UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA
Curso:
Biología y Genética Molecular
Docente:
Johany Cecilia Sanchez Guillen
Estudiantes:
Alexia Castro Gomez
Gabriela Cornejo Cáceres
Leonardo Galdos Yto
Gabriela Mamani Ramos
AREQUIPA–PERÚ
2022
INFORME DE LA TÉCNICA DE PCR EN LA
ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
MARCO TEÓRICO
La enfermedad de Huntington es una patología neurodegenerativa de herencia
autosómica dominante, afecta el sist. nervioso central, principalmente a los núcleos
basales, se caracteriza por movimientos involuntarios, alteraciones psiquiátricas y
deterioro cognitivo. Tiene aparición tardía, penetrancia completa en portadores del
alelo mutado con 40 o más repeticiones del trinucleótido CAG, entonces todo aquel
que hereda el alelo desarrollará la enfermedad. La mutación se da cerca del extremo
5’, en el exón 1 del gen HTT localizado en el brazo corto del cromosoma 4 (4p16.3).
La expansión CAG se traduce en una proteína huntingtina defectuosa con un
segmento de poliglutaminas (poliQ) cercana al extremo amino terminal.
La PCR es el mejor método para calcular el número de repeticiones CAG; otros
métodos son ineficientes cuando la expansión del número de repeticiones es mayor.
Se amplifica ADN genómico, con buffer 10X, 2U de Taq polimerasa, agua y 0.5 µM
de cada uno de los iniciadores HD1 y HD3 , que amplifican selectivamente las
repeticiones CAG. Se lleva a cabo en un volumen de reacción de 25 µL. Se busca una
desnaturalización inicial del ADN seguida por una serie de ciclos. Finalmente un
período de extensión. Los productos se corren en el gel de agarosa. Sigue una
electroforesis para determinar el tamaño absoluto de los fragmentos que son vistos
con tinción con nitrato de plata. Los alelos son considerados normales cuando tienen
menos de 36 repeticiones y expandidos cuando contienen más de 40 CAG. Los alelos
que tienen de 36 a 39 repeticiones presentan penetrancia incompleta.
MÉTODO
1. Cuantificación y pureza del DNA:
Se realizó por espectrofotometría de masa a longitudes de ondas de 230, 260
y 280 nm (Epoch™ Micro-Volumen Spectrophotometer System, BioTek).
3.3. Modificación nucleotídica del DNA
2. Purificación del DNA modificado
La purificación se realizó con el kit de purificación Zymo Research cuya
finalidad es recuperar el DNA de la solución que contiene bisulfito. Para ello
se procedió de la siguiente manera:
A. Se agregó un volumen de 400 µl del buffer de protección a 100 µl de
solución modificadora que contiene el DNA modificado. Se mezcló por
vorteado (Mix 1).
B. Se armó el sistema de purificación que viene con el kit, colocando la
columna de purificación dentro de un micro tubo de 1.5 ml y agregando
la mezcla (Mix1) dentro de la columna de purificación.
C. Se centrifugó a 12 000 rpm por 30 segundos. Se descartó lo que se filtró
por la columna.
D. Se agregó 100 µl de Buffer de lavado a la columna de purificación.
Centrifugamos 12 000 rpm por 30 segundos
E. Se agregó 200 µl de buffer de desulfonación a la columna y se dejó
reposar por 15-20 minutos a temperatura entre 20°C - 30°C. Posterior a
la incubación, se centrifugó a 12 000 rpm por 30 segundos.
F. Se agregó 200 µl de buffer de lavado a la columna. Se centrifugó a 12
000 rpm por 30 segundos. Se agregó nuevamente 200 µl de buffer de
lavado y se centrifugó nuevamente por 30 segundos.
G. Se colocó la columna en un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se
añadió 10 µl de buffer de elución. Se centrifugó durante 30 segundos a
12.000 rpm para recuperar el DNA modificado.
H. El DNA fue almacenado a -20°C para su posterior uso.
3. Detección de impurezas por electroforesis
Para ello se sembró 2 µl de las muestras de DNA modificado y purificado con
2 µl de buffer de siembra. De la misma manera se tomó 2 ul de DNA
modificado y sin purificar y se le agregó 2 µl de buffer de siembra, realizando
una electroforesis en las mismas condiciones.
4. Generación de cebadores para la secuencia portadora de metilación en
el promotor (cebadores M)
Se generaron cebadores que hibriden en una región donde la secuencia
nucleotídica esté constituida por citosinas y uracilos (región promotora),
posteriores a la modificación química. Persisten citosinas pues en condiciones
normales la región promotora se encuentra metilada en el cromosoma X
inactivo. En el cromosoma X activo (no metilado), todas las citosinas han sido
cambiadas a uracilo y este cebador no se hibrida. Los cebadores así generados
flanquean la zona de metilación.
5. Generación de cebadores para la secuencia portadora del microsatelite
en la región 5’utr (cebadores T)
Se buscó generar cebadores que flanqueen la región 5’UTR que contiene
citosinas no metiladas, para esto utilizamos el mismo programa
MethPRIMER; en este programa se introdujo sólo la secuencia portadora del
microsatélite. Estos cebadores hibridan en la región 5’UTR no metilada,
donde todas las citosinas han sido cambiadas por uracilo. Igualmente, al
incluirse el ALELO EXPANDIDO 250 PB 62 REPETICIONES microsatélite
con el triplete CGG, estos cebadores nos van a permitir contar el número de
repeticiones.
6. Detección de la secuencia modificada del microsatélite y de la secuencia
de metilación por PCR.
Para verificar que hay presencia de metilación realizamos una PCR con los
cebadores M y para ver la presencia del microsatélite modificado y su tamaño,
realizamos otra PCR con los cebadores T. La PCR se realizó en un volumen
final de 20 µL con 0.65 U/µl de enzima Stofell, un tampón recomendado por
el fabricante, 200 µM de cada dNTP, 2mM de MgCl2, 0.4 µM de cada cebador
y 100 ng de DNA nuclear humano modificado. Los ciclos de temperatura
fueron: Denaturación inicial a 95°C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de 1
min de temperatura a 53°C para la reacción con los cebadores M y a 43 º C
para los cebadores N, 1 min de extensión a 72°C y una denaturación a 95°C
durante 1 min. Después de la reacciones de PCR, los productos fueron
separados por electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% y visualizados por
tinción de plata
RESULTADOS
Gel de electroforesis
Gráfico de regresión lineal con valores (peso molecular vs recorrido en gel)
Interpretación de resultados (tamaño de amplicón, número de repeticiones,
diagnóstico)
El tamaño de la expansión de la secuencia CAG se correlaciona con la edad de inicio y
gravedad de la enfermedad entonces a mayor tamaño de la expansión, la enfermedad se
inicia en edades más tempranas y es de progresión más rápida. El alelo expandido tiene
250 pb con 62 repeticiones. La cantidad de repeticiones CAG en los alelos mutados varía
en un rango de entre 42 a 55, con un promedio de 46.4 repeticiones CAG, siendo así el
alelo más común de 46 repeticiones. El paciente al mostrar el tamaño de amplicón y el
número de repeticiones respectivas se puede concluir que padece de la enfermedad de
Huntington.
CONCLUSIÓN
Se puede concluir que la técnica de PCR resulta muy eficiente para el diagnóstico de la
enfermedad de huntington, esta técnica de PCR cuenta un protocolo largo y complejo
que se debe realizar al pie de la letra para obtener resultados adecuados. También se debe
tomar en cuenta que la detección de la expansión trinucleotídica responsable de la
enfermedad por los métodos moleculares analizados, aunque factible, resulta aún
compleja y costosa. La búsqueda de un método de diagnóstico simple, económico y
seguro que permita identificar las amplificaciones de trinucléotidos y determinar con
certeza el estado mutacional de los individuos afectados, así como el de sus familiares,
aún no ha encontrado una respuesta adecuada en ninguno de los procedimientos
revisados.
