Genética de los microorganismos (2020) TP4
TP Nº4: Medios de cultivo
Genética de los Microorganismos
2016
Objetivos:
- Que los alumnos se familiaricen con los medios de cultivo utilizados más frecuentemente en el
estudio de los microorganismos.
- Que los alumnos adquieran las habilidades necesarias para la preparación de distintos medios de
cultivos líquidos y sólidos.
- Que los alumnos conozcan el procedimiento de plaqueo y armado de tubos rectos y en pico de flauta.
Actividades:
1.- Preparación del material:
1.1.- Limpieza del material a utilizar.
Lavar 2 erlenmeyer de 250 ml con detergente y cepillo. Enjuagar varias veces con agua corriente y
luego con destilada.
1.2.- Armado de tapones de algodón.
Proceder según indicaciones del docente, y practicar el armado de tapones hasta obtener un resultado
satisfactorio.
2.- Medios de cultivo.
2.1.-Caldo LB:
a.-Según la tabla de medios, pesar los reactivos y adicionarlos a un Erlenmeyer de 250ml.
b.-Agregar agua (no llevar a volumen final) y disolver con plancha térmica.
c.-Llevar a pH 7 con solución de NaOH (controlar con tiras de pH).
d.-Completar volumen a100ml.
2.2.-Agar LB:
a.- Preparar 250 ml de Caldo LB pH 7.
c.- Transferir a Erlenmeyer.
b- Pesar y agregar la cantidad de agar que corresponda.
El medio se prepara de manera diferente si se utilizará en tubos o en placas de Petri. En el caso de
los primeros, la esterilización se realiza con el agar en los tubos; en cambio las placas de Petri son
pre-esterilizadas antes de que el agar esterilizado se vierta en ellas.
3.- Armado de tubos (rectos e inclinados).
a.- Cada alumno trabajará con dos tubos, que deberá etiquetar como: “agar recto” y “agar inclinado”
b.- Cada tubo llevará 6 ml de agar nutritivo. Se parte del Agar preparado en el punto 2.2.
c.- Se agita el Erlenmeyer perfectamente para obtener una suspensión homogénea del agar aún no
disuelto.
d.- Con agitación continua para evitar la sedimentación del agar, se colocan 5 mL de medio en cada
uno de 14 tubos. ES IMPORTANTE QUE CADA VEZ QUE TOME MEDIO DEL MATRAZ AGITE
LA SUSPENSIÓN PARA EVITAR QUE EL AGAR SE DISTRIBUYA DE MANERA NO
HOMOGÉNEA.
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e.-. Se cierran los tubos de manera que no quede herméticamente cerrados para evitar que se
rompan por la presión del vapor.
f.- Se esterilizan en autoclave (Ver Punto 4)
f.-. Una vez estériles, se retiran los tubos del autoclave (cerrando la tapa si fuera a rosca) y se dejan
solidificar en una gradilla (agar recto) o inclinados en un ángulo aproximado de 10° (agar inclinado).
4.- Esterilización
a.- Cubrir los Erlenmeyer y tubos con los tapones (de algodón u otro material termoresistente) y papel
aluminio.
b.- Esterilizar en autoclave (15min, 121°C).
5.- Plaqueo (Armado de Placas de Petri)
Dejar enfriar el medio sólido (esterilizado) hasta 50 ºC aprox. En mesada bien limpia y junto al
mechero proceder al armado de las placas según demostración del docente.
3.- Almacenamiento.
Una vez enfriados a temperatura ambiente almacenar los medios de cultivo en heladera.
-Las placas se almacenarán invertidas (con el medio por arriba) de a grupos, envueltas en film.
Recordar rotular todo en forma correcta.
-Los tubos se almacenarán verticales en gradilla, con el tapón de algodón cubierto por film.
Nota: El film evita que se resequen los medios durante el almacenamiento en heladera.
Equipamiento y reactivos:
-Autoclave
-Guantes térmicos
-Heladera
-Mechero
-2 Erlenmeyer
-Probetas
-Placas de Petri (estériles)
-Tubos de ensayo con tapa a rosca y/o tapón de algodón (estériles)
-Tapones de algodón
-Cepillos
-Papel aluminio/film
-Guantes de látex
-Balanza
-Detergente
-Agua destilada
-Etanol
-Algodón y Gasa
-Reactivos para preparación de medios: Agar, Peptona, Extracto de levadura, Cloruro de Sodio,
Hidróxido de Sodio.
Ejercicios TP4
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Utilizando el anexo de medios de cultivo, calcule el peso de los reactivos necesarios para preparar los
siguientes medios y complete los cuadros.
a) 150 ml agar-LB
b) 300 ml agar MacConkey
c) 200 ml medio mínimo para Escherichia coli
d) 500 ml LB
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Anexo
Medios de Cultivo
Un medio de cultivo es una preparación sólida o líquida utilizada para el crecimiento,
transporte y almacenamiento de microorganismos. Para ser efectivo, el medio debe contener todos
los nutrientes que permitan el crecimiento de los mismos. Los medios especializados son esenciales
para el aislamiento y la identificación de microorganismos, la evaluación de sensibilidad a
antibióticos, análisis de agua y alimentos, microbiología industrial y otras actividades.
Si bien todos los microorganismos necesitan fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo,
azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio satisfactorio depende de la especie que
se intente cultivar, pues los requerimientos nutricionales son muy variados.
Clasificación de Medios de Cultivos
Los medios de cultivo pueden ser clasificados en base a diversos parámetros:
1.1.- Según su composición química
Medios definidos: aquellos en el cual todos los componentes químicos son conocidos. Estos medios
son ampliamente utilizados en investigación, pues permite conocer qué está metabolizando el
microorganismo en estudio.
Medios complejos: Aquellos que contienen ingredientes de composición química desconocida.
Resultan muy útiles pues son lo suficientemente ricos para cubrir todos los requerimientos
nutricionales de un amplio espectro de microorganismos. Adicionalmente, los medios complejos
suelen ser necesarios cuando se desconoce los requerimientos nutricionales de un microorganismo
dado, por lo cual no puede prepararse un medio definido para el mismo.
La mayoría de los medios complejos contienen componentes indefinidos tales como peptona
(peptones), extracto de carne (meat extract) y extracto de levadura (yeast extract).
1.2.- Según su naturaleza física
Medios líquidos: también llamados “caldos”, se utilizan para el crecimiento de microorganismos en
suspensión. Son la base para la preparación de los medios semisólidos y sólidos.
Medios semisólidos: aquellos en que la adición de un agente solidificante (agar 0,3-0,5%) les
confiere una consistencia de gel, lo cual permite su uso para identificar microorganismos móviles.
Medios sólidos: aquellos en los que la adición de un agente solidificante (agar 1,5%) les brinda una
consistencia rígida que restringe fuertemente el movimiento de los microorganismos sembrados en
su superficie. Son particularmente importantes porque pueden ser utilizados para aislar diferentes
especies o cepas de microorganismos y establecer cultivos puros.
1.3.- Según su función
Medios mínimos: aquellos que contienen los componentes mínimos indispensables para la formación
de colonias de un microorganismo dado.
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Medios de soporte o de propósito general: son aquellos capaces de sostener el crecimiento de
muchos microorganismos.
Medios enriquecidos: son medios especialmente fortificados mediante el agregado de sangre u otras
fuentes de nutrientes especiales.
Medios selectivos: son aquellos que favorecen el crecimiento de un microorganismo especial, ya sea
estimulando su crecimiento o por inhibición de los otros organismos.
Medios diferenciales: son aquellos que permiten distinguir diferentes grupos de microorganismos e
incluso realizar una identificación tentativa en base a las características observables.
2.- Medios de uso frecuente
LB (Luria-Bertani): es el medio de cultivo más utilizado en estudios de biología molecular con
Escerichia coli. Sus principales ventajas son la simplicidad de preparación y el crecimiento rápido de
la la mayoria de las cepas de [Link] hasta alcanzar OD600 entre 2 y 3 bajo agitación.
Componentes Cantidad (g/l)
Peptona 10
Extracto de levadura 5
NaCl 0,5-1
Medio mínimo para E. coli
Componentes Cantidad (g/l)
Glucosa 5
Na2HPO4 6
KH2PO4 3
NH4Cl 1
NaCl 0,5
MgSO4 0,12
CaCl2 0,01
Caldo nutritivo
Componentes Cantidad (g/l)
Peptona 5
Extracto de carne 3
Tripticasa Soya: El agar tripticasa de soya garantiza el crecimiento de todos los microorganismos de
importancia microbiologica tanto grampositivos como gramnegativos, hongos y levaduras, este
medio tiene múltiples usos puede ser utilizado para el monitoreo microbiológico de áreas y
superficies, para el mantenimiento de cepas ATCC y para el análisis de aguas y alimentos.
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Componentes Cantidad (g/l)
Triptona 17
Peptona 3
Glucosa 2,5
NaCl 5
K2HPO4 2,5
Agar MacConkey: Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gramnegativos de fácil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que fermentan lactosa
(L+) de las no fermentadoras (L-).
Componentes Cantidad (g/l)
Digerido pancreático de gelatina 17,0
Digerido pancreático de caseína 1,5
Digerido péptico de tejido animal 1,5
Lactosa 10
Sales biliares 1,5
NaCl 5
Rojo neutro 0,03
Violeta cristal 0,001
Agar 13,5
Medio CLED: Medio indicado para el procesamiento de urocultivos. Es utilizado para el aislamiento,
recuento e identificación presuntiva de microorganismos, pues permite el desarrollo de la mayoría de
los patógenos urinarios y previene el desarrollo invasor de Proteus spp.
La diferenciación de los microorganismos se basa en la utilización que éstos puedan hacer de la
lactosa; las cepas que la fermentan, acidifican el medio que vira del verde al amarillo, mientras que
los que no lo hacen, dan colonias incoloras que viran el medio al color azul.
Componentes Cantidad (g/l)
Peptona 4
Extracto de carne 3
L-cistina 0,128
Tripteína 4
Azul de bromotimol 0,02
Lactosa 10
Agar 15
Medio EMB: Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de
rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la
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familia Enterobacteriaceae. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un
característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia
azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Componentes Cantidad (g/l)
Peptona 10
Lactosa 5
Sacarosa 5
Fosfato Dipotásico 2
Eosina 0,4
Azul de Metileno 0,065
Agar 13,5
3.- Glosario
Agar: es un polímero sulfatado extraído de un alga roja. Su amplio uso como agente solidificante se
debe a varias razones: 1) funde a 90ºC y solidifica a 45ºC, por lo cual se lo puede fundir en agua
hirviendo y luego enfriarlo a una temperatura que facilite su manipulación. 2) Permite una incubación
en un amplio margen de temperaturas. 3) La mayoría de los microorganismos no lo degradan.
Extracto de carne: extracto acuoso de carne que contiene aminoácidos, péptidos, nucleótidos, ácidos
orgánicos, vitaminas y minerales.
Extracto de levadura: extracto acuoso de levaduras muy rico en vitaminas B y en compuestos de
carbono y nitrógeno.
Peptona: hidrolizados de proteínas preparados por la digestión proteolítica parcial de carne, caseína,
soja, gelatina y otras fuentes de proteínas. Sirve como fuente de carbono, energía y nitrógeno.
