Ana G. Sánchez – D.
Keszenman
FUNDAMENTOS DE MICROSCOPÍA
Introducción:
Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta de enorme importancia en el desarrollo
de distintas disciplinas científicas. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de
formación de imágenes ópticas aumentadas, permiten la observación de pequeños detalles de una
muestra dada que a simple vista no se percibirían. Un ejemplo de esto es una célula animal típica, la
cual mide entre 10 y 20 m de diámetro, muy por debajo del tamaño más pequeño que puede
apreciar el ojo humano (100 m). Una lente convexa constituye un microscopio simple, pero
generalmente no logra aumentos mayores a 10 veces el tamaño real del objeto. Para obtener
magnificaciones mayores se desarrolló el microscopio compuesto, el cual está constituido por un
sistema de lentes que logran magnificaciones de más de 1000 veces el tamaño del objeto.
Un microscopio compuesto consta de dos sistemas: el óptico y el mecánico.
• El sistema óptico se compone básicamente de dos lentes (un ocular y un objetivo) y el
condensador. Este último es una lente convergente que toma los rayos de luz provenientes de la
fuente y forma un cono de rayos convergentes sobre la muestra. Además posee un diafragma o iris
que regula la cantidad de luz que atraviesa el condensador y llega a la muestra, así como el ángulo
del cono de luz.
Figura 1: Formación de imagen en un microscopio óptico. La luz proveniente de
una fuente pasa a través de una lente condensadora y atraviesa la muestra
localizada en la platina. La lente objetiva forma luego una imagen real intermedia
que se proyecta sobre el diafragma fijo de la lente ocular. Esta imagen es
posteriormente aumentada aún más por la lente ocular generándose una imagen
virtual invertida del objeto que es percibida por el ojo como si estuviese a 2,5cm de
distancia.
• El sistema mecánico da soporte a toda la estructura y se compone del pie o base y el brazo, los
cuales en su conjunto se denominan estativo. En la base del microscopio se localiza la fuente de luz
del mismo. La platina constituye un soporte sobre el cual se coloca la muestra, y presenta un
orificio que permite el pasaje de luz. Asociados a esta platina existen dos tornillos que permiten el
desplazamiento en el plano xy de la muestra. A ambos lados del estativo se disponen, generalmente,
los tornillos de enfoque del microscopio (macrométrico y micrométrico), encargados de mover
hacia arriba y hacia abajo la platina para poner en foco la muestra. Por encima de la platina está el
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revólver que contiene los sistemas de lentes objetivos de distinto aumento. La rotación del revólver
coloca a cada una de las lentes en el eje óptico.
Figura 2a: Descripción de las distintas partes y elementos del microscopio óptico.
Figura 2b: Vista lateral del microscopio óptico.
Descripción de las lentes objetivas:
Son sistemas de lentes ajustables que permiten el uso de lentes de escaneo, lentes de baja potencial,
lentes de alta potencial y/o lentes de inmersión. Estas lentes tienen diferentes potencias de
magnificación, así como también distintas potencias de resolución.
La lente objetiva tiene inscripciones que indican ciertas características, tales como su aumento,
apertura numérica, correcciones, etc. (Figura 3). Las lentes objetivas de un microscopio, que poseen
distinto poder de aumento, suelen estar diseñadas para proyectar la imagen intermedia en el mismo
punto del tubo, de manera que es necesario hacer únicamente pequeñas correcciones con los
tornillos de enfoque cuando se cambia de lente durante la observación. Los microscopios que
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poseen este tipo de lentes se denominan parafocales. Además, el centro del campo de observación
es el mismo en los distintos lentes, por lo cual se denominan paracentrales.
Figura 3: Información de una lente objetiva y nomenclatura estándar.
Magnificación y Resolución:
La función del microscopio es entonces generar una imagen magnificada del objeto, es decir, una
imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita apreciar los detalles del mismo, es decir,
debe tener resolución. En el microscopio compuesto, la magnificación se alcanza a través de la
interacción de dos lentes: la ocular y la objetiva.
La magnificación total (MT) de cualquier objeto que es observado es igual al poder de las lentes
oculares multiplicado por el poder de las lentes objetivas usadas.
Es importante comprender que aunque el nivel de magnificación casi no tiene límites, la resolución
(o poder de resolución), es decir, la habilidad de distinguir dos objetos cercanos como separados, sí
tiene límites. El microscopio compuesto tiene una resolución de 0,2 m bajo condiciones ideales.
El poder de resolución está determinado por la cantidad y las propiedades físicas de la luz visible
que entra al microscopio. En general, cuanta más luz sea enviada a las lentes objetiva, se obtiene
mayor resolución.
El límite de resolución de una lente puede calcularse utilizando la Ecuación de Abbe:
Límite de Resolución = 0,61 . λ
A. N.
La apertura numérica (A.N.) es una magnitud adimensional que caracteriza la capacidad de
colección de luz y el poder de resolución (a una distancia fija) de un objetivo. Depende de dos
parámetros: el ángulo de incidencia de la luz en el lente, y el índice de refracción del medio que
separa el objeto de la lente objetiva.
De lo anterior se desprende que existen tres maneras de modificar el límite de resolución de un
microscopio:
1) Variando la longitud de onda de trabajo (l cercanas al violeta logran mayor poder de resolución,
o sea, valores límite de resolución pequeños).
2) Variando el índice de refracción (se modifica el elemento que está en contacto con la muestra y
con la lente objetiva. El índice de refracción del aire es 1, el del agua es 1,33 y el del aceite y
vidrio aproximadamente 1,51).
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3) Y el ángulo del cono de luz que incide en la muestra (se varía la distancia del condensador al
objeto o el diseño del mismo).
Aumentos Distancia de Trabajo (mm)
4x 13,8
10x 7,10
20x 1,40
60x 0,43
100x (aceite) 0,20
Tabla 1: Características de algunos objetivos plano – acromáticos.
(Los utilizados en clase pueden tener especificaciones diferentes).
Campo del Microscopio
El tamaño del campo del microscopio decrece a medida que aumenta la magnificación. Es
importante para el trabajo en el laboratorio determinar en el microscopio en uso el diámetro de cada
uno de los campos. Esta información permite realizar una estimación del tamaño de los objetos
observados en un campo dado. Por ejemplo, si calculamos que el diámetro del campo es 4mm y el
objeto observado ocupa la mitad de dicho campo podemos estimar que la longitud del objeto es de
2mm.
A través de la medición con una regla del diámetro del campo a un cierto nivel de magnificación, se
puede determinar el diámetro del campo a otros niveles de magnificación mediante la relación:
Diámetro del campo A × Magnificación Total del campo A =
Diámetro del campo B × Magnificación Total del campo B
Por tanto:
Diámetro de campo B = Diámetro de campo A × MagnificaciónTotal A
Magnificación Total B
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Procedimiento para el uso correcto del microscopio de luz
¡ATENCIÓN!
Use los tornillos macro y micrométricos moviéndolos lentamente.
¡La rotura de cubreobjetos puede ser extremadamente perjudicial para la lente frontal del
objetivo, pudiendo dañarla en forma irrecuperable!
Si desplaza un microscopio hágalo manteniendo siempre el instrumento en posición vertical,
tomándolo del brazo y levantándolo; NUNCA lo arrastre sobre una superficie para moverlo
(la vibración provocada afloja y desajusta las lentes).
1) Coloque el preparado en la platina, verificando que el cubreobjetos quede hacia arriba y que el
material quede centrado en el orificio de la platina.
2) Encienda la fuente de luz y ajuste el voltaje de la lámpara.
3) Abra el diafragma iris del condensador al máximo.
4) Suba el condensador hasta la máxima posición.
5) Verifique que el material en el preparado está iluminado. En los microscopios que no tienen luz
incorporada: mueva el espejo, controlando desde el exterior, hasta que la luz incida sobre el
material en la platina.
6) Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico del instrumento.
7) Observando desde el exterior y utilizando el macrométrico, acerque el objeto hasta el tope
superior de la platina.
8) Observando por el ocular, baje la platina lentamente con el macrométrico hasta obtener una
imagen nítida. Corrija el foco con el micrométrico.
9) Corrija la iluminación, bajando el condensador y cerrando el diafragma iris hasta obtener el
máximo de contraste en un campo uniformemente iluminado.
10) Para pasar a un objetivo de mayor aumento, verifique primero si los objetivos son parafocales:
a) Objetivos parafocales: Coloque el objetivo de mayor aumento en el eje óptico. Corrija el
foco con el micrométrico.
b) Objetivo no parafocal: Baje la platina con el macrométrico. Coloque el objetivo de mayor
aumento en el eje óptico.
11) Observando desde el exterior acerque el objetivo hasta un milímetro del cubre-objeto. Observe
por el ocular y repita el paso 8.
12) Corrija la iluminación, subiendo el condensador y modificando el diafragma iris hasta obtener
condiciones de iluminación como en el paso 9.
13) Para pasar a otros aumentos superiores repita los pasos 10 y 11.
14) Para acercar el objetivo al cubreobjetos tenga en cuenta la distancia de trabajo de ese objetivo,
(los valores de esa distancia están en la tabla del apéndice de este protocolo).
Al terminar de trabajar, verifique:
- que la platina esté seca y bájela hasta el tope.
- que no queda un preparado en ella.
- que la intensidad de la luz fue bajada al mínimo y luego apague la fuente de luz.
- que el tubo queda en posición vertical en los microscopios de ángulo vertical.
- que la lente objetiva que quedó en posición sea la de menor aumento.
- que el tornillo de ajuste del cabezal de los oculares esté ajustado y los oculares firmes.
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APÉNDICE 1
Estimación de medidas utilizando el microscopio:
Para medir un objeto en un microscopio se utilizan dos reglas, una ocular y otra objetiva. La regla o
micrómetro ocular es un disco de vidrio que se coloca por debajo de la lente ocular. Presenta
grabada una escala con 50 divisiones que deben ser calibradas, es decir, debe adjudicársele un valor
en micras a cada una de sus divisiones, para cada uno de los objetivos del microscopio. Para ello se
utiliza la regla objetiva, la cual es una escala grabada en un portaobjeto. Esta última posee 100
divisiones, cada una correspondiendo a 10 m, por lo cual el largo total de esta regla es de 1 mm.
Comparando la regla ocular con la regla objetiva, se obtiene el valor de cada unidad arbitraria (UA)
de la reglilla ocular, para cada aumento del microscopio (Figura A).
Figura A: Diagrama del procedimiento de calibración para tres aumentos distintos.
Longitudes de onda (nm) en la región visible del espectro electromagnético:
Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo
BIBLIOGRAFÍA
− Compendio de histología médica y biología celular. M. Lecouna Rodríguez y cols. Elsevier España,
2015.
− Manual de prácticas de microbiología básica y microbiología de alimentos. Programa de Nutrición. Luis
Roberto Alarcón. UACJ, 2001.
− Human Anatomy & Physiology Laboratory Manual Fetal Pig Version. Elaine N. Marieb, Susan J.
Mitchell, and Lori A. Smith. Eleventh Edition, Pearson Education, Inc. 2012.
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