.  dugon)  y  Hyracoidea  (P.  capensis),  las  especies   idéntico  a  los  genes  correspondientes  en  nuestra  secuencia  del  
más  estrechamente  relacionadas  entre  los  taxones  existentes  con  Elephantinae,  se   genoma  mitocondrial  del  mamut  de  Chukotka  (Tabla  S5).  Todas  
tomaron  como  grupos  externos.  Los  valores  de  Bootstrap  y  las  probabilidades  
posteriores  se  calcularon  utilizando  un  enfoque  bayesiano  [29,31]  asumiendo  una  
estas  secuencias  se  recuperaron  de  muestras  de  músculo  
distribución  gamma  de  las  tasas  de  evolución  entre  sitios  con  un  modelo  reversible   enriquecidas  en  mtDNA  y,  por  lo  tanto,  muy  probablemente  no  
de  tiempo  general  (fuente  normal),  modelo  HKY  (negrita),  con  un  enfoque  de   tenían  contaminación  numt.  El  valle  del  río  Chukotka  Enmynveem  
parsimonia  (cursiva ),  y  por  unión  de  vecinos  (cursiva  y  negrita)  [28].  La  escala  es  de  
está  a  1.000  km  de  Kirgilyakh  Creek  ya  2.900  km  del  valle  del  río  
0,1  sustituciones  por  sitio.  En  el  análisis  se  utilizaron  los  genomas  mitocondriales  de  
M.  primigenius,  E.  maximus  A,  E.  maximus  B,  L.  africana  A,  L.  africana  B,  D.  dugon   Pyasina.  Los  datos  sugieren  una  diversidad  genética  relativamente  
y  P.  capensis. baja  de  linajes  maternos  de  mamut  en  una  población  de  mamut  
DOI:  10.1371/[Link].0040073.g004
que  se  extiende  por  un  vasto  territorio  en  el  norte  de  Siberia.  Dos  
estudios  recientes  también  han  demostrado  el  aislamiento  de  
ular  clock  [3,8],  por  lo  que  probamos  esta  posibilidad  usando   múltiples  fragmentos  de  ADN  de  mamut  [20,21].  En  un  informe,  se  
genomas  completos.  La  prueba  de  tasa  relativa  de  Tajima  no  mostró   aplicó  un  enfoque  novedoso  para  la  clonación  directa  y  la  
diferencias  en  la  tasa  de  evolución  de  diferentes  linajes  de   secuenciación  aleatoria  de  fragmentos  de  ADN  aleatorios.  El  
Elephantinae  (datos  no  publicados).  De  manera  similar,  una  prueba   conjunto  de  múltiples  fragmentos  correspondientes  a  la  secuencia  
de  razón  de  verosimilitud  no  rechazó  la  suposición  de  la  misma  tasa   del  genoma  mitocondrial  parcial  contenía  secuencias  con  mutaciones  
de  evolución  del  linaje  de  M.  primigenius  frente  al  de  E.  maximus   de  artefactos  de  ADN  antiguo  y  números  potenciales  y  aún  no  
utilizando  el  genoma  de  L.  africana  como  un  grupo  externo   puede  usarse  de  manera  confiable  para  el  análisis  comparativo  de  
(Materiales  y  Métodos).  Por  el  contrario,  se  rechazó  la  suposición   genomas  mitocondriales  completos  [21].  Otro  grupo  reportó  la  
de  un  reloj  molecular  cuando  se  realizó  la  prueba  de  razón  de   secuencia  completa  del  genoma  mitocondrial  [20]  de  un  mamut  
verosimilitud  en  simulaciones  que  incluían  una  comparación  de  M.   lanudo  de  ;12,170  años  que  fue  encontrado  en  la  región  de  
primigenius–E.  clado  maximus  con  el  linaje  L.  africana  cuando  las   Berelyekh  Yakutia  (708  359  N,  1458  009  E),  que  está  a  ;900  km  del  
especies  de  dugongo  y  hyrax  se  utilizaron  como  grupos  externos   valle  del  río  Enmynveem  ( 688  109  N,  1658  569  E).  Una  comparación  
(sin  reloj  molecular  LnL1  =  56661,45;  con  reloj  molecular  LnL2  =   de  los  dos  genomas  completos  reveló  un  patrón  de  gran  similitud  
56877,63;  p  0,01). con  la  diversidad  de  nucleótidos  del  0,3  %  (Tabla  S5).  Esta  
Los  análisis  de  reloj  molecular  son  muy  sensibles  a  la  distancia   diversidad  puede  ser  incluso  menor,  ya  que  pueden  existir  errores  
molecular  de  los  grupos  externos,  lo  que  puede  afectar  la  ubicación   de  secuencia  en  las  secuencias  del  genoma  recuperadas  de  
correcta  de  la  raíz.  Claramente,  el  dugongo  y  el  hyrax  no  son  grupos   especímenes  antiguos.  Cuando  las  diferencias  entre  los  dos  
externos  ideales  para  este  análisis,  ya  que  su  divergencia   genomas  mitocondriales  de  mamut  se  polarizaron  con  la  secuencia  
aproximada  de  nucleótidos  no  sinónimos  (dn)  con  la  especie  Ele   de  E.  maximus,  el  número  de  polimorfismos  específicos  de  
phantinae  es;  0.15  mientras  que  la  divergencia  de  nucleótidos   secuencia  para  la  secuencia  del  genoma  mitocondrial  determinado  
sinónimos  está  en  saturación  (ds;  1.2).  Así,  el  cambio  en  la aquí  fue  ligeramente  menor  (en  un  25  %)  que  en  la  secuencia  del  genoma  mitoco

PLoS  Biología  |  [Link] 0406 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73

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Genoma  mitocondrial  completo  de  mamut

estudio  [20].  La  secuencia  [20]  también  mostró  una  mayor  proporción   con  dispositivos  de  filtro  centrífugo  Centricon  YM  (con  filtro  Amicon).
La  calidad  del  ADN  se  analizó  mediante  electroforesis  en  agarosa  y  PCR.
de  sustituciones  no  sinónimas  a  sustituciones  sinónimas  en  los  
ADN  de  mamut.  En  primer  lugar,  se  utilizó  ADN  preparado  a  partir  de  diferentes  
genes  que  codifican  proteínas  y  un  mayor  número  de  sustituciones   muestras  y  mediante  diferentes  métodos  (métodos  de  extracción  a  base  de  sílice  y  
de  nucleótidos  en  todo  el  genoma  (transiciones  C!T/G!A)  que  a   fenol­cloroformo)  para  la  PCR  del  gen  CytB.  El  análisis  demostró  que  las  secuencias  
menudo  se  asocian  con  modificaciones  antiguas  del  ADN  (Tablas  S6  y  S7). de  varios  extractos  de  ADN  eran  idénticas  y  correspondían  a  las  secuencias  cortas  
informadas  anteriormente  para  el  gen  CytB  de  mamut.  Después  de  los  experimentos  
Aunque  estas  diferencias  no  fueron  estadísticamente  significativas,   preliminares,  se  eligió  una  longitud  promedio  del  producto  de  PCR  de  500  a  600  pb  
se  observó  una  gran  cantidad  de  sustituciones  no  sinónimas  en  el   para  determinar  la  secuencia  completa  de  ADNmt  de  M.  primigenius.  Para  diseñar  
gen  ND2  en  la  secuencia  [20],  pero  no  en  nuestra  secuencia  (Tabla   los  cebadores  de  PCR,  utilizamos  las  secuencias  del  genoma  mitocondrial  en  la  
base  de  datos  GenBank  disponible  en  ese  momento.  (Nota:  este  proyecto  se  lanzó  
S6).  La  posibilidad  de  que  estos  cambios  aparecieran  debido  a  una   en  enero  de  2000).  Cada  par  de  cebadores  se  colocó  sobre  la  alineación  de  los  
selección  positiva  en  uno  de  los  linajes  gigantescos  parece  muy   genomas  mitocondriales  de  L.  africana,  hipopótamo,  rinoceronte  y  burro.  Dimos  
poco  probable,  siendo  la  explicación  más  razonable  que  la  secuencia   preferencia  a  los  cebadores  ubicados  en  las  regiones  más  conservadoras  para  
mantener  el  número  de  nucleótidos  ambiguos  en  los  cebadores  de  oligonucleótidos  
del  genoma  de  [20]  puede  albergar  algunas  mutaciones  de  ADN  
diseñados  lo  más  pequeño  posible.
antiguas  post  mortem  (la  mayoría  de  las  mutaciones  no  sinónimas  
de  ND2  eran  C!T /GEORGIA).  Sin  embargo,  estos  artefactos   En  última  instancia,  para  amplificar  todo  el  genoma  mitocondrial  del  mamut,  se  
diseñaron  35  pares  de  cebadores  redundantes  que  producían  fragmentos  de  PCR  
parecen  ser  raros.  En  resumen,  las  secuencias  del  genoma  
superpuestos.
mitocondrial  determinadas  de  forma  independiente  de  animales  de   En  promedio,  la  longitud  de  las  secuencias  superpuestas  entre  los  fragmentos  de  
;33  000  años  (presente  estudio)  y  ;12  000  años  [20]  eran  muy   PCR  producidos  a  partir  de  diferentes  cebadores  fue  de  30  pb  (excluyendo  las  
secuencias  de  los  cebadores),  pero  en  algunos  casos  llegó  a  200  pb.  El  tamaño  
similares  y,  debido  a  algunos  errores  potenciales,  el  verdadero  nivel  
anticipado  de  los  fragmentos  de  PCR  osciló  entre  325  pb  y  650  pb  y  fue  de  929  pb  
de  mitocondria  la  variabilidad  de  nucleótidos  puede  ser  ligeramente  inferior  al  
para   0,3%.
la  región  VNTR.  Para  determinar  la  secuencia  completa  de  ADNmt  en  UMASS  
La  baja  diversidad  de  nucleótidos  de  la  secuencia  mitocondrial   MS,  se  diseñaron  oligonucleótidos  cebadores  adicionales  como  se  muestra  en  la  
del  mamut  (p ;  0,003;  Tabla  S5)  es  un  orden  de  magnitud  inferior  a   Tabla  S1.  En  promedio,  la  secuencia  de  mtDNA  estaba  cubierta;  nueve  veces  en  
MOS  contig  y ;  cinco  veces  en  UM  contig  por  secuenciación  de  diferentes  clones  y  
la  notificada  para  las  poblaciones  generales  de  L.  africana  (p ;  0,02)   productos  de  PCR.
[22]  y  E.  maximus  (p ;  0,017)  [23,24],  pero  similares  a  los  valores   El  número  total  de  nucleótidos  secuenciados  determinados  a  partir  de  dos  cadenas  
informados  para  poblaciones  selectas  de  L.  africana  (p ;  0,00084– complementarias  fue  de  240.094.  La  longitud  total  de  la  secuencia  superpuesta  
obtenida  a  partir  de  diferentes  cebadores  fue  de  al  menos  7000  pb.  Además,  pudimos  
0,027)  y  E.  maximus  (p ;  0,0024–0,0055)  [22–24].
producir  varios  fragmentos  de  PCR  grandes  (se  indica  la  longitud  de  la  secuencia  
Estos  datos  sugieren  que,  a  diferencia  de  los  elefantes  asiáticos  y   entre  los  cebadores  directo  e  inverso  y  la  región  del  genoma  mitocondrial  
africanos,  la  población  de  mamuts  no  ha  tenido  una  estructura  de   correspondiente):  L4­H5  968  pb  (ARNr  16S),  L6­H7  1061  pb  (ARNr  16S;  tRNA  Leu;  
ND1),  L8­H10  1642  pb  (o  1683  pb  con  cebadores)  (ND1;  tRNA  Ile,  Gln,  Met;  ND2;  
población  compleja  y  ha  tenido  una  diversidad  genética  relativamente  
tRNA  Trp,  Ala,  Asn),  L16­H18  1572  pb  (COX2;  tRNA  Lys;  ATP8 ;  ATP6;  COX3),  L24­
baja  en  los  linajes  mitocondriales,  al  menos  en  el  área  que  abarca   H26  1502  pb  (tRNA  Leu;  ND5),  L29­H31  1271  pb  (tRNA  Glu;  CYTB;  tRNAs  Thr,  Pro),  
miles  de  kilómetros  en  el  noreste  de  Siberia. L33­H35  1131  pb  (D­loop;  tRNA  Phe;  12S  rRNA )  que  cubría  los  fragmentos  de  PCR  
más  cortos.  No  se  encontraron  desajustes  en  las  secuencias  superpuestas  o  en  los  
La  secuenciación  adicional  de  los  genomas  mitocondriales  de  otros  
productos  de  PCR  independientes.
especímenes  de  mamut  puede  aclarar  la  diversidad  de  la  población  
de  mamuts  antiguos.
La  PCR  estándar  se  realizó  en  un  volumen  total  de  25  ll  que  contenían  1–2  U  de  
Las  reconstrucciones  filogenéticas  basadas  en  el  análisis  
ADN  polimerasa  Taq1  en  un  tampón  con  Tris­HCl  10  mM  (pH  8,3),  dNTP  0,25  mM  
completo  de  secuencias  mitocondriales  son  un  método  poderoso   (Gibco  BRL,  Gaithersburg,  Maryland,  Estados  Unidos),  0,2–2  mM  BSA,  1,5–2,5  mM  
para  determinar  la  relación  entre  taxones  o  incluso  especies  extintas   MgCl2,  20  pmol  de  cada  cebador  o  en  un  volumen  total  de  25  o  50  ll  que  contienen  
y  existentes  estrechamente  relacionadas,  como  se  demuestra  aquí   1–2  U  del  sistema  de  PCR  de  alta  fidelidad  PicoMaxx  (ADN  polimerasa  Taq2000,  
ADN  polimerasa  Pfu  clonada  y  factor  potenciador  de  la  polimerasa  ArchaeMaxx  en  
y  en  otros  lugares  [25].  Sin  embargo,  el  ADN  mitocondrial  y  nuclear   un  13  tampón  de  reacción  Picomaxx  [Stratagene,  La  Jolla,  California,  Estados  
puede  tener  una  historia  coalescente  diferente,  y  la  disociación   Unidos])  y  20  pmol  de  cada  cebador.  Las  condiciones  de  la  PCR  fueron  94  8C  
genómica  citonuclear  se  ha  descrito  recientemente  en  elefantes   durante  1–2  min,  seguidas  de  32–35  ciclos  de  94  8C  de  desnaturalización  durante  
30–40  s,  53–58  8C  recocido  durante  30–40  s  y  72  8C  extensión  durante  30  s  a  1  
africanos  de  bosques  y  sabanas  [26].  Dada  la  calidad  única  de  los   min.  Las  PCR  se  acompañaron  de  controles  negativos  que  contenían  las  soluciones  
especímenes  del  mamut  de  Enmyn,  es  posible  que  el  ADN  nuclear   de  reacción  sin  ADN  (Figuras  2  y  S2).  Descubrimos  que  algunos  extractos  de  ADN  
se  recupere  [21]  y  se  use  para  una  mayor  confirmación  de  la   tomados  en  alta  concentración  pueden  tener  efectos  inhibitorios  sobre  la  PCR.  La  
serie  de  diluciones  de  los  extractos  se  llevó  a  cabo  para  identificar  la  concentración  
topología  reconstruida  en  este  estudio.  Nuestros  datos  demuestran   óptima  de  ADN  suficiente  para  producir  productos  de  PCR  después  de  32  a  35  
que  se  puede  recuperar  ADN  genómico  de  muy  alta  calidad  a  partir   rondas.  No  fue  necesaria  la  reamplificación  por  PCR  secundaria.  Los  fragmentos  de  
de  restos  antiguos  de  la  era  del  Pleistoceno  y  que  la  secuenciación   PCR  se  analizaron  con  gel  de  agarosa  al  1,7  %–2  %  teñido  con  bromuro  de  etidio.  
Los  fragmentos  de  PCR  se  extrajeron  de  geles  de  agarosa  y  se  purificaron  mediante  
de  genomas  mitocondriales  completos  puede  conducir  a  
columnas  Qiagen.  Los  fragmentos  de  PCR  se  clonaron  en  vectores  pGEM­T  
reconstrucciones  filogenéticas  confiables  y  estudios  de  población   (Promega,  Madison,  Wisconsin,  Estados  Unidos),  y  los  fragmentos  de  PCR  y  los  
no  solo  para  las  especies  existentes,  sino  también  para  las  extintas. clones  con  insertos  se  sometieron  a  secuenciación  a  partir  de  cebadores  de  ADNmt  
o  cebadores  de  vector  SP6  y  T4  utilizando  el  kit  ABI  PRISM  BigDye  para  analizadores  
ABI.  siguiendo  las  instrucciones  del  fabricante  (Applied  Biosystems,  Foster  City,  
Materiales  y  métodos California,  Estados  Unidos).

Extracción  de  ADN  genómico.  El  análisis  microscópico  y  la  tinción  con  DAPI  de  
las  células  demostraron  la  conservación  del  ADN  en  las  muestras  de  mamut.  El  ADN  
genómico  se  extrajo  de  los  especímenes  de  mamut  muscular  utilizando  métodos  de   ADN  de  elefantes  asiáticos  y  africanos.  Las  muestras  de  sangre  de  L.  africana  A  
extracción  a  base  de  sílice  y  fenol­cloroformo,  pero  el  método  de  fenol­cloroformo   y  E.  maximus  A  (originarias  de  Birmania)  se  utilizaron  para  la  extracción  de  ADN  
fue  más  eficiente  al  extraer  grandes  cantidades  de  ADN.  Se  utilizó  el  siguiente   mediante  kits  de  Qiagen  (Valencia,  California,  Estados  Unidos)  para  ADN  en  sangre.  
protocolo  para  el  aislamiento  de  ADN  con  fenol­cloroformo.  El  ADN  se  extrajo  de  0,1– Inicialmente  usamos  PCR  de  largo  alcance  para  generar  segmentos  del  genoma  
0,4  g  de  tejido  muscular  en  una  solución  que  contenía  Tris­HCl  50  mM  (pH  8,0),   mitocondrial  de;  3,0–5,0  kb.  Además,  para  producir  fragmentos  de  PCR  más  largos  
NaCl  100  mM,  EDTA  10–25  mM,  SDS  al  1%–2%  y  al  menos  100  µg/ml  de  proteinasa   y  más  cortos,  la  serie  de  cebadores  se  usó  en  condiciones  de  PCR  como  se  describe  
K  durante  16–24  h  a  37  8C,  seguido  de  extracción  con  fenol­cloroformo.  La   anteriormente  y  en  la  Tabla  S1.  Se  secuenciaron  los  fragmentos  de  PCR  totales  y  
purificación  del  ADN  se  completó  por  precipitación  con  etanol  al  75%  o  por   algunos  fragmentos  de  PCR  clonados.  Tanto  en  L.  africana  como  en  E.  maximus,  
concentración raras  secuencias  no  coincidentes  obviamente  corresponden  a  inserciones  nucleares  
de  mito

PLoS  Biología  |  [Link] 0407 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73

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Genoma  mitocondrial  completo  de  mamut

Se  encontraron  secuencias  condriales.  Estos  números  divergentes  se  encontraron   estructura  siempre  que  sea  posible.  Debido  a  una  alineación  incierta  en  la  región  
cuando  se  usaron  algunos  pares  de  cebadores  para  PCR  de  largo  alcance  utilizando   variable  de  la  región  de  control,  esta  parte  del  genoma  (;500  pb)  se  excluyó  de  todos  
ADN  de  elefante  aislado  con  kits  de  Qiagen.  Estos  pares  de  cebadores  nunca  se   los  análisis.  La  alineación  resultante  (denominada  alineación  mitocondrial  completa  
han  utilizado  para  el  análisis  de  PCR  de  ADN  de  mamut.  El  ADN  de  mamut  también   en  todo  el  texto)  se  utilizó  para  todos  nuestros  análisis  filogenéticos  y  comparativos.  
se  aisló  de  tejido  muscular  que  tiene  una  proporción  relativamente  alta  de  ADNmt   Para  estimar  la  divergencia  de  nucleótidos  sinónimos  y  no  sinónimos,  se  utilizó  una  
con  respecto  al  ADN  nuclear.  Las  secuencias  de  números  de  elefante  se  eliminaron   alineación  concatenada  de  todos  los  genes  codificadores  de  proteínas,  y  dn
del  análisis  y  las  regiones  de  mtDNA  se  volvieron  a  secuenciar  utilizando  otros  
conjuntos  de  cebadores  y  productos  de  PCR.  Finalmente,  se  determinaron  las   y  los  valores  de  ds  se  estimaron  con  el  método  Pamilo­Bianchi­Li  implementado  en  
secuencias  completas  del  genoma  mitocondrial  a  partir  de  múltiples  productos  de   MEGA  [28].  Todos  los  análisis  realizados  con  el  alineamiento  mitocondrial  completo  
PCR  independientes.  La  comparación  de  las  secuencias  determinadas  en  este   se  repitieron  usando  el  alineamiento  concatenado  de  todos  los  genes  de  proteínas  
estudio  (animal  A)  con  las  secuencias  correspondientes  de  L.  africana  B  y  E.   y  ARN  (descartando  1000  pb  de  secuencia  no  transcrita),  y  todos  los  resultados  
maximus  B  del  GenBank  reveló  su  gran  similitud.  La  divergencia  de  las  secuencias   permanecieron  cualitativamente  sin  cambios.
de  estos  animales  probablemente  se  deba  a  polimorfismos.  Los  posibles  errores  de  
secuencia  en  las  secuencias  de  ADNmt  de  E.  maximus  y  L.  africana  del  GenBank   Para  reconstruir  la  topología  del  árbol,  se  utilizaron  métodos  de  parsimonia  y  de  
pueden  ser  motivo  de  preocupación.  Sin  embargo,  los  resultados  de  las   unión  de  vecinos  implementados  en  MEGA  [28]  con  parámetros  predeterminados  y  
reconstrucciones  filogenéticas  se  mantuvieron  cualitativamente  iguales   10 000  réplicas  de  arranque  [28–31].  La  inferencia  bayesiana  de  la  filogenia  se  
independientemente  de  qué  secuencias  se  usaron  (la  nuestra  o  la  de  GenBank)  en   realizó  con  MrBayes  [29]  con  dos  modelos  anteriores  diferentes:  el  modelo  General  
el  análisis  comparativo  con  la  secuencia  del  genoma  mitocondrial  de  mamut. Time  Reversible  [28,29]  y  el  modelo  HKY  [28,29],  que  estima  menos  parámetros  de  
velocidad.
Autenticación  de  secuencias.  El  trabajo  se  realizó  de  acuerdo  con  los  estándares   Ambos  modelos  se  ejecutaron  asumiendo  una  distribución  gamma  de  las  tasas  de  
comúnmente  aceptados  para  el  análisis  de  ADN  antiguo. sustitución  en  los  sitios  para  1  millón  de  iteraciones  (mcmc  ngen  ¼  1000000  en  
Se  tomaron  múltiples  medidas  para  excluir  la  contaminación,  posibles  cambios  en  el   MrBayes).  Los  árboles  filogenéticos  que  utilizan  secuencias  de  genes  individuales  
ADN  de  artefactos  específicos  de  las  muestras  post­mortem  o  la  inclusión  de  numts   se  probaron  con  la  inferencia  bayesiana  establecida  en  el  modelo  HKY  (Tabla  S3).  
en  la  secuencia  mitocondrial.  Las  medidas  se  resumen  a  continuación.  Se  extrajeron   Se  realizó  una  prueba  de  relación  de  ML  para  los  valores  de  ML  obtenidos  para  las  
grandes  cantidades  de  ADN  de  las  muestras  bien  conservadas.  La  secuenciación   posibles  topologías  de  las  tres  especies  de  Elephantinae.  La  topología  con  M.  
de  los  productos  de  PCR  obtenidos  después  de  la  primera  ronda  de  amplificación   primigenius  y  E.  maximus  como  especies  hermanas  tuvo  un  log  ML  de  42440,629,  
garantizó  que  no  surgieran  errores  de  secuencia  debido  a  la  baja  cantidad  de   en  comparación  con  42465,549  y  42456,866  para  la  topología  que  vincula  a  E.  
plantillas  de  ADN  originales  y  al  cambio  de  plantilla  durante  la  PCR.  La  secuencia  de   maximus  con  L.  africana  y  M.  primigenius  con  L.  africana,  respectivamente  (p ,  0,01 ;  
mtDNA prueba  de  relación  ML).  Los  puntajes  de  log  ML  informados  aquí  son  promedios  de  
Las  células  obtenidas  de  diferentes  extractos  de  ADN  fueron  idénticas.  El
puntajes  de  log  ML  obtenidos  para  10,000,000  de  iteraciones  del  programa  BEAST  
Se  determinaron  las  secuencias  completas  del  genoma  mitocondrial  en  la  replicación   [30]  y  ejecutado  bajo  el  modelo  HKY  [28,29]  con  topologías  de  árbol  establecidas.
en  dos  laboratorios  en  diferentes  países  en  diferentes  momentos.  Aparte  de  la  región  
VNTR,  las  dos  secuencias  del  genoma  mitocondrial  (contigs  MOS  y  UM)  eran   El  reloj  molecular  se  probó  con  la  prueba  de  razón  de  verosimilitud,  utilizando  las  
idénticas.  Se  tomaron  precauciones  estrictas  para  el  trabajo  de  PCR  con  ADN   puntuaciones  de  probabilidad  logarítmica  obtenidas  con  el  programa  baseml  en  
antiguo.  El  trabajo  en  el  laboratorio  de  Moscú  se  llevó  a  cabo  en  una  caja  estéril  
PAML  [32]  cuando  el  conjunto  de  datos  se  analizó  suponiendo  que  no  había  reloj  
especial  que  incluía  dos  habitaciones  diseñadas  para  la  irradiación  UV  durante  la   molecular  (reloj  ¼  0  en  baseml)  y  un  reloj  local  que  probó  la  diferencia  entre  las  
noche.  La  caja  donde  se  realizaba  el  trabajo  con  ADN  antiguo  estaba  separada  de  
especies  en  cuestión  (reloj  ¼  2  en  baseml).  Para  estimar  la  longitud  de  la  rama  para  
otras  salas  y  equipos  del  laboratorio.  La  PCR  y  la  electroforesis  siempre  se  realizaron  
sustituciones  sinónimas  y  no  sinónimas,  se  asumió  que  las  ramas  de  interés  tenían  
en  salas  separadas.  Nunca  se  había  realizado  ningún  trabajo  con  ADN  animal  en   diferentes  proporciones  dn/ds  (modelo  ¼  2  en  codeml)  y  la  ausencia  de  un  reloj  
este  laboratorio  antes  de  este  proyecto. molecular  (reloj  ¼  0  en  codeml).  Para  estimar  el  tiempo  de  divergencia  de  M.  
primigenius,  se  utilizó  un  procedimiento  heurístico  de  suavizado  de  tasas  para  
El  trabajo  en  UMASS  MS  se  realizó  en  un  nuevo  laboratorio  utilizando  equipos  
estimaciones  de  ML  [16]  tal  como  se  implementó  en  PAML  [32].  El  número  de  
novedosos,  pipetas,  estación  de  PCR  y  espacio  que  nunca  antes  se  había  utilizado  
sustituciones  sinónimas  y  no  sinónimas  (Tabla  S4)  se  obtuvo  por  parsimonia  
para  el  análisis  de  ADN.  No  se  había  realizado  ningún  trabajo  de  ADN  con  elefantes  
utilizando  el  elefante  africano  como  grupo  externo  para  la  comparación  entre  mamut  
en  los  laboratorios  antes  de  que  se  determinara  la  secuencia  primaria  completa  de  
y  elefante  asiático  y  el  dugongo  como  grupo  externo  para  las  comparaciones  entre  
ADNmt  de  mamut.  No  hemos  encontrado  un  solo  caso  de  contaminación  por  ADNmt  
mamut  y  elefante  africano  y  asiático  y  elefante  africano  sin  corregir  por  múltiples  
de  no  mamut  (humano  o  animal)  en  productos  PCR  o  clones  en  Moscú  o  en  
sustituciones  y  con  la  suposición  de  que  el  exogrupo  se  parece  exactamente  al  
productos  UMASS  MS  PCR.  La  secuenciación  directa  de  productos  de  PCR  del  
estado  ancestral.  Estos  resultados  arrojados  fueron  cuantitativamente  muy  similares  
espécimen  de  mamut  mostró  cromatogramas  de  alta  calidad  comparables  a  la  
a  los  obtenidos  con  un  enfoque  ML  que  corrigió  sustituciones  múltiples  (no  publicado).  
secuenciación  de  ADN  clonado  (Figura  S5).  En  todos  los  casos,  la  replicación  de  la  
Los  archivos  de  control  para  todos  los  programas  independientes  ejecutados  aquí  y  
secuenciación  se  realizó  a  partir  de  diferentes  productos  de  PCR  y  clones  de  PCR.  
otros  materiales  metodológicos  están  disponibles  a  pedido.
Como  era  de  esperar,  los  fragmentos  de  mtDNA  clonados  ocasionalmente  contenían  
mutaciones  aleatorias,  transiciones  (A!G/T!C  o  C!T/G!A)  correspondientes  a  las  
documentadas  previamente  como  mutaciones  comunes  de  tipo  I  y  tipo  II  en  el  ADN  
antiguo.  Predominaron  las  mutaciones  tipo  II  (C!T/G!A)  (.70%).  Estas  mutaciones  se  
discriminaron  fácilmente  ya  que  estaban  ausentes  en  las  secuencias  de  los  productos   información  de  soporte
de  PCR  totales  y  otros  clones.  Como  paso  final,  las  secuencias  del  genoma  
mitocondrial  del  mamut  se  compararon  con  las  secuencias  GenBank  de  otros   Figura  S1.  Espécimen  de  mamut  encontrado  en  Siberia  (A)  
genomas  mitocondriales.  Como  informamos  en  nuestro  análisis  filogenético,  la  
Exhibición  restaurada  de  la  pata  de  mamut  Enmyn  encontrada  en  el  valle  del  río  
comparación  mostró  la  mayor  similitud  de  las  secuencias  de  mamut  con  las  
Enmynveem,  Chukotka,  noreste  de  Siberia.  (B)  La  ubicación  geográfica  del  hallazgo  
secuencias  de  ADNmt  de  L.  africana  y  E.  maximus,  incluso  cuando  se  incluyó  al  
pariente  más  cercano  (Sirenia)  en  la  comparación.  La  distribución  y  proporción  de   está  designada  por  el  punto  rojo  en  el  mapa.
sustituciones  sinónimas  a  no  sinónimas  en  la  secuencia  de  mamut  es  similar  a  la  
encontrada  en  los  linajes  Elephas  y  Loxodonta  y  mostró  una  alta  prevalencia  de   Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.sg001  (PDF  de  2,3  MB).
mutaciones  sinónimas.  No  se  encontraron  discrepancias  de  nucleótidos  en  múltiples  
regiones  superpuestas  determinadas  a  partir  de  fragmentos  de  PCR  independientes   Figura  S2.  Análisis  de  electroforesis  de  los  productos  de  PCR  utilizados  para  la  
(consulte  la  sección  anterior  ''ADN  de  mamut'').  Se  utilizó  una  muestra  de  músculo   secuenciación  del  genoma  mitocondrial  de  M.  primigenius  (''MOS  Mam  moth  
para  la  extracción  de  ADN.  Este  tipo  de  tejido  celular  está  particularmente  enriquecido   mtDNA'')
con  mitocondrias,  lo  que  proporciona  una  proporción  relativamente  alta  de  ADN   Paneles  de  gel  de  agarosa  A  y  B.
mitocondrial  versus  nuclear. Los  controles  negativos  se  muestran  en  (A).  *  designa  el  área  de  dímeros  de  
cebadores  de  oligonucleótidos  formados  en  la  PCR.
Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.sg002  (631  KB  PDF).
En  conjunto,  los  métodos  y  los  resultados  indican  que  es  poco  probable  que  la   Figura  S3.  Análisis  de  electroforesis  de  los  productos  de  PCR  utilizados  para  la  
contaminación  por  ADN  exógeno,  secuencias  numéricas  o  errores  de  secuenciación   secuenciación  del  genoma  mitocondrial  de  M.  primigenius  (''UM  Mammoth  mtDNA'')
sean  un  factor  en  nuestro  estudio  del  ADN  de  mamut  y  que  la  secuencia  de  ADNmt  
de  mamut  es  auténtica.
Paneles  de  gel  de  agarosa  A–D.  *  designa  líneas  con  baja  cantidad  de  productos  
Análisis  filogenético.  Se  realizó  un  alineamiento  múltiple  de  los  siete  genomas  
mitocondriales  completos  utilizando  el  programa  MUSCLE  [27]  y  se  comparó  con  la   PCR.
secuencia  de  aminoácidos  y  el  ARN  secundario. Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.sg003  (PDF  de  522  KB).

PLoS  Biología  |  [Link] 0408 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73

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Genoma  mitocondrial  completo  de  mamut

Figura  S4.  Heteroplasmia  extrema  en  la  región  hipervariable  HVR  (región  VNTR)  en   Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.st004  (26  KB  DOC).
la  región  de  control  del  genoma  mitocondrial  de  M.  primigenius  (A)  La  electroforesis  
de  los  productos   Tabla  S5.  Diversidad  de  nucleótidos  inferida  por  comparaciones  por  pares  de  
diferentes  secuencias  de  ADNmt  de  M.  primigenius  
de  PCR  de  dos  extractos  de  ADN  (m1  y  m22)  y  (B)  los  clones  de  PCR  
correspondientes  con  inserciones  de  ADNmt  de  la  región  VNTR  mostraron   Las  secuencias  se  informan  en  los  siguientes  estudios:  DQ316067  (estudio  actual),  
variabilidad  en  su  longitud.  (C)  Secuencias  de  nucleótidos  de  productos  PCR   NC_007596  [20],  D83047  [18]  y  D50841–D50842  [19].
clonados  con  VNTR.  La  secuencia  para  el  VNTR  más  largo  se  incorporó  en  una   Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.st005  (31  KB  DOC).
secuencia  completa  notificada  de  M.  primigenius.
Tabla  S6.  Sustituciones  no  sinónimas  y  sinónimas  específicas  del  genoma  inferidas  
por  comparaciones  por  parejas  de  genes  codificadores  de  proteínas  de  dos  genomas  
Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.sg004  (PDF  de  455  KB).
de  M.  primigenius  (DQ316067  frente  a  NC_007596)  y  secuencia  polarizada  con  E.  
Figura  S5.  Datos  de  electroforesis  de  secuenciación  para  el  genoma  mitocondrial  de   maximus  (DQ316068)  Se  observó  un  gran  número  de  sustituciones  no  sinónimas  
M.  primigenius  con  cromatogramas  de  alta  calidad  de  secuenciación  directa  de   en  el  gen  ND2  ( siete  mutaciones  no  sinónimas  frente  a  dos  sinónimas  en  NC_007596  
productos  de  PCR,  en  comparación  con  los  fragmentos  de  PCR  clonados  Se   acumuladas  en  una  región  corta  de  360  pb;  mientras  que  la  secuencia  DQ316067  
muestran  tres   determinada  en  este  estudio  tenía  cero  sustituciones  no  sinónimas  y  una  sinónima  
regiones  de  ADNmt:  (A)  L11­H11,  (B)  L17­H17,  y  C) en  el  mismo  gen).
L22­H22.  Las  líneas  1  y  2  (A)  y  la  línea  1  (B  y  C)  desde  abajo  son  los  productos  de  
PCR.  Otras  líneas  son  secuencias  clonadas  determinadas  a  partir  de  cadenas   Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.st006  (38  KB  DOC).
opuestas.  Las  raras  mutaciones  se  observan  en  secuencias  clonadas  pero  no  en  
secuencias  de  productos  de  PCR  directos. Tabla  S7.  Sustituciones  específicas  del  genoma  inferidas  por  comparación  por  
parejas  de  dos  genomas  de  M.  primigenius  (DQ316067  frente  a  NC_007596)  y  
Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.sg005  (PDF  de  503  KB).
secuencia  polarizada  con  E.  maximus  (DQ316068)  Mientras  que  las  sustituciones  
Figura  S6.  Comparación  de  secuencias  de  mtDNA  de  M.  primigenius  en C!T  y  G!A  pueden  ser  un  signo  de  modificación  del  ADN  antiguo  (más  frecuente  
Clones  individuales  y  productos  de  PCR  directa
mutaciones  de  tipo  II),  representan  también  polimorfismos  reales.  El  genoma  del  
Las  raras  mutaciones  aleatorias  del  "ADN  antiguo"  se  identificaron  en  secuencias   mamut  NC_007596  muestra  más  de  estas  sustituciones,  lo  que  sugiere  que  algunas  
clonadas.  No  se  encontraron  secuencias  con  series  idénticas  de  mutaciones  en   de  estas  sustituciones  pueden  haber  ocurrido  después  de  la  muerte  del  mamut  
clones  individuales,  lo  que  proporciona  evidencia  de  que  los  productos  de  PCR  se   muestreado;  sin  embargo,  esta  diferencia  no  es  estadísticamente  significativa  
obtuvieron  a  partir  de  la  cantidad  significativa  de  plantillas  de  ADN  originales.  Las   (prueba  exacta  de  Fisher  p .  0,05).
mutaciones  se  confirmaron  mediante  la  secuenciación  de  ambas  cadenas  de  ADN.  
Las  mutaciones  G!A  y  C!T  (mutaciones  de  tipo  II)  prevalecieron,  como  era  de  esperar   Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.st007  (25  KB  DOC).
para  las  modificaciones  del  "ADN"  antiguo.
Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.sg006  (PDF  de  22  KB). Números  de  acceso
Tabla  S1.  Cebadores  de  oligonucleótidos  y  fragmentos  de  PCR  previstos  utilizados   Los  números  de  acceso  de  GenBank  ([Link]
para  la  secuenciación  del  genoma  mitocondrial  completo  de  M.  primigenius,  E.   secuencias  completas  del  genoma  mitocondrial  determinadas  en  este  documento  
maximus  y  L.  africana  Se  utilizaron  cebadores   son  E.  maximus  (DQ316068),  L.  africana  (DQ316069)  y  M.  primigenius  (DQ316067). ).  
de  oligonucleótidos  redundantes  para  amplificar  el  ADN  de  mamut.  Las  secuencias   Los  números  de  acceso  de  GenBank  para  otras  secuencias  de  mtDNA  de  M.  
de  los  genomas  mitocondriales  de  E.  maximus  y  L.  africana  se  determinaron   primigenius  son  D83047  [18],  D50841–D50842  [19]  y  NC_007596  [20].  Los  números  
utilizando  tanto  fragmentos  de  PCR  de  largo  alcance  como  fragmentos  de  PCR   de  acceso  de  GenBank  para  los  genomas  mitocondriales  de  E.  maximus  y  L.  africana  
cortos. [33]  son  NC_005129  y  NC_000934,  respectivamente,  y  para  D.  dugon  y  P.  capensis  
son  NC_003314  y  NC_004919,  respectivamente.
Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.st001  (30  KB  DOC).

Tabla  S2.  Diferentes  tipos  de  sustituciones  reveladas  por  comparaciones  por  pares  
de  genomas  de  Elefantinae  Número  de  
Expresiones  de  gratitud
sustituciones  sinónimas  y  no  sinónimas  calculadas  con  el  método  modificado  de  Nei­
Gojobory  implementado  en  MEGA  [28];  los  resultados  fueron  independientes  de  la   Agradecemos  al  Museo  de  Historia  Natural,  Centro  de  Investigación  del  Noreste,  
relación  transición/transversión. Rama  del  Lejano  Oriente  de  la  Academia  Rusa  de  Ciencias  por  el  material  fotográfico  
Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.st002  (25  KB  DOC). de  la  pierna  de  M.  primigenius,  VA  Nikishina  por  el  material  gráfico  y  el  apoyo  técnico,  
YB  Yurov,  G.  Dvoryanchikov,  N.
Tabla  S3.  Inferencia  de  filogenia  bayesiana  [29]  de  Elefantinae  usando  codificación   Riazanskaya  y  T.  Kolesnikova  por  el  apoyo  técnico,  K.  Mehren  y  C.  Gray  por  los  
de  proteína  mitocondrial  única  y  genes  de  ARNr  Las  probabilidades   especímenes  de  elefantes  y  VY  Solovyev  por  la  ayuda  con  el  arte  de  las  imágenes  
posteriores  se  muestran  entre  paréntesis. de  animales.
Encontrado  en  DOI:  10.1371/[Link].0040073.st003  (26  KB  DOC). Contribuciones  de  autor.  EIR  concibió  y  diseñó  los  experimentos.  Oligonucleótidos  
diseñados  por  YKM  y  EIR.  EIR,  YKM  y  APG  realizaron  los  experimentos.  EIR,  YKM  
Tabla  S4.  Sustituciones  específicas  de  linaje  inferidas  por  comparaciones  por  pares   y  FAK  recolectaron  datos  y  los  analizaron.  BAM,  MVD  e  IC  contribuyeron  con  
de  genomas  de  Elefantinae  y  polarizados  con  un  grupo  externo  Usamos  las   reactivos/materiales/herramientas  de  análisis  y  realizaron  algunos  experimentos.  
secuencias   EIR,  FAK,  APG  y  YKM  escribieron  el  artículo.
de  E.  maximus  y  L.  africana  determinadas  en  este  estudio  para  estas  comparaciones.  
Las  comparaciones  por  pares  de  especies  de  Elephantinae  utilizando  un  solo  grupo   Fondos.  FAK  cuenta  con  el  apoyo  de  la  beca  de  investigación  para  graduados  de  
externo  para  polarizar  las  sustituciones  sugirieron  que  M.  primigenius–E.  El  clado   la  NSF.
maximus  evoluciona  más  rápido  que  el  linaje  L.  africana  tanto  en  sitios  sinónimos   Conflicto  de  intereses.  Los  autores  han  declarado  que  no  existen  intereses  
como  no  sinónimos. contrapuestos. &

Referencias   el  Elephantidae  utilizando  la  secuencia  de  ADN  fósil  del  mastodonte  americano  (Mammut  
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PLoS  Biología  |  [Link] 0409 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73

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Genoma  mitocondrial  completo  de  mamut

11.  Derenko  M,  Malyarchuk  B,  Shields  GF  (1997)  Secuencia  de  citocromo  b  mitocondrial  de   22.  Nyakaana  S,  Arctander  P,  Siegismund  HR  (2002)  Estructura  de  la  población  del  elefante  
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Anc  Biomol  1:  149–153. y  loci  de  microsatélites  nucleares.  Herencia  89:  90–98.
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PLoS  Biología  |  [Link] 0410 marzo  de  2006  |  Volumen  4  |  Número  3  |  e73