UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

ESCUELA DE POSGRADO
DOCTORADO EN CIENCIA DE ALIMENTOS

“CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE ECOTIPOS DE TARWI

(Lupinus mutabilis Sweet) PARA SU INCLUSIÓN
EN UNA BEBIDA PROBIÓTICA”

Presentada por:

PAOLA MARLENE CORTÉS AVENDAÑO

TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR

DOCTORIS PHILOSOPHIAE EN CIENCIA DE ALIMENTOS

Lima - Perú
2020
 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
LA MOLINA

ESCUELA DE POSGRADO
DOCTORADO EN CIENCIA DE ALIMENTOS

“CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE ECOTIPOS DE TARWI

(Lupinus mutabilis Sweet) PARA SU INCLUSIÓN
EN UNA BEBIDA PROBIÓTICA”

TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR

Doctoris Philosophiae

Presentada por:
PAOLA MARLENE CORTÉS AVENDAÑO

Sustentada y aprobada ante el siguiente jurado:

 AGRADECIMIENTOS

A la Ph.D. Ritva Repo de Carrasco por asesorar la presente investigación y las oportunidades
brindadas para poder realizar este trabajo.

A la Ph.D. Patricia Glorio por co-asesorar la presente investigación y por su apoyo

incondicional.

Al Ministerio de Educación (MINEDU) y al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e

Innovación Tecnológica (CONCYTEC) por otorgarme la beca integral para realizar los
estudios de doctorado, bajo el convenio 000179-2015-FONDECYT.

Al proyecto Protein2Food (Horizonte 2020) por financiar parte de la investigación.

Al Proyecto PNIA de Investigación biotecnológica de la cadena productiva del tarwi

(Lupinus mutabilis Sweet) del programa de Leguminosas de la UNALM, por financiar parte
de la investigación.

A los profesores de la Universidad de Turku y de la UNALM: Jukka-Pekka, Baoru Yang,

Ye Tiam, Marko Tarvainen y Victor Delgado por su apoyo para el desarrollo de la parte
experimental de la caracterización de la materia prima.

Al Dr. Felix Camarena y a la [Link]. Elvia mostaceros por su apoyo en la obtención de la

materia prima.

Al Dr. Gabriel Vinderola por su apoyo en el desarrollo de la bebida probiótica

Al Dr. Luis Condezo Hoyos por la revisión crítica del documento y su orientación científica.

A los miembros del jurado, Dr. Marcial Silva, Dr. Milber Ureña, Dra. Bettit Salvá, Ph.D.
Emilio Yavar, por sus sugerencias y comentarios a la presente investigación.
 ÍNDICE GENERAL
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………… 1
II. REVISIÓN DE LITERATURA……………………………………………. 3
2.1. LUPINO…………………………………………………………………. 3
2.1.1. Lupinus mutabilis Sweet……………………………………………….. 4
a. Composición química proximal……………………………………… 5
b. Metabolitos secundarios……………………………………………… 6
2.2. LECHE DE VEGETAL………………………………………………….. 7
2.3. PRODUCTOS FERMENTADOS NO PROBIÓTICOS………………… 8
2.4. BEBIDAS PROBIÓTICAS NO LÁCTEAS……………………………... 8
2.5. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BAL)……………………………… 10
2.6. PROBIÓTICOS………………………………………………………….. 11
2.6.1. Mecanismo de acción de los probióticos………………………………. 14
2.6.2. Bacterias probióticas…………………………………………………… 16
a. Lactobacillus Plantarum 299v (Lp 299v)…………………………… 17
b. Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)…………………………………19
2.6.3. Factores que afectan la viabilidad de los probióticos…………………. 19
2.7. PREBIÓTICOS…………………………………………………………. 20
III. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………23
3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN………………………………………………. 23
3.2. MATERIA PRIMA……………………………………………………… 23
3.3. MATERIALES, EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS………24
3.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS……………………………………………... 26
3.4.1. Caracterización físico-química de las semillas de lupino……………… 26
a. Composición químico proximal…………………………………... 26
b. Determinación del tamaño de las semillas de lupino……………… 26
c. Determinación de pH y acidez titulable…………………………… 26
d. Determinación de metabolitos secundarios………………………. 27
3.4.2. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)............................................ 30
3.4.3. Recuento de células viables……………………………………………. 30
3.4.4. Análisis reológico……………………………………………………… 31
3.4.5. Evaluación sensorial de la bebida……………………………………… 31
3.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL………………………………… 31
3.5.1. Tratamiento de las semillas sin desamargar…………………………… 31
3.5.2. Desamargado de las semillas de lupino…………………………………32
3.5.3. Elaboración de la bebida……………………………………………….. 33
a. Preparación del cultivo iniciador y propagación…………………… 33
b. Procedimiento para la obtención de la bebida probiótica………….. 34
3.6. DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO…………. 37
3.6.1. Diseño experimental…………………………………………………… 37
a. Caracterización físico-química de las semillas de lupino: Etapa I.... 37
 b. Optimizar los factores de formulación de la bebida probiótica :
Etapa II................................................................................................... 37
c. Caracterización y estabilidad de la bebida probiótica……………. 40
3.6.2. Análisis estadístico…………………………………………………… 42
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………... 43
4.1. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y METABOLITOS
SECUNDARIOS DE LAS SEMILLAS DE
LUPINO……………………………………………............................... 43
4.1.1. Caracterización fisicoquímica de la materia prima…………………… 43
4.1.2. Metabolitos secundarios………………………………………………. 47
a. Identificación y cuantificación de alcaloides en semillas sin
desamargar y desamargadas……………………………………... 47
b. Identificación y cuantificación de isoflavonas y flavonas en
semillas sin desamargar y desamargadas………………………... 55
4.2. SELECCIÓN DEL ECOTIPO PARA LA ELABORACIÓN DE LA
BEBIDA………………………………………………………………... 64
4.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS FACTORES SIGNIFICATIVOS EN LA
ELABORACIÓN DE LA
BEBIDA………………………………………………………………... 65
4.4. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE FERMENTACIÓN DE LA
BEBIDA EN FUNCIÓN DEL
pH………………………………………………………………………. 68
4.5. DETERMINACIÓN DEL FATOR DE DILUCIÓN PARA L.
plantarum 299v…………………………………………………………. 70
4.6. OPTIMIZACIÓN DE LOS FACTORES DE FORMULACIÓN DE LA
BEBIDA PROBIÓTICA………………………………………………... 72
4.6.1. Efecto de los factores sobre la tasa de crecimiento de L. plantarum
299v……………………………………………………………………. 73
4.6.2. Efecto de los factores sobre el pH……………………………………... 76
4.6.3. Validación del modelo............................................................................. 78
4.7. CARACTERÍSTICAS DE LA BEBIDA PROBIÓTICA
ÓPTIMA……………………………………………………………….. 79
4.7.1. Evaluación sensorial de la bebida…………………………………….. 81
4.7.2. Estabilidad durante el almacenamiento de la bebida probiótica……… 82
V. CONCLUSIONES……………………………………………………………89
VI. RECOMENDACIONES……………………………………………………. 91
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………….. 92
VIII. ANEXOS……………………………………………………………………...111
 ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1: Clasificación taxonómica del tarwi………………………………………... 4

Cuadro 2: Comparación de la composición del lupino (Lupinus mutabilis Sweet) y
soya (g/100 g)……………………………………………………………… 5
Cuadro 3: Descripciones y definiciones de probióticos comúnmente citadas a lo largo
de los años………………………………………………………………….. 12
Cuadro 4: Bacterias probióticas……………………………………………….............. 16
Cuadro 5: Especies de Lactobacillus seleccionados por el modo de fermentación de
azúcares…………………………………………………………………… 17
Cuadro 6: Factores y niveles en el diseño Taguchi L8(27)……………………………. 37
Cuadro 7: Tratamientos generados por la metodología Taguchi……………………… 38
Cuadro 8: Niveles mínimos y máximos de los factores para la optimización de la
bebida ……………........................................................................................ 40
Cuadro 9: Diseño empleado para la optimización por el método de Superficie
Respuesta…………………………………………………………………… 40
Cuadro 10: Composición químico proximal de 10 ecotipos de lupinos (Lupinus
mutabilis Sweet) sin desamargar (100 % b.s)................................................ 44
Cuadro 11: Análisis de proteína de 10 ecotipos de lupinos (Lupinus mutabilis Sweet)
desamargados (100 % b.s.)…………………………………………............ 45
Cuadro 12: Perfil de alcaloides en los ecotipos y parámetro de lipofilia (Log P) …….. 48
Cuadro 13: Alcaloides en semillas de lupino (Lupinus mutabilis Sweet) sin desamargar 50
y desamargadas, determinadas por CG- FID (g/100 g b.s)…………………
Cuadro 14: Efecto del método de extracción y el tipo de solvente en el contenido
de compuestos fenólicos totales EAG (mg/100 g) de semillas sin
desamargar ………………………………………………………………… 57
Cuadro 15: Identificación de isoflavonas y flavonas en 10 ecotipos de lupino (Lupinus
mutabilis Sweet), por UPLC-DAD-MS2…………………………………… 61
Cuadro 16: Longitud de onda y rectas de calibración para la cuantificación de flavonas
e isoflavonas ……………………………………………………………… 62
Cuadro 17: Isoflavonas y flavonas en los ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet)
sin desamargar y desamargados……………………………………………. 63
Cuadro 18: Tratamientos según diseño experimental Taguchi L8 (27) y tasa de
crecimiento de bacterias probióticas……………………………………….. 66
Cuadro 19: Niveles con mayor crecimiento de bacterias probióticas con descenso de
pH (4.5) en la bebida fermentada según Taguchi………………………….. 68
Cuadro 20: Valores experimentales y predichos de la tasa de crecimiento de L.
plantarum 299v…………………………………………………………...... 72
Cuadro 21: Análisis de varianza y análisis de regresión para el crecimiento de L.
plantarum 299v……………………………………………………………. 73
Cuadro 22: Análisis de varianza y regresión para el pH .................................................. 77
Cuadro 23: Condición óptima recomendado por el modelo de segundo orden,
respuesta estimada y experimental………………………………………… 78
Cuadro 24: Características fisicoquímicas de la bebida fermentada y semillas de
lupino………………………………………………………………………. 80
Cuadro 25: Características físico-químicas y reológicas de la bebida fermentada........... 87
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Morfologia del tarwi (Lupinus mutabilis Sweet)………………………………… 5

Figura 2: Esquema generalizado para la fermentación de glucosa en bacterias acido
lácticas………………………………………………………………………….. 11
Figura 3: Efectos benéficos de los probióticos sobre la salud humana……………………. 13
Figura 4: Mecanismos de acción de los probióticos………………………………………. 15
Figura 5: Ruta de cambios metabólicos primarios en Lactobacillus
plantarum……………………………………………………….......................... 18
Figura 6: Factores que afectan la viabilidad de los probióticos en productos alimenticios
(durante el procesamiento y almacenamiento), así como en el tracto
gastrointestinal (GIT)…………………………………........................................ 20
Figura 7: Prebiótico en alimentos ………………………………………………………… 21
Figura 8: Ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet) de diferentes regiones del
Perú……………………………………………………………........................... 24
Figura 9: Proceso de desamargado de las semillas de lupino……………………………… 33
Figura 10: Diagrama de flujo para la elaboración de la bebida……………………………. 36
Figura 11: Diseño experimental para la obtención de la bebida probiótica de
lupino…………………………………………………………………………… 41
Figura 12: Semillas de Lupinus mutabilis S. Ecotipo Altagracia: A) semillas sin desamargar
hidratar, B) semillas desamargadas. ……………………………………………. 46
Figura 13: Micrografía de la semilla sin desamargar: A) Cotiledón (34x), a: Hilum; B)
Ampliación del cotiledón (1200x); C) Cáscara (34x); D) Ampliación de cáscara
(280x). …………………………………………………………………. 47
Figura 14: Alcaloides totales. (a) Antes del proceso de desamargado; (b) después del
proceso de desamargado. Las barras representan la desviación estándar de tres
réplicas independientes…………………………………………………………. 52
Figura 15: Proyección de ecotipos de lupino y cargas por alcaloides en el plano compuesto
por componentes principales PC1 y PC2 que explican el 73,6% de la varianza
total……………………………………………………………………………... 54
Figura 16: Cromatograma LC de isoflavonas y flavonas en ecotipos de lupino: a. Sin
desamargar; b. Desamargado. El número de picos se detalla en el Cuadro
15……………………………………………………………………………….. 59
Figura 17: Valores señal/ruido (ETA) de cada factor evaluado en la tasa de crecimiento de
bacterias probióticas aplicando Taguchi L8 (27)………………………………… 67
Figura 18: Cinética de cambio de pH en la bebida fermentada: A) 18 horas de fermentación,
B) 12 horas de fermentación…………………………………………………… 69
Figura 19: Factor de dilución para el crecimiento de L. plantarum 299v …………………..
71
Figura 20: Valores predichos y experimentales de la tasa de crecimiento de L. 74
plantarum 299v.
Figura 21: Superficie de respuesta estimada para la tasa de crecimiento de L. plantarum 75
299v……………………………………………………………………………..
Figura 22: Superficie de respuesta estimada para pH del medio fermentación...................... 78
Figura 23: Evaluación de aceptabilidad general de la bebida fermentada, cada punto
medido representa el promedio de 5 jueces evaluados…………………………. 82
Figura 24: Viabilidad de L. plantarum 299v durante el almacenamiento……....................... 84
Micrografía de la bebida de lupino: A) Antes de fermentar (500x), B) Después
Figura 25: de fermentar (250x) y C) Viabilidad de L. plantarum 299v después de fermentar
(4000x) ………………………………………………………………................. 86
 ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1: Curva de calibración para la determinación de compuestos

fenólicos totales…………………………………………………… 112
Anexo 2: Información del compuesto 20 (aglicona de isoflavona
desconocida). a. Absorción UV, b. Espectro de masas (MS) a modo
negativo, c. Espectro de masas (MS) a modo positivo, d. Scanner
del producto de 301 ([M+H]+,
m/z)………………………………………………………………... 113
Anexo 3: Información del compuesto 21 (aglicona de flavona desconocida).
a. Absorción UV, b. Espectro de masas (MS) a modo negativo, c.
Espectro de masas (MS) a modo positivo, d. Scanner del producto
de 301 ([M+H]+,
m/z)………………………………………………………………... 114
Anexo 4: Análisis de varianza del diseño experimental Taguchi L8

(27)………….................................................................................... 115
 RESUMEN

El objetivo del trabajo de investigación fue realizar la caracterización funcional de ecotipos

de tarwi (Lupinus mutabilis Sweet) para su inclusión en una bebida probiótica. En la primera
etapa se realizó la caracterización física y química de diez ecotipos de lupino sin desamargar
y desamargados, eligiendo al mejor ecotipo para la elaboración de la bebida probiótica. En
la segunda etapa, se optimizó la formulación de la bebida probiótica en función a la
viabilidad de los probióticos y el pH. En la tercera etapa, se caracterizó y evalúo la
estabilidad de la bebida probiótica óptima. En las semillas sin desamargar se identificaron 8
alcaloides, principalmente lupanina (2.5-5.2 g/100g) y esparteína (0.2-0.9g /100g), que
constituyeron el 80% del total de alcaloides. En las semillas desamargadas se identificaron
sólo lupanina (0.0012 g/100g) y esparteína (0.0014 g/100g). El contenido de isoflavonas y
flavonas en las semillas sin desamargar fue 185.3 mg/100g y 40 mg/100g, respectivamente
y en las semillas desamargadas 148 mg de genisteína /100 g y 17 mg de apigenina /100g,
respectivamente. El ecotipo seleccionado para la elaboración de la bebida fue Altagracia por
su contenido de proteínas, alcaloides, isoflavonas y flavonas, y el probiótico elegido fue
Lactobacillus plantarum 299v, en función a la reducción de pH. La bebida probiótica óptima
(8% de azúcar y 31.5% de lupino: agua, 2% de inulina, 0.8% de CMC, 1% de glucosa)
fermentada durante 12 h con L. plantarum 299v mostró una tasa de crecimiento de 30.63%
(13 x 108 UFC/ml) y buena aceptabilidad general (5.4 ± 2.4). Durante el almacenamiento,
disminuyó la viabilidad del probiótico (57 x 107 UFC/ml), la viscosidad (534.4 cP) y el pH
(3.85) y se incrementó de la acidez titulable. Las semillas de lupino, por sus características
nutricionales, es una buena matriz vegetal para el crecimiento de las bacterias probióticas.

Palabras claves: Lupino, alcaloides, desamargado, fermentación, probiótico.

 ABSTRACT

The aim of the research work was to perform the functional characterization of tarwi
(Lupinus mutabilis Sweet) ecotypes for inclusion in a probiotic drink. In the first stage, the
physical and chemical characterization of ten lupine ecotypes was carried out without
debittering and debittering. Then the ecotype was selected for the preparation of the probiotic
drink. In the second stage, the formulation of the probiotic drink was optimized based on the
viability of the probiotics and the pH. In the third stage, the optimal probiotic drink was
characterized and stability evaluated. In the seeds without debittering, 8 alkaloids were
identified, mainly lupanine (2.5-5.2 g / 100 g) and sparteine (0.2-0.9 g / 100 g), which
constituted 80% of the total alkaloids. Only lupanine (0.0012 g / 100 g) and sparteine (0.0014
g / 100 g) were identified in the debittered seeds. The content of isoflavones and flavones
were: in the seeds without debittering 185.3 mg / 100 g and 40 mg / 100 g, respectively and
in the debittering seeds 148 mg of genistein / 100 g and 17 mg of apigenin / 100 g,
respectively. The ecotype selected for the preparation of the drink was Altagracia due to its
content of proteins, alkaloids, isoflavones and flavones, and the probiotic chosen was
Lactobacillus plantarum 299v, based on the reduction in pH. The optimal probiotic drink
(8% sugar and 31.5% lupine: water, 2% inulin, 0.8% CMC, 1% glucose) fermented for 12 h
with Lactobacillus plantarum 299v showed a growth rate of 30.63% (13 x 108 CFU / ml)
and good general acceptability (5.4 ± 2.4). During storage, the viability of the probiotic (57
x 107 CFU / ml), the viscosity (534.4 cP) and the pH (3.85) decreased and the titratable
acidity increased. Lupine seeds, due to their nutritional characteristics, are a good plant
matrix for the growth of probiotic bacteria.

Keywords: Lupine, alkaloids, debittering, fermentation, probiotic.

 I. INTRODUCCIÓN

Los alimentos probióticos representan uno de los sectores más grandes en los mercados de
alimentos funcionales (Buruleanu et al. 2013). La creciente conciencia sobre la mejora de la
salud intestinal y la eficiencia de las bacterias probióticas son responsables del desarrollo del
mercado mundial de probióticos (Savedboworn et al. 2017), que se espera que crezca de
USD 243.9 millones en 2019 a USD 292.2 millones en el 2025 ([Link]). El
consumo de bebidas y alimentos que contienen bacterias probióticas es una tendencia cada
vez mayor en todo el mundo (Granato et al. 2010). Según la Organización de las Naciones
Unidas para la Agricultura y la Alimentación ( FAO y OMS 2002), los probióticos son
microorganismos vivos que confieren beneficios a la salud del huésped cuando se
administran en cantidades adecuadas (Hill et al. 2014). La mayoría de los microorganismos
probióticos son bacterias acido lácticas tales como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
casei, Lactobacillus acidophilus, y Streptococcus lactis (Yoon et al. 2004).

Diferentes investigaciones han demostrado que la adición de probióticos a los alimentos

reducen el nivel de colesterol, mejoran la función gastrointestinal y el sistema inmune, y
disminuyen el riesgo de cáncer de colon (Rafter 2003). Las bebidas lácteas se consideran
una excelente forma de administrar probióticos, siendo los más comunes el yogurt, la leche
fermentada y la leche fresca (Gürakan et al. 2009). Sin embargo, los principales
inconvenientes para los productos lácteos son la tendencia actual del vegetarianismo, el nivel
de colesterol y la creciente prevalencia de la intolerancia a la lactosa (Coda et al. 2012).
Aproximadamente el 70% de la población mundial sufre de intolerancia a la lactosa, en
países asiáticos es casi el 100%, en África y América del sur es aproximadamente 50%, en
el Reino Unido el 5% y en Finlandia y el norte de Francia el 17% (Nazir et al. 2019). Este
contexto ha llevado al desarrollo de productos probióticos en matrices alimentarias no
lácteas, incluyendo frutas, cereales y leguminosas (Champagne et al. 2008). Según
[Link] (2020), el mercado de alternativas lácteas crecerá de USD 12.6 mil
millones en el 2020 a USD 18.8 mil millones en el 2025, a una tasa de crecimiento anual
compuesta (CAGR) del 10.5% en el periodo pronosticado.
Esto se atribuye a los beneficios nutricionales que ofrecen las alternativas lácteas de origen
vegetal, dentro de ellas las leguminosas son un componente importante en la dieta tradicional
de muchas regiones del mundo y constituyen una excelente fuente de proteínas, así como de
otros macro y micronutrientes (Feyza et al. 2020). Una de las leguminosas más
representativas de los andes de América del sur es la especie Lupinus mutabilis Sweet, planta
comúnmente conocida como ullush, talwish, tauri, tarwi, chocho, lupino o ccquella
(Jacobsen y Mujica 2006), reconocida como un grano altamente nutritivo que proporciona
una cantidad relativamente alta de proteínas en comparación con las legumbres tradicionales,
así como ácidos grasos esenciales y fibra dietética (Carvajal et al. 2016). Además, las
semillas de lupino (tarwi) contienen metabolitos secundarios como polifenoles,
carotenoides, alcaloides y fitoesteroles con posibles actividades antimutagénicas,
anticancerígenas e hipocolesterolémicas (Ruiz-López et al. 2019).

La elección de la matriz alimentaria es una parte clave para mantener la viabilidad de los
probióticos en el producto final (Oliveira et al. 2017 ). Las legumbres pueden constituir
matrices desafiantes y sus efectos sobre la viabilidad de los probióticos merecen ser
investigados, ya que compuestos bioactivos comúnmente presentes pueden exhibir
propiedades antimicrobianas o prebióticas. En este contexto, el objetivo general del trabajo
de investigación fue realizar la caracterización funcional de ecotipos de tarwi (Lupinus
mutabilis Sweet) para su inclusión en una bebida probiótica, con el fin de mejorar el valor
nutricional, las propiedades sensoriales y cualidades funcionales del lupino: Para ello se
planteó los siguientes objetivos específicos:

a. Caracterizar físico y química proximal en diez ecotipos de lupino sin desamargar y

desamargados.
b. Identificar y cuantificar el contenido de alcaloides y flavonoides (Isoflavonas y
flavonas) en diez ecotipos de lupino sin desamargar y desamargados.
c. Seleccionar el ecotipo apropiado para la bebida probiótica en base al contenido de
alcaloides, proteína y flavonoides.
d. Optimizar los factores de formulación de la bebida probiótica.
e. Caracterizar y evaluar la estabilidad de la bebida probiótica óptima.

2
 II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. LUPINO

El género Lupinus es miembro de la familia Fabácea. Entre las legumbres, los lupinos o
altramuces, se caracterizan por su contenido de proteínas de alta calidad e idoneidad para
una producción sostenible y posibles beneficios para la salud. Oceanía y Eurasia contribuyen
con más del 90 % de la producción mundial de lupino con 1.3 toneladas métricas anuales,
seguidos por los países de África (5-7 %), América del Sur, Norte y Centroamérica (3-5 %)
(Lucas et al. 2015 ). Existen más de 450 especies de lupinos, de los cuales cuatro son de
interés agrícola comercial: Lupino blanco (Lupinus albus), lupino amarillo (Lupinus luteus),
lupino azul o de hojas estrechas (Lupinus angustifolia), y lupinos perla (Lupinus mutabilis)
(Jappe y Vieths 2010). Las tres primeras son nativas de Europa y representan la mayoría de
lupinos cultivados en el mundo, pertenecen a los lupinos dulces, se cultivan y usan como
alimento y en la alimentación de animales. La cuarta especie mencionada, L. mutabilis, es
una especie nativa de los Andes, y se cultiva sólo en algunas partes de América del Sur y
aún no está disponible comercialmente en Europa (Lucas et al. 2015 ).

En el mercado de alimentos, los lupinos son cada vez más utilizados debido a su valor
nutricional y propiedades tecnofuncionales y son considerados como posibles sustitutos de
la soya genéticamente modificada. El consumo de lupino también se ha asociado con efectos
beneficiosos para la salud, tales como la prevención de la obesidad, hipertensión, insulina
resistente, colesterol elevado en la sangre y las enfermedades cardiovasculares (Güemes et
al. 2008; Hodgson y Lee 2008; Jiménez-Martínez et al. 2003b). Así, se ha reportado que los
lupinos se utilizan como ingredientes en diferentes alimentos tales como requesón, tofu,
salsas, embutidos, escalope Vienés, untados, pasta, sucedáneos del café, mezclas sin gluten
para hornear, y todo tipo de productos de panadería.
2.1.1. Lupinus mutabilis Sweet

Lupino andino, más conocido como Chocho en el norte de Perú y Ecuador, tarwi en el centro
del Perú y tauri en el sur del Perú y Bolivia (chuchus en Cochabamba, Bolivia) (Cuadro 1)
(Jacobsen y Mujica 2006). En la actualidad el país con mayor producción es Chile con 45453
TM, seguido por Perú con 16481 TM y Ecuador con 1322 TM (FAOSTAT, 2020). El lupino
andino se considera uno de los cultivos perdidos de los incas, es ampliamente usado por la
población local como alimento y medicina natural (Jacobsen y Mujica 2006).

Cuadro 1: Clasificación taxonómica del Tarwi

Nombre Común Tarwi, Chocho, tauri

Nombre Científico Lupinus mutabilis
División Espermatofitos
Clase Dicotiledóneas
Orden Rosales
Familia Fabaceae
Género Lupinus
Especie Lupinus mutabilis
FUENTE: Zamora (2002)

El fruto es de forma elíptica u oblonda, aguda en ambos extremos con cerca de 120 vainas
por planta, en ellas se encuentran las semillas que pueden variar en número y pueden ser de
forma redonda u ovalada, lenticulares, de 5-15 mm de largo y 6-8 mm de ancho, de color
variable, (blancas, marrones o negras) y tienen un diámetro aproximado de 1 cm. El
tegumento que cubre la semilla es de forma dura y debe permeabilizarse para permitir la
salida de los alcaloides (Figura 1).

4
Figura 1: Morfología del tarwi (Lupinus mutabilis Sweet).
FUENTE: Miano et al. (2015).

a. Composición química proximal

Las semillas de Lupinus mutabilis es conocida por su gran valor nutritivo comparado a otras
especies (Cuadro 2), presenta un alto contenido de proteína y grasa, que excede el de
cualquier otra especie de lupino (Carvajal-Larenas et al. 2016). Además, las semillas de
lupino están prácticamente desprovistas de almidón, los principales carbohidratos
encontrados son oligosacáridos (principalmente estaquiosa y rafinosa) y polisacáridos de
almacenamiento de la pared celular (Trugo et al. 2003 ).

Cuadro 2: Comparación de la composición del lupino (Lupinus mutabilis Sweet) y

soya (g/100 g)
Componente Lupino Soya
Proteína 44,3 33,4
Grasa 16,5 16,4
Carbohidratos 28,2 35,5
Fibra 7,1 5,7
Ceniza 3,3 5,5
Humedad 7,7 9,2

FUENTE: Jacobsen y Mujica (2006).

5
b. Metabolitos secundarios

• Alcaloides

Los alcaloides de quinolizidina (AQ) como la esparteína, la lupanina o angustifolina son

metabolitos secundarios presentes principalmente en la familia de las Leguminosae y pueden
encontrarse también en el género Lupinus (Frick et al. 2018). Los AQ, son compuestos
químicos de defensa contra los insectos y otros herbívoros, su ingesta en altas
concentraciones produce intoxicaciones en mamíferos, convulsiones, temblores, y muerte
por paro respiratorio y cardíaco. Los AQ modulan los receptores de acetil colina (nicotínico
como muscarínico), algunos inhiben los canales de sodio y posiblemente pueden conducir a
degeneraciones neuronales (Ganzera et al. 2010). Los estudios preliminares sobre su
toxicidad sugieren que la dosis letal aguda tal como está presente en las semillas de lupino
es de 10 mg/kg de peso corporal (p.c) para lactantes y 25 mg/kg de p.c en adultos (Carvajal-
Larenas et al. 2016). Aunque los alcaloides pueden ser tóxicos cuando se ingieren a altas
concentraciones, se han descrito varias propiedades biológicas, como antimutagénico,
antibacteriano, antifúngico y anticancerígeno (Khan et al. 2015). El límite de seguridad
establecido por las autoridades sanitarias de Reino Unido, Francia, Australia y Nueva
Zelanda para la cantidad total de alcaloides en harinas de lupino y productos derivados es de
0,2 g/kg de materia seca (Magalhães et al. 2017). Los alcaloides se sintetizan en el estroma
de los cloroplastos de las hojas, regulada por la luz. Luego se transportan a través del floema
y se almacenan en las vacuolas de todos los órganos de la planta, preferentemente en los
tejidos epidérmicos y subepidérmicos de tallos y hojas. Las semillas son especialmente ricas
en alcaloides (5 % peso seco), representando alrededor del 8-10 % del nitrógeno (de Cortés
et al. 2005).

• Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios bioactivos ampliamente distribuidos

en todas las plantas superiores que se sintetizan principalmente por las vías de ácido
shikímico, fosfato de pentosa y fenilpropanoide (Singh et al. 2017). Las semillas de lupino
contienen cantidades significativas de fitoquímicos con potencial para promover la salud
tales como los compuestos fenólicos, fitoesteroles, tocoferoles y escualeno. La mayoría de
los compuestos fenólicos identificados en las especies de lupino pertenecen a las subclases
de isoflavonas y flavonas (Khan et al. 2015). Las isoflavonas pertenecen al grupo de los
flavonoides (Ranilla et al. 2009), se producen naturalmente en forma de glucósidos (como

6
daidzina, glicitina y genistína), estas formas naturales no se absorben fácilmente, pero se
convierten en formas desconjugadas (por ejemplo, daidzeína, genisteína, gliciteína) por la
acción de las enzimas hidrolíticas producidas por la microflora intestinal, mejorando en el
tracto gastrointestinal (GIT) (Duru et al. 2019 ). Las isoflavonas se han asociado con efectos
beneficiosos en los seres humanos, como la prevención del cáncer, enfermedades
cardiovasculares, osteoporosis y síntomas menopáusicos, las isoflavonas son fitoestrógenos
no esteroideos; sin embargo, debido a la presencia de anillos fenólicos, y particularmente el
4-hidroxilo, tienen la capacidad de unirse a los receptores de estrógenos, al igual que muchas
sustancias, incluidos los anti estrógenos como el tamoxifeno que se usa con éxito para tratar
el cáncer de mama (Ranilla et al. 2009). A pesar de los enormes beneficios para la salud
asociados con la ingesta de isoflavonas, existen diferentes hallazgos contradictorios que han
sido reportados por diferentes autores (Andrade et al. 2015). La dosis diaria ingerida no
tóxica de isoflavonas en humanos sigue siendo un tema discutible, 39-47 mg/día se considera
seguro entre la población japonesa (Duru et al. 2019 ). Por otro lado, las principales flavonas
identificadas en los lupinos son agliconas y/o glucósidos de luteolin, apigenin y disometin
(Khan et al. 2015), son considerados buenos antioxidantes porque tienen la habilidad de
atrapar el oxígeno singlete.

2.2. LECHE VEGETAL

2.2.1. Definición
La leche vegetal es una alternativa a la leche animal y se prepara por extracción acuosa a
partir de un material vegetal (cereales, pseudocereales, legumbres, semillas oleaginosas,
nueces) previamente molido. El extracto acuoso es homogenizado para obtener
distribuciones de tamaño de partícula en un rango de 5-20 μm que imitan la apariencia y
consistencia de la leche de vaca (Sethi et al. 2016).

2.2.2. Clasificación
Sethi et al. (2016), clasifica las leches vegetales en cinco categorías:

a. A base de cereales: Leche de avena, leche de arroz, leche de maíz, leche de espelta.
b. A base de legumbres: Leche de soja, leche de maní, leche de altramuz/lupino, leche
de caupí.

7
 c. A base de frutos secos: Leche de almendras, leche de coco, leche de avellanas, leche
de pistacho, leche de nueces.
d. A base de semillas: Leche de sésamo, leche de lino, leche de cáñamo, leche de
girasol.
e. A base de pseudocereales: Leche de quinua, leche de teff, leche de amaranto.

2.3. PRODUCTOS FERMENTADOS NO PROBIÓTICOS

Son aquellos productos de fermentación alimentaria con cualquier microorganismo. Por lo

tanto "Contiene cultivos vivos y activos", los términos "vivo" o "activo" no implican
actividad probiótica. La prueba de viabilidad a un nivel mínimo que refleje los niveles típicos
observados en los alimentos fermentados, se sugiere que sea 1 × 109 UFC por porción
(Bertazzoni et al. 2013). Los alimentos fermentados que contienen cultivos vivos también
podrían calificar como 'probióticos' si cumplen los criterios para esa categoría, por ejemplo,
la evidencia de que el yogur puede mejorar la digestión de lactosa en los maldigeridos de
lactosa lo calificaría como 'probiótico' (Guarner et al. 2005).

2.4. BEBIDAS PROBIÓTICAS NO LÁCTEAS

Estudios de la Organización Mundial de la Salud han demostrado que el estado de salud de

las personas depende en gran medida de la nutrición (Lampart et al. 2003). En este contexto
los alimentos funcionales son aquellos alimentos o componentes alimentarios que son
científicamente reconocidos por tener beneficios fisiológicos más allá de los de la nutrición
básica (Gibson y Williams 2000). Hoy en día, una amplia gama de productos probióticos
está disponible en el mercado (Halliwell 2002; Jiménez-Martínez et al. 2003a; Hilliam
2004). Dentro de ellos las bebidas probióticas no lácteas son una gran alternativa para las
bebidas lácteas. Estas bebidas están basadas en jugos de frutas, productos de cereales y
leguminosas como por ejemplo semillas de lupino y soja. El consumo de estos productos se
viene incrementado debido a que las bebidas fermentadas constituyen una parte importante
de la dieta humana y a la vez mediante el proceso de fermentación incrementan su vida útil,
mejoran su valor nutricional, y sus propiedades sensoriales (Barbaros y Huseyin 2010).
Debido a ello los mercados de bebidas probióticas son cada vez más competitivos (Sorenson
y Bogue 2005).

8
Anteriormente, los beneficios para la salud de los probióticos se lograban con la leche u
otros productos lácteos; sin embargo, la intolerancia a la lactosa, el contenido de colesterol
y las proteínas alergénicas de la leche son factores limitantes en el crecimiento del mercado
de los probióticos lácteos (Yoon et al. 2004). La intolerancia a la lactosa es generada por la
ausencia de producción por el cepillo intestinal de la enzima lactasa, las cuales hidrolizan la
lactosa en azúcares absorbibles (glucosa y galactosa) proporcionando energía al organismo.
La lactosa es el primer carbohidrato crucial en la promoción de la salud para promover la
salud del recién nacido durante el período posnatal, la actividad de la lactasa intestinal es
máxima entre la mayoría de los lactantes (Panghal et al. 2018). Los probióticos ayudan a
liberar la β-galactosidasa en el intestino delgado que ayuda a la digestión y descomposición
de la lactosa.

Por lo tanto, la ingesta de probióticos puede disminuir la intolerancia a la lactosa, pero la

efectividad depende del número de células en el producto y la cantidad de lactosa presente.
El aumento de los consumidores vegetarianos en los países desarrollados y en desarrollo, de
los productos probióticos a base de plantas se ha incrementado significativamente. Los
productos lácteos con alto contenido de colesterol, el número significativo de personas
intolerantes a la lactosa lo sufre el 75% de la población mundial (Silanikove, Leitner y Merin
2015) y razones económicas de los países en desarrollo han generado la necesidad de buscar
alternativas no lácteas nutritivos y que promuevan la salud, tales como frutas, verduras,
cereales y legumbres (Panghal et al. 2017).

En particular, los cereales y las leguminosas son los sustratos más adecuados para el
desarrollo de alimentos que contienen probióticos (Lamsal y Faubion 2009). Los cereales y
las legumbres son una buena fuente de vitaminas, minerales, proteínas, carbohidratos, fibra
y oligosacáridos . Los productos alimenticios probióticos a base de cereales y legumbres se
pueden preparar usando sorgo, harina de mijo , maíz, malta de mijo, harina de trigo, mijo ,
soja, arroz y avena, ya sea solos o en diferentes combinaciones (Panghal et al. 2018). Por
ejemplo, el primer alimento probiótico libre de leche o componentes de la leche fue
formulado y fabricado en 1994 por Skane Dairy con la marca ProViva en Suecia. La papilla
a base de harina de avena fue fermentada con las bacterias ácido lácticas Lactobacillus
plantarum 299v/L y se añadió cebada malteada para mejorar la licuefacción. La papilla de
avena fermentada se mezcló con diferentes bebidas de frutas, como grosella negra, fresa,
arándano, escaramujo o cualquier fruta tropical en una concentración del 5% para

9
proporcionar un sabor afrutado. Las bacterias fueron resistentes a pH < 2.8–3.4
10
permaneciendo viables durante más de un mes en almacenamiento refrigerado (~ 5×10
UFC/L) (Panghal et al. 2018). Por otro lado, se investigó la cuajada de frijol formada por
varios extractos de proteínas de legumbres, incluyendo lentejas, frijol mungo, garbanzos,
guisantes lisos, guisantes y frijoles alados (Cai et al. 2001). Además, las bebidas probióticas
no lácteas desarrolladas a partir de trigo germinado, cebada y mijo perla tienen un número
de células viables de L. acidophilus NCDC14 en el rango de 10.36–11.51 log UFC/ml y
10.36–11.17 log UFC/ml (Mridula y Sharma 2015 ). Así mismo, Santos et al.
(2014) desarrollaron una bebida de leche de cacahuete como nuevo sustrato para cepas
probióticas L. acidophilus (LACA 4) y Pediococcus acidilactici (UFLA BFFCX 27.1) con
una población celular superior a 8 log UFC/ml.

2.5. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BAL)

Bacterias ácido lácticas son gram-positivas, no forman esporas y son catalasa negativa, no
presentan citocromo (Holzapfel et al. 2001). Estas bacterias prefieren la anaerobiosis, pero
son aerotolerantes, son tolerantes al ácido y estrictamente fermentativas. Las BAL
generalmente incluyen a varias especies con características bioquímicas y ecológicas en
común (Lactobacillus, y Bifidobacterium) y tiene poco o ningún potencial patógeno, excepto
algunas especies de Streptococcus y posiblemente algunas cepas de Enterococcus (Donohue
y Salminen 1996). El consumo de BAL viables incluidas en los alimentos fermentados en
base a verduras, frutas, pescado, carne y leche data desde algunos años. Las BAL permiten
mejorar la textura y el sabor de los alimentos fermentados e incrementan su vida útil (Elagöz
et al. 1996).

Las vías por las cuales se metabolizan las hexosas dividen las BAL en dos grupos,
homoláctico y heteroláctico (Figura 2). Los homolácticos como Pediococcus, Streptococcus,
Lactococcus y algunos lactobacilos producen ácido láctico como el principal o único
producto final de la fermentación de glucosa. Sin embargo, en condiciones de crecimiento
alteradas y cuando el sustrato inicial es una pentosa, esto puede cambiar. Los homolácticos
utilizan la vía de Embden-Meyerhof-Parnas para generar dos moles de lactato por mol de
glucosa y derivan aproximadamente el doble de energía por mol de glucosa que los
heterolácticos. Los heterolácticos como Weisella y Leuconostoc y algunos lactobacilos

10
producen cantidades equimolares de lactato, CO2 y etanol a partir de glucosa a través de la
ruta de hexosa monofosfato o pentosa (Caplice y Fitzgerald 1999)
Glucosa

Homoláctico Heteroláctico

Glucosa-6-P Glucosa-6-P

6-fosfogluconato
Fructosa-6-P
Ribulosa-5-P

Fructosa-1,6-DP Xilulosa-5-P

Gliceraldehído-3-P Dihidroxiacetona-P Gliceraldehído-3-P Acetil-P

H2
0
2 piruvato 2 piruvato Acetaldehído

2 Lactato 2 Lactato Etanol

Figura 2: Esquema generalizado para la fermentación de glucosa en bacterias acido lácticas.

FUENTE: Adaptado de Caplice y Fitzgerald (1999).

2.6. PROBIÓTICOS

La palabra “probióticos” se utilizó inicialmente como un antónimo de la palabra

“antibiótico”. Deriva de las palabras griegas pro y biotos, traducido como “de por vida”
(Hamilton et al. 2003). El origen del primer uso fue para la restauración de la salud de
pacientes desnutridos por diferentes suplementos orgánicos e inorgánicos (Kollath 1953).
Un año más tarde, Vergin (1954), propuso que el desequilibrio microbiano en el cuerpo
causado por el tratamiento con antibióticos podría ser restaurado por una dieta rica en
probióticos. Algún tiempo después, en 1965, Lilly y Stillwell describieron los probióticos
como microorganismos que estimulan el crecimiento de otros microorganismos. La
definición de probióticos se ha modificado y cambiado muchas veces (Cuadro 3). A la
actualidad el término "probiótico", está definido por las Naciones Unidas y el Panel de
Expertos de la Organización Mundial de Salud como "microorganismos vivos que cuando
se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio de salud en el huésped"
(FAO/OMS 2002).

11
Cuadro 3: Descripciones y definiciones de probióticos comúnmente citadas a lo largo
de los años.
Año Descripción Fuente
1953 Los probióticos son comunes en los alimentos vegetales como vitaminas, Kollath
sustancias aromáticas, enzimas y posiblemente otras sustancias relacionadas
con procesos vitales.
1954 Los probióticos son opuestos a los antibióticos. Vergin
1955 Los efectos nocivos de los antibióticos se pueden prevenir mediante la Kolb
terapia con probióticos
1965 Una sustancia secretada por un microorganismo que estimula el crecimiento Lilly y Stillwell
de otro.
1971 Extractos de tejidos que estimulan el crecimiento microbiano. Sperti
1973 Compuestos que crean resistencia a la infección en el huésped pero que no Fujii y Cook
inhiben el crecimiento de microorganismos in vitro.
1974 Organismos y sustancias que contribuyen al equilibrio microbiano intestinal. Parker
1992 Suplemento de alimentación microbiana en vivo que afecta beneficiosamente Batán
al animal huésped al mejorar el equilibrio microbiano
1992 Cultivo mono o mixto viable de microorganismos vivos que, aplicados a Havenaar y
animales o al hombre, tienen un efecto beneficioso sobre el huésped al Huis int'Veld
mejorar las propiedades de la microflora indígena.
1996 Cultivo microbiano vivo o producto lácteo cultivado que influye Salminen
beneficiosamente en la salud y nutrición del huésped.
1996 Microorganismos vivos que, tras la ingestión en ciertos números, ejercen Schaafsma
beneficios para la salud más allá de la nutrición básica inherente
1999 Preparaciones de células microbianas o componentes de células microbianas Salminen,
que tienen un efecto beneficioso sobre la salud y el bienestar del huésped. Ouwehand,
Benno y Lee
2001 Una preparación o un producto que contiene microorganismos viables y Schrezenmeir y
definidos en cantidades suficientes, que alteran la microflora (por de Vrese
implantación o colonización) en un compartimento del huésped y que ejercen
un efecto beneficioso para la salud en este huésped.
2002 Microorganismos vivos que cuando se administran en cantidad adecuada FAO / OMS
confieren un beneficio para la salud del huésped
FUENTE: Vasiljevic et al. (2008)

Los criterios a considerar para que los microrganismos sean considerados probióticos son:
Ser de origen humano, resistencia al ácido y la bilis, poder adherirse al epitelio intestinal, la
colonización en el intestino humano, la producción de sustancias antimicrobianas, llamadas
bacteriocinas; buenas características de crecimiento y los efectos beneficiosos sobre la salud
humana (Figura 3). Una de las características más importantes de una cepa probiótica es que
debe ser no patógeno y GRAS - generalmente reconocido como seguro (Hattingh y Viljoen
2001; Prado et al. 2008; Barbaros y Huseyin 2010). Las pautas y la información de la

12
Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación
(FAO)/Organización Mundial de la Salud (OMS) demuestran la necesidad de que las cepas
probióticas permanezcan intactas a través del tracto intestinal superior para garantizar
efectos que promuevan la salud al ingresar a su sitio de acción, independientemente del modo
de entrega aplicado. Por ejemplo, para asegurar eso, se ha declarado que el llamado nivel
"mínimo terapéutico" de microorganismos probióticos viables debe ser de al menos
106 UFC/g de células viables durante toda la vida útil del producto (Neffe-Skocińska et al.
2018).

Estimulación
de la respuesta
inmune Tratamiento y
Incremento de
prevención de
la tolerancia y
la diarrea
digestión de la
aguda causada
lactosa
por rotavirus

Restauración de la
Influencia microflora del
positiva en la intestino normal
microflora después de la
intestinal terapia con
antibióticos

Probióticos

Producción de
Reducción del vitamina B
pH intestinal
(ácido fólico)

Reducción de
Mejoramiento amoniaco y
de la función otros
intestinal compuestos
tóxicos
Reducción del
colesterol

Figura 3: Efectos benéficos de los probióticos sobre la salud humana.

FUENTE: Gibson y Roberfroid (1995).

Por otro lado, las autoridades canadienses mencionan que el nivel de bacterias probióticas
debe ser de 1×109 UFC por porción, para Bifidobacterium (adolescentis, animalis, bifidum,

13
brevey longum) y Lactobacillus (acidophilus, casei, fermentum, gasseri, johnsonii,
paracasei, plantarum, rhamnosus y salivarius) (Healht Canada 2009). El consumo de
productos probióticos se ha incrementado alrededor del 13 a 18 % entre el 2002 y 2007 en
Europa occidental y oriental respectivamente (Granato et al. 2010).

2.6.1. Mecanismo de acción de los probióticos

Los mecanismos de acción de los probióticos implican. a) la colonización y la normalización

de comunidades microbianas intestinales perturbadas en niños y adultos; b) la exclusión
competitiva de patógenos y producción de bacteriocinas, c) la modulación de actividades
enzimáticas relacionadas con el metabolismo de una serie de carcinógenos y otras sustancias
tóxicas y d) la producción de ácidos grasos volátiles, a saber, ácidos grasos de cadena corta
(SCFA) y ácidos grasos de cadena ramificada (BCFA), que desempeñan un papel en el
mantenimiento de la homeostasis energética y la regulación de la funcionalidad en los tejidos
periféricos. Otros mecanismos incluyen el aumento de la adhesión celular intestinal, la
producción de mucina y la modulación de la actividad del tejido linfoide asociado al intestino
y al sistema inmunitario. Los metabolitos producidos por los probióticos pueden interactuar
con el eje cerebro-intestino y desempeñar un papel en el comportamiento (Figura 4) (Plaza-
Díaz et al. 2019).

14
Figura 4: Mecanismos de acción de los probióticos. (A) Colonización y normalización de comunidades microbianas intestinales perturbadas en niños y adultos y
exclusión competitiva de patógenos y producción de bacteriocina; (B) actividad enzimática y producción de ácidos grasos volátiles; (C) adhesión celular, antagonismo celular
y producción de mucina; (D) modulación del sistema inmune; y (E) interacción con el eje cerebro-intestino. AMPK, AMP quinasa; ANGPTL, similar a la angiopoyetina; DC,
célula dendrítica; FoxP3, caja de horquilla P3; GLP, péptido similar al glucagón; GPR, receptor acoplado a proteína G; HSL, lipasa sensible a las hormonas; IFN, interferón;
IRAK1, quinasa 1 asociada al receptor de IL-1; LPL, lipoproteína lipasa; MyD88, respuesta primaria de diferenciación mieloide 88; NF-κB, factor de transcripción nuclear κB;
PPAR-γ, receptor γ activado por proliferador de peroxisoma; PYY, polipéptido YY; TGF, factor de crecimiento transformante; TLR, receptor tipo Toll; TRIF, interferón-β
inductor de adaptador que contiene dominio TIR.

FUENTE: Elaborado en base a Plaza -Díaz et al. (2019).

15
2.6.2. Bacterias probióticas

Se han demostrado los beneficios para la salud de cepas probióticas específicas de los
siguientes géneros: Latobabillus Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus,
Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Bacillus y Escherichia coli (Salminen, 2002;
Fijan, 2014) (Cuadro 4). En general, la existencia de probióticos en el tracto gastrointestinal
de humanos o animales depende del comportamiento del huésped, la presencia de
antibióticos y la absorción dietética del huésped (Rolfe 2000 ). Las bacterias probióticas de
de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, crecen débilmente en la leche debido a su
relativa baja actividad proteolítica y a la incapacidad para utilizar la lactosa (Saarela 2009).
A fin de mejorar la viabilidad de las bacterias probióticas en los fermentos se añaden varias
sustancias a la leche incluyendo fructooligosacáridos (FOS), caseíno macropéptidos (CMP),
concentrado de proteína de suero (WPC), triptona, extractos de levadura, ciertos
aminoácidos, precursores de nucleótidos y una fuente de hierro (Barbaros y Huseyin 2010).

Cuadro 4: Bacterias probióticas

Especies otras
Lactobacillus Bifidobacterium
L. acidophilus Bf. adolescentis Bacillus cereus
L. Amylovorus Bf. animalis Clostridium botyricum
L. brevis Bf. breve Enterococcus faecalis
L. casei Bf. bifidum Enterococcus faecium
L. casei sp. rhamnosus Bf. infantis Escherichia coli
L. crispatus Bf. lactis Lactococcus lactis sp.
L. delbrueckii sp. Bf. longum Cremoriss
bulgaricus Leuconostoc mesenteroides sp.
L. Fermentum Dextranicum
L. gasseri Pediococcus acidilactici
L. helveticus Propionibacterium
L. johnsonii freudenreichii
L. Lactis Saccharomyces boulardii
L. paracasei Streptococcus salivarius sp.
L. plantarum thermophilus
L. Reuteri
FUENTE: Prado et al. (2008).

16
a. Lactobacillus Plantarum 299v

Lactobacillus plantarum 299v es una de las especies más estudiadas y ampliamente utilizada
en la industria alimentaria como bacterias probióticas y/o iniciador microbiano (Mårtensson
et al. 2002). Se ha determinado que es GRAS a través de procedimientos científicos de
acuerdo con el código Federal de regulaciones-Título 21-FDA. L. plantarum 299v se aisló
de una mucosa intestinal sana (Molin et al. 1993) y puede crecer en un 6% de NaCl en
condiciones óptimas, y muestra un crecimiento sub-letal a 16% de NaCl; es decir puede ser
considerada como halotolerante. Posee una amplia tolerancia al pH y crece a valores de pH
entre 4.0 y 8.0; con un crecimiento sub-letal hasta pH 2.0 y hasta 9.0 y puede crecer en
presencia de sales biliares hasta un 2% (Melgar-Lalanne et al. 2014).

Por otro lado, L. plantarum 299v tiene alta tasa de adhesión a la mucosa intestinal, porque
poseen una adhesina de unión a manosa (Adlerberth et al. 1996) que le permite colonizar
temporalmente el intestino grueso (Gbassi et al. 2009). Ejerce efecto inhibitorio sobre las
Enterobacteriaceae y anaerobios gramnegativos, en la mucosa in vivo en modelos de ratas
que simulan condiciones clínicas severas (Molin 2001). Por otro lado, al ser suplementadas
en bebidas de frutas con papilla de avena fermentada, aumenta la concentración de ácidos
carboxílicos en las heces de voluntarios sanos (principalmente ácido acético y propiónico),
estos ácidos grasos de cadena corta en el colon son una fuente de energía para las células de
la mucosa, es decir, una mayor concentración de ácidos grasos de cadena corta en la luz
puede ser beneficiosa para el estado de la mucosa (Johansson et al. 1998). Por la forma de
metabolizar los carbohidratos L. plantarum 299v es clasificada como hetero fermentativa
facultativa (Cuadro 5). El metabolismo general de las bacterias de Lactobacillus plantarum
se muestra en la Figura 5.

Cuadro 5: Especies de Lactobacillus seleccionados por el modo de fermentación de azucares

Homofermentativa Hetero fermentativa Hetero fermentativa
facultativa obligatoria
L. acidophilus L. casei L. brevis
L. delbrueckii L. curvatus L. buchnerii
L. gasseri L. paracasei L. fermentum
L. helveticus L. plantarum L. reuteri
L. jensenii L. sakei L. pontis
L. salivarius
FUENTE: Vinderola et al. (2019).

17
Figura 5: Ruta de cambios metabólicos primarios en Lactobacillus plantarum
FUENTE: Ming et al. (2018)

18
b. Lactobacillus rhamnosus GG

L. rhamnosus GG (LGG) es una Gram-positivo, no formador de esporas, facultativamente

anaeróbico o microaerofílico, no móvil y catalasa negativa. El valor de pH inicial óptimo
para el crecimiento está en el rango de 4.5 a 6.4, crece como varillas individuales o en
cadenas cortas. Las dimensiones de las células son de 0.8 a 1 μm en ancho y de 2 a 4 μm de
largo (Wood y Holzapfel 1995). La cepa LGG es de origen humano y puede colonizar el
tracto intestinal, tolera ácidos y bilis, produce una sustancia antimicrobiana y es capaz de
adherirse a las células intestinales humanas (Salminen et al. 1991). La capacidad de LGG de
colonizar el intestino se debe a sus apéndices similares a fimbria y a la producción de
proteínas solubles que pueden aumentar su adherencia a la célula epitelial intestinal. Una
vez unido, el LGG produce tanto una biopelícula que puede proteger mecánicamente la
mucosa como diferentes factores solubles (inhibidor de la proteasa de serpina porcina,
proteínas p75y p40, hidrolasa asociada a la pared celular, gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y otros) que son beneficiosos para el intestino debido a que mejoran la
supervivencia de la cripta intestinal, disminuyen la apoptosis del epitelio intestinal y
preservan la integridad del citoesqueleto (Mantegazzaa et al. 2018). La bacteria LGG
equilibra el ecosistema intestinal, es decir, aumenta el nivel de lactobacilos y bifidobacterias,
promueve la formación de ácidos grasos de cadena corta, disminuye la actividad de las
enzimas procarcinógenas y normaliza la barrera de la mucosa (Salminen et al. 1991)

Los primeros productos lácteos comerciales probióticos con LGG, bajo la marca Gefilus, se
lanzaron en Finlandia en 1990. Después de un comienzo lento, su consumo anual aumentó
rápidamente y alcanzó 6 L/persona (por ejemplo, 3 × 1011 UFC/persona/año) en 1999
(Salminen et al. 2002). La LGG tiene diversas aplicaciones en diversos productos lácteos,
como yogurt, leche fermentada, leche pasteurizada (no cultivada), queso semiduro, y algunos
productos sin leche, como bebidas y complementos alimenticios (cápsulas, tabletas, bolsitas)
(Saxelin et al. 2008). La empresa Valio Ltd. comenzó a desarrollar bebidas no lácteas
con Lb. rhamnosus GG en 1996 y el primer producto se lanzó en 1997. Las bebidas de
frutas Gefilus ® tienen una vida útil de 5 semanas cuando se refrigeran (Prado et al. 2008).

2.6.3. Factores que afectan la viabilidad de los probióticos

Se han identificado varios factores que influyen en la viabilidad de los probióticos en los
productos alimenticios durante el procesamiento y el almacenamiento (Figura 6). Estos

19
factores incluyen: a) parámetros intrínsecos tales como pH, acidez titulable, oxígeno,
actividad del agua, presencia de sal, azúcar y otros compuestos (peróxido de hidrógeno,
bacteriocinas, saborizantes y colorantes artificiales, etc.), b) parámetros de procesamiento
que incluyen condiciones de fermentación (temperatura de incubación , tratamiento térmico,
condiciones de enfriamiento y almacenamiento del producto, materiales de empaque, escala
de producción) y c) parámetros microbiológicos (cepa de probióticos empleados, tasa y
proporción de inoculación) (Terpou et al. 2019)

Figura 6: Factores que afectan la viabilidad de los probióticos en productos alimenticios

durante el procesamiento, almacenamiento y su tránsito a través del tracto gastrointestinal
(GIT).
FUENTE: Terpou et al. (2019).

2.7. PREBIÓTICOS

El termino prebiótico se definió por primera vez en Asia en el año 1995 (Gibson y Roberfroid
1995). Se demostró que la mayoría de los primeros prebióticos evaluados en humanos y
utilizados comercialmente estimulan específicamente a Lactobacillus y Bifidobacterium,
pero no a patógenos como ciertos miembros de la clase Clostridia y Escherichia coli
(Roberfroid et al. 2010). El concepto de prebióticos ha venido evolucionando y en la
actualidad se define como “un sustrato que es utilizado selectivamente por los

20
microorganismos del huésped que confieren un beneficio para la salud”. Los prebióticos no
son las únicas sustancias que pueden afectar el microbiota, los prebióticos deben ser
utilizados selectivamente y tener evidencia adecuada de beneficio para la salud del huésped.

Los efectos sobre la salud de los prebióticos están evolucionando, pero actualmente incluyen
beneficios para el tracto gastrointestinal (por ejemplo, inhibición de patógenos, estimulación
inmunológica), cardiometabolismo (por ejemplo, reducción de los niveles de lípidos en la
sangre, efectos sobre la resistencia a la insulina), salud mental (por ejemplo, metabolitos que
influyen en la función cerebral, la energía y la cognición) y los huesos (por ejemplo,
biodisponibilidad mineral), entre otros (Gibson et al. 2017). Así mismo, los prebióticos
pueden mejorar el crecimiento y la supervivencia de los cultivos probióticos debido a la
sinergia potencial entre los probióticos y prebióticos, los alimentos que contiene una
combinación de estos ingredientes son referidos como simbióticos (Istvan et al. 2008).

Los prebióticos de la dieta no deben ser degradados por las enzimas del huésped objetivo. La
Figura 7 muestra los prebióticos candidatos y aceptados en que los niveles de evidencia
varían actualmente, siendo FOS y GOS los prebióticos más investigados. ácido linoleico
conjugado (CLA), ácido graso poliinsaturado (PUFA), fructooligosacáridos (FOS),
galactooligosacáridos (GOS), mananoligosacárido (MOS), xilooligosacárido (XOS).

Figura 7: Prebióticos en alimentos.

FUENTE: Adaptado de Gibson et al. (2017)

21
La inulina, un polisacárido natural compuesto de una cadena de unidades de fructosa con
una unidad terminal de glucosa (Toneli et al. 2010). La inulina es utilizada para reemplazar
la grasa o fibra dietaria, tiene una capacidad de gelificación alta con el agua, y es considerado
un aditivo alimentario funcional debido a sus propiedades prebióticas, este no es digerido en
el intestino delgado, pero es fermentado en el colon por las bacterias lácticas tales como los
cultivos iniciadores del yogurt, consecuentemente la inulina promueve el crecimiento de las
bacterias saludables, mejora la absorción del calcio, magnesio, reducen el nivel de colesterol
y los lípidos séricos. Además, la fermentación de la inulina puede estimular la formación de
ácidos grasos de cadena corta tales como acetato, propionato y butirato siendo este último el
sustrato energético preferido por colonocitos (Guven et al. 2005). Al respecto existen
investigaciones donde mencionan que la inulina prebiótica podría mejorar la viabilidad de
los probióticos (da Silva Sabo et al. 2015). Las bacterias L. acidophilus FTDC 8033 y L.
casei ATCC 393 crecen bien en leche de soya suplementada con inulina (Yeo y Liong 2010).
Además, da Silva Sabo et al. (2015) también sugirieron que la presencia de 1% de inulina
en el medio de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) aumentó la tasa de crecimiento específico
máximo de L. plantarum ST16 Pa.

22
 III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN

El trabajo de investigación se llevó a cabo en los laboratorios de microbiología,

fisicoquímica, evaluación sensorial e investigación de la Facultad de Industrias Alimentarias
de la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM) y en los laboratorios del
Departamento de Bioquímica de la Universidad de Turku Finlandia (UTU).

3.2. MATERIA PRIMA E INGREDIENTES

Se utilizaron semillas de diez ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet) sin desamargar
y desamargados. Las semillas sin desamargar fueron proporcionados por el Programa de
Leguminosas de la UNALM provenientes de diferentes regiones del Perú como muestra la
Figura 8: (E1) Cajamarca (latitud 6°37'S, longitud 78° 47′O, 2720 m.s.n.m); (E2) Altagracia
de Otuzco-La Libertad (latitud 7°50′S, longitud 78° 34′O, 2641 m.s.n.m); (E3) Paton grande
de La Libertad (latitud 7° 48'S, longitud 78° 02'O, 3169 m.s.n.m); (E4) Cholo fuerte de
Ancash (latitud 9° 32′S, latitud 77° 32′O, 3052 m m.s.n.m); (E5) Huánuco I de Santa Rosa-
Marambuco (latitud 9° 54'S, longitud 76° 8'O, 2912 m.s.n.m); (E6) Compuesto blanco semi
precoz INIA, (E7) H6 INIA y (E8) Moteado beige de Junín (latitud 11° 29′S, longitud 74°
59′O, 3245 m.s.n.m); (E9) Andenes INIA de Cusco (latitud 13° 31′S, longitud 71° 58′O,
3400 m.s.n.m); (E10) Yunguyo de Puno (latitud 16° 14′S, longitud 69° 05′O, 3826 m.s.n.m).
Figura 8. Ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet) de diferentes regiones del Perú.

Como ingredientes se usaron: Azúcar, caldo MRS (De Man, Rogosa & Sharpe, 1960), agar
MRS, glucosa, inulina, solución salina (NaCl 0.85% estéril) y Carboximetil celulosa (CMC).
En relación a los probióticos se usaron dos bacterias ácido lácticas liofilizadas: Lactobacillus
plantarun 299v obtenidas del Instituto de Lactología Industrial (INLAIN, UNL-CONICET),
Facultad de Ingeniería Química Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe Argentina) y
Lactobacillus rhamnosus GG (Oriola Oy, PB 8, Esbo Finlandia).

3.3. MATERIALES, EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

3.3.1. Materiales

Tubos de 15 ml (Sarstedt), filtros de jeringa de 0.2 μm PTFE (VWR international), viales de

1.5 y 2 ml (VWR international), inserto de volumen limitado, asa de kolle, erlenmeyers de
125, 250, 500, etanol 96°, beakers de 10, 50, 100, 250, 300, 500, 1000 ml, Fiolas 5, 10, 25,
50, 100, 250, 500, 1000 ml, pipetas 1, 2, 5, 10, 25 ml, botellas de 500 ml (BOECO),

24
pipeteadores de 5 y 10 ml, placas petri, tubos de vidrio de 15 ml, espátula de drigalsky, tubos
ependorfs, probetas de 100, 500 y 1000 ml

3.3.2. Equipos e instrumentos

Cromatógrafo de gases (HP 6890 y Shimadzu GC-2010 plus), detector de masas HP 5973
MSD, detector de ionización de llamas (FID- Shimadzu Corp), Columna capilar Agilent DB-
1MS (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 µm film thickness, Agilent Technologies Inc., Santa Clara,
CA, USA), UPLC-MS (Waters Acquity) y HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan), detector de
DAD 2996, espectrómetro de masas Waters Quattro Premier (Waters Corp., Milford, MA)
con una interfaz de ionización de electropulverización, columna Phenomenex Aeris péptido
XB-C18 (150 × 4,60 mm, 3,6 µm, Torrance, CA), micropipetas de 10-100ul, 100-1000ul
y 500-5000ul (Sartorius), Vortex-2 Genie (Prolab), balanza analítica Mettler Toledo XS 205
(capacidad máxima 220g, precisión = 0,0001 g), balanza electrónica Mettler PE 360 (GWB),
estufa Memmert, multiblock heater (Lab-line), balanza digital marca OHAUS (capacidad
máxima 1 kg, precisión = 0,0001 g), autoclave Electric Steroclave (SOTU AKL5), Cámara
de flujo laminar ( ULPA –ISOCIDE CLASE II TIPOS A2, LA2-4A3)- 720W), Centrifuga
(Sorvall TC-6, Rotor H-400, Du Pont, Newtown, CT, [Link].), Centrifuga refrigerada
(BOECO GERMANY U-320R), Bomba de vacio Greffenberger Antrieebs technik made in
Germany, rotavapor (Laborota 4000 Heidolph), equipo de purificación de agua MilliQ
Millipore (Elga LabWater, Woodridge, Il, USA), ultrasonido (Ultrasonic Cleaners 5510
Branson), equipo soxhlet, T25 digital Ultra-Turrax high-performance disperser (IKA Werke
GmbH & Co. KG, Staufen, Gemany), refrigerador-Congelador BOSH KDN49, Congeladora
COLDEX CH10P, termómetro (0-100º C ± 2º), agitador magnético (HANNA HI 200M),
potenciómetro (), licuadora Oster X pent (BLSTUB PNC), Microscopio de barrido
eletronico (Thermo Scientific Q250 Analytical SEM, Checoslovaquia), metalizador de oro
(Quorum Technologies modelo Q150R)

3.3.3. Reactivos

Esparteína (97 %), angustifolina (98 %), α-isolupanina perclórica (> 95%) y cafeína (≥ 95%)
fueron obtenidos de ChemFaces (Wuhan, Hubei, China). (+)-lupanina perclórica (97 %)
obtenidas de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Ácido tricloroacético de
Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Ácido clorhídrico (grado, 37 %), sulfato de sodio
(anhidros, granular, ≥ 99 %), y metanol de grado HPLC, acetona, acetonitrilo,

25
diclorometano, y n-hexano de VWR (Espoo, Finlandia), y series homologa de n-alcanos (C8-
C40) de AccuStandard, Inc. (New Haven, CT, USA). Hidróxido de sodio de Merck Group
(Darmstadt, Germany). El agua fue purificada con un sistema (Elga LabWater, Woodridge,
Il, USA) equipado con 0.2 µm de tamaño de partícula.

3.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS

3.4.1. Caracterización físico-química de las semillas de lupino

a. Composición químico proximal

• Humedad: Se determinó mediante la pérdida de peso de la muestra durante un

calentamiento a 105°C hasta obtener un peso constante, según la metodología
establecida por la A.O.A.C. 950.27 (2005).
• Ceniza: Se determinó por incineración a 550°C con la final de eliminar la materia
orgánica, según metodología establecida por la A.O.A.C. 940.26 (2005).
• Proteína cruda: Se determinó mediante el método Kjeldahl, considerando 6.25
como factor de conversión de nitrógeno a proteína, según la metodología establecida
por la A.O.A.C. 920.152 (2005).
• Extracto etéreo: Se determinó siguiendo el método Soxhlet, utilizando hexano como
solvente extractor, siguiendo el método A.O.A.C. 948. 22 (2005).
• Carbohidratos: Se determinó por diferencia, según lo establecido por la A.O.A.C.
(2005).

b. Determinación del tamaño de las semillas de lupino

Para las mediciones de largo y ancho, se tomaron aleatoriamente 25 semillas enteras sin
desamargar parcialmente secas y 25 semillas desamargadas enteras frescas de acuerdo a la
guía de descriptores de lupino (IBPGR 1981).

c. Determinación de pH y acidez titulable

El valor de pH de la bebida antes y después de fermentar se midió usando un pH-metro

digital y la acidez titulable (como porcentaje de ácido láctico) se determinó después de
mezclar la muestra con 10 ml de agua destilada. La titulación se realizó con 0.1N de NaOH
en presencia del indicador de fenolftaleína (1 % p/v) hasta un punto final de color rosa tenue
(Izadi et al. 2015).

26
d. Determinación de los metabolitos secundarios

d.1. Determinación de alcaloides

Se siguió el método reportado por Muzquiz et al. (1994) con algunas modificaciones. Las
semillas de lupino finamente molidas se pesaron con precisión (aproximadamente 0,1 g de
semillas sin desamargar y 1 g de semillas desamargadas) y se agregó cafeína (100 μg) como
estándar interno. Las semillas se homogeneizaron tres veces cada una con 5 ml de ácido
tricloroacético al 5 % utilizando un dispersor de alto rendimiento Ultra-Turrax digital T25 a
una velocidad de 10.6 rpm durante 1 minuto, seguido de centrifugación (10000 x g) durante
10 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes de las tres extracciones se combinaron y
se hidrolizaron con 0,8 ml de NaOH 10 M, y los alcaloides se extrajeron tres veces, cada uno
con 15 ml de diclorometano. Los extractos de diclorometano se combinaron y se evaporaron
a sequedad en un evaporador rotatorio a 30 ºC. El residuo se disolvió en 1 ml de metanol y
se filtró a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0,22 µm en un vial de vidrio para el
análisis. La identificación de los alcaloides fue realizada acorde al método de Przybylak et
al. (2005), con ligeras modificaciones. Para el análisis se utilizó un cromatógrafo de gases
HP 6890 con un detector de masas (MS 5973 MSD) y una columna capilar Agilent DB-1MS
(30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro y 0.25 µm de película interior). El gas portador a
presión constante fue helio. La temperatura del inyector se fijó a 290 °C y la del detector a
300 °C. La temperatura del programa del horno fue isotérmico a 180 °C durante 2 min, luego
se aumentó a 300 °C a una velocidad de 6 °C / min y se mantuvo a 300 °C durante 10 min.
El volumen de inyección fue de 1µL. Los compuestos se identificaron por comparación de
sus espectros de masas y tiempos de retención con los de los estándares puros (lupanina,
esparteína, angustifolina y α-isolupanina) analizados a las mismas condiciones. Así mismo
se calcularon los índices de retención (RI) utilizando una serie homóloga de n-alcanos.

La cuantificación de los alcaloides se realizó con un cromatógrafo de gases con detector de

ionización de llamas (GC-FID) y una columna capilar Agilent DB-1MS (30 m de longitud,
0.25 mm de diámetro y 0.25 µm de película interior. Las temperaturas del inyector y del
detector se fijaron a 290 °C y 300 °C, respectivamente. Las condiciones de elución usadas
fueron las mismas descritas anteriormente para el análisis de GC-MS. Cada extracto fue
inyectado (1 µL) por triplicado, como estándar interno se usó cafeína. La cuantificación de
los alcaloides se realizó usando una curva estándar del patrón respectivo analizado en las
mismas condiciones. Debido a que los estándares de algunos compuestos identificados no

27
estaban disponibles comercialmente o su grado de pureza no era adecuado para fines
cuantitativos, la cuantificación de alcaloides se logró de la siguiente manera: Esparteína,
lupanina, angustifolina y α-isolupanina se cuantificaron utilizando compuestos de referencia,
en tanto nuttalina, multiflorina, oxilupanina y 11, 12-dehidrolupanina se cuantificaron como
lupanina. Los resultados se expresaron como mg /100 g de semilla.

d.2. Determinación de isoflavonas y flavonas

La determinación de isoflavonas y flavonas de las semillas de lupino sin desamargar y

desamargado se desarrolló en dos etapas, la primera tuvo como objetivo la elección del mejor
método y el tipo de solvente de extracción en función de los compuestos fenólicos totales la
segunda consistió en la identificación, cuantificación de las isoflavonas y flavonas en los 10
ecotipos amargos y desamargados.

• Determinación del tipo de solvente y método de extracción

Para la determinación del mejor método y solvente de extracción se utilizaron 3 ecotipos de

sin desamargar, basado en los métodos de Liu et al. (2014) y Gutiérrez et al. (2018) con
ligeras modificaciones. Se evaluaron 03 solventes de extracción: S1 (acetona al 70 %), S2
(metanol al 70%) y S3 (metanol al 70 % acidificado) y dos métodos de extracción: M1
(sonicado por 10min) y M2 (Ultraturrax por 3 min). Se realizaron 3 etapas de extracción: se
pesaron aproximadamente 0.4 g de harina lupino en un tubo de 15 ml. Se añadió 5 ml del
solvente de extracción (S1, S2 o S3), se homogenizaron con el método M1 o M2, y luego se
centrifugaron a 1500 x g durante 5 min (Sorvall TC-6, Rotor H-400, Du Pont, Newtown, CT,
EE. UU.). Se repitió dos veces las tres etapas anteriores de extracción. Los sobrenadantes de
las 3 extracciones fueron combinadas y evaporadas a 35 °C, el extracto se re disolvió en 5
ml de metanol y se filtró a través de un filtro de 0.22 μm antes del análisis.

Para la determinación de compuestos fenólicos totales se siguió el método propuesto por

Chirinos et al. (2013b) con ligeras modificaciones. Se hizo reaccionar 250 μL de reactivos
de Folin Ciocalteu 1 N con 1250 μL de una solución de carbonato de sodio 0.5 M y 500 μL
de muestra (extracto) o agua (blanco). La mezcla se dejó reposar por 30 minutos bajo
oscuridad. Después se midió la absorbancia a 755 nm. El contenido de compuestos fenólicos

28
totales se estimó a partir de una curva estándar de ácido gálico (Anexo 1). Los resultados se
expresaron como mg de equivalente de ácido gálico (EAG)/100 g de semilla.

• Identificación de isoflavonas y flavonas por UPLC-DAD-ESI-MS

Se siguió el método reportado por Liu et al. (2014), y Tian et al. (2017) con ligeras
modificaciones. Las harinas de lupino fueron desengrasadas por el método Soxhlet durante
4 h. Posteriormente, se pesaron aproximadamente 0.4 g de harina lupino sin desamargar y 1
g de harina desamargada en un tubo de 15 ml. Se añadió 5 ml de metanol acuoso al 70 %
acidificado (Metanol: HCl; 99:1), y se homogenizó durante 3 min (Ultra-Turrax). La mezcla
se centrifugó a 18000 x g durante 30 min (Sorvall TC-6, Rotor H-400, Du Pont, Newtown,
CT, EE. UU.). El sobrenadante se recogió y almacenó a -20°C. Para la segunda y tercera
extracción, se agregaron 5 ml del solvente de extracción al residuo, se mezclaron mediante
vortex durante 1 min y se centrifugaron a 18000 x g durante 30 min, y se almacenó a -20
°C. Finalmente, todos los tres extractos fueron recolectados para su análisis.

Para la identificación se utilizó un sistema de cromatografía líquida de ultra performance

(UPLC) Waters Acquity Ultra equipado con un detector de DAD 2996 y un espectrómetro
de masas Waters Quattro Premier (Waters Corp. Milford, MA, EE. UU) con una interfaz de
ionización por electropulverización (ESI) en modo de ion positivo y negativo. Los métodos
relacionados con MS y MS / MS se describieron previamente (Tian et al. 2017). Se usó una
columna Phenomenex Aeris peptide Aeris XB-C18 (150 × 4.60 mm, 3.6 µm, Torrance, CA,
EE. UU) a temperatura ambiente. La separación cromatográfica a un caudal de 1 ml/min y
se inyecto 10 µL de muestra. Como fase móvil se usó agua (A) y acetonitrilo (B), ambas
conteniendo 0.1 % (v/v) de ácido fórmico. Para la identificación de las isoflavonas y flavonas
se usó el programa de gradiente reportado por Tian et al. (2019): Para el análisis de
isoflavonas y flavonas el gradiente de la fase móvil fue: 0-15 min con 8-10 % de disolvente
B, 15-20 min con 10-13 % B, 20-25 min con 13-16 % B, 25-30 min con 16-18 % B, 30-35
min. con 18-20 % B, 35-40 min. con 20-22 % B, 40-45 min con 22-25 % B, 45-50 min con
25-60 % B, 50-55 min con 60-8 % B, 55-57 min con 8 % B. Los cromatogramas se
registraron a 260 nm para isoflavonas y 340 nm para flavonas.

29
• Cuantificación de las isoflavonas y flavonas por HPLC-DAD

La cuantificación de isoflavonas y flavonas se realizó utilizando un sistema de cromatografía

liquida Shimadzu, que consta de un auto muestreador SIL-10A, un horno de columna CTO-
10, dos bombas de LC-10ATvp y un detector de diodos SPD-M10AVP. El análisis se realizó
con 3 repeticiones. La programación de la fase móvil usadas fueron las mismas descritas
anteriormente para el análisis de UPLC-DAD- ESI-MS. El contenido de isoflavonas y
flavonas se determinó usando curvas estándares de los patrones respectivos. Los resultados
se expresaron como mg/100 g de semilla en base seca.

3.4.2. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)

Para el análisis de la microestructura de las semillas de lupino sin desamargar y de la bebida

probiótica optimizada se utilizó un microscopio electrónico de barrido (SEM; Thermo
Scientific Q250 Analytical). Se tomaron imágenes de la cáscara y el cotiledón de las semillas
sin desamargar de lupino con una magnificación de (x 34 y x1200) y (x34 y x280)
respectivamente de acuerdo a la metodología de Mariotti et al. (2006). Las semillas enteras
se seccionaron a lo largo del eje transversal mediante fractura en seco, se montaron en trozos
de aluminio y se recubrieron con pulverizadores de oro, para adquirir las imágenes.

La microestructura de la bebida antes y después de fermentar, así como también la

morfología de las bacterias de Lactobacillus plantarum 299v fueron observadas de acuerdo
a la metodología de Espírito-Santo et al. (2013). Para ello, los extractos de las bebidas se
homogenizaron con una pipeta Pasteur, se tomaron alícuotas y se colocaron sobre el porta
muestras de aluminio y se dejaron secar para la observación. Para la morfología de las
bacterias, se fijó la bebida fermentada a un porta muestras de aluminio al que previamente
se le adhirió una capa de cinta de carbono, luego se le dio un baño de oro por 20 minutos en
un metalizador automático de rotación al vacío. Posteriormente las preparaciones recubiertas
de oro se observaron bajo el SEM y se adquirieron imágenes para cada muestra.

3.4.3. Recuento de células viables

El recuento de células viables en las bebidas de lupino fue analizado antes y después del
proceso de fermentación usando el método reportado por Vinderola y Reinheimer (2003) y
La Norma Internacional ISO 20128 /IDF192. Se pesó 1 g de la bebida y se diluyo
decimalmente con solución salina estéril, luego 0.1 ml de las diluciones de las alícuotas

30
fueron plaqueadas por triplicado en agar MRS. Las placas de agar MRS se incubaron
aeróbicamente durante 72 h a 37 °C y finalmente se realizaron los conteos usando un
contador de colonias. Las unidades formadoras de colonias (UFC) se enumeraron en placas
conteniendo de 30 a 300 colonias y la concentración celular se expresó como log UFC/ml.

3.4.4. Análisis reológico

a. Determinación de la viscosidad aparente

La viscosidad aparente de las muestras homogenizadas fueron medidas usando un

viscosímetro Brookfield rotativo con un spindle N° 4 y 3 rpm a 6 °C. Los resultados fueron
registrados en (cP) después de 50 s de cizallamiento (Izadi et al. 2015).

b. Determinación de firmeza

La firmeza de la bebida después de 1, 7, 14, 21 y 28 de almacenamiento a 6 ºC se

determinaron, usando un texturómetro universal INSTRON (Modelo 3365, Canton MA,
USA) por penetración de 24.5 mm del accesorio cilíndrico de prueba, con una velocidad de
2 mm/s hasta 35 mm de la muestra. Las muestras fueron preparadas en tubos de 50 ml con
un diámetro de 7.5 cm y la relación del diámetro del tubo y el accesorio de prueba fue de
3:1. (Izadi et al. 2015).

3.4.5. Evaluación sensorial de la bebida

La evaluación sensorial de la bebida con la formulación óptima fue realizada a través de una
prueba de aceptabilidad de acuerdo a Ureña et al. (1999). Participaron 80 personas no
entrenadas, cuyas edades comprendían entre 18 - 65 años (profesores, estudiantes y personal
de la UNALM). Los panelistas recibieron muestras en vasos de 100 ml en un volumen de 30
ml a 5 °C por persona, la evaluación se realizó por una escala no estructurada de 1 a 10 cm,
indicando dos opciones (1 = desagrada muchísimo y 10 = agrada muchísimo). La prueba se
realizó en un solo día en orden monádico y aleatoriamente en cabinas individuales con luz
natural sirviendo agua mineral antes de la prueba.

3.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A continuación, se describen las diferentes etapas seguidas en la presente investigación.

31
3.5.1. Tratamiento de las semillas

Las semillas sin desamargar de diez ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet) fueron
seleccionadas y posteriormente molidas en un molino de martillos a un tamaño de partícula
de 100 µm. Las muestras fueron almacenadas a -20 °C para los respetivos análisis (proximal,
identificación y cuantificación de alcaloides, identificación y cuantificación de compuestos
fenólicos)

3.5.2. Desamargado de las semillas de lupino

Las semillas sin desamargar fueron desamargadas según el método de Jacobsen y Mujica
(2006), con ligeras modificaciones. Las semillas se seleccionaron y remojaron en agua
durante 12 h a temperatura ambiente, se cocinaron durante 1 h cambiando el agua cada 30
min. Posteriormente, las semillas fueron lavadas con agua corriente durante cinco días. Las
semillas desamargadas fueron dividida en dos partes, la primera se secó a 50 °C durante 18
h, seguidamente se molieron y en forma de harina se almaceno a -20°C para la identificación
y cuantificación de alcaloides, identificación y cuantificación de isoflavonas y flavonas. La
segunda parte de las semillas desamargadas frescas fueron utilizadas para la elaboración de
la bebida (Figura 9).

32
Figura 9: Proceso de desamargado de las semillas de lupino.

3.5.3. Elaboración de la bebida

En la Figura 10 se muestra el flujo de operaciones para la elaboración de la bebida.

a. Preparación del cultivo iniciador y propagación

La preparación del inóculo se llevó a cabo en una cámara de flujo laminar manteniéndose
las condiciones asépticas. Para obtener concentraciones iniciales de cada bacteria, las
bacterias probióticas de L. plantarum 299v y L. rhamnosus GG fueron activadas en 10 ml de
caldo MRS respectivamente, posteriormente fueron incubadas a 37 °C por 48 h.
Seguidamente fueron sembradas por agotamiento en placas contenidas de agar MRS. Las

33
placas se incubaron a 37 °C por 72 h. Se tomó una colonia aislada de cada placa y se coló en
tubos de 10 ml que contenían caldo MRS y se incubaron a 37 °C por 24 h. Después de la
incubación se tomó 1 % del cultivo en 100 ml de caldo MRS y se incubo por 24 h para que
las bacterias probióticas lleguen aproximadamente a una concentración de 109 UFC/ml. Las
bacterias contenidas en los 100 ml fueron centrifugadas a 6000 rpm por 15 min a 8 °C,
seguidamente se realizaron 2 lavados de los pellets con solución salina. El precipitado fue
resuspendido en solución de sacarosa, la solución resultante fue almacenada en tubos
eppendorf a -35°C. Previa a la etapa de inoculación se activaron las bacterias probióticas en
10 ml de caldo MRS por un tiempo de 24 h, una vez activas, se procedió a la etapa de
incubación.

b. Procedimiento para la obtención de la bebida probiótica fermentada

Para obtener la bebida probiótica se realizaron las siguientes etapas:

• Recepción

Se recepcionaron las semillas desamargadas con un porcentaje de humedad de 71.98 %,

posteriormente se pesaron las semillas de lupino, glucosa, inulina, azúcar y agua.

• Licuado

Las semillas de lupino desamargadas frescas fueron licuadas con una relación de agua (p/v),
se agregó glucosa, azúcar, el tiempo estimado de licuado fue de 2 min.

• Estandarización

La estandarización se llevó cabo a de 32 °C, el extracto licuado fue homogenizado con las
concentraciones de inulina y CMC establecidas de acuerdo al diseño experimental.

• Pasteurización

Se llevó acabo en botellas de vidrio de 500 ml, que contenían un volumen de extracto de 100
ml, las botellas completamente cerradas fueron puestas en un baño sin agitación a 95 ºC por
10 min, con la finalidad de eliminar los gérmenes patógenos y reducir la carga microbiana
presentes en los ingredientes utilizados.

• Enfriamiento

El extracto homogéneo fue enfriado a 42 °C, para luego adicionar las bacterias probióticas.

34
• Inoculación

La preparación del inóculo se llevó a cabo en una cámara de flujo laminar manteniéndose
las condiciones asépticas. La etapa de inoculación consistió en la adición de Lactobacillus
plantarum 299v y Lactobacillus rhamnosus GG en una concentración de 1 %, a 37 °C.

• Incubación

En esta etapa se llevó a cabo la fermentación láctica producida por las bacterias probióticas.
Las botellas de 500 ml inoculadas, fueron incubadas a 37 ºC por 18 h para la identificación
de los factores significativos (Cuadro 6) y por 12 h para la Optimización de la bebida
(Tripathi et al. 2014). La incubación se realizó hasta que la bebida de lupino alcanzó un pH
entre 4.5-4.7, manteniendo la temperatura constante con la finalidad de contribuir al proceso
de fermentación.

• Enfriamiento

La bebida se enfrió en una cámara de refrigeración a 4 ºC con el fin de detener el proceso

de fermentación y evitar el incremento de acidez.

• Batido

Se incorporó pulpa de fruta (fresa) para el saborizar la bebida optimizada.

• Almacenamiento

El almacenamiento de la bebida se llevó a 4 °C y se realizaron los análisis al producto final

(viabilidad de las bacterias, pH, acidez, textura y viscosidad).

35
 PREPARACIÓN DEL INÓCULO BEBIDA PROBIÓTICA

L. plantarum 299v L. rhamnosus GG Semillas de lupino

desamargadas

Activación – MRS
Pesado

Incubación Agua Licuado

Aislamiento de colonias Estandarización

Glucosa
Siembra Azúcar
Inulina Pasteurización
CMC
Incubación en caldo MRS 1er Enfriamiento 42 °C

Centrifugación Inoculación

Lavado Incubación

Re suspensión 2do Enfriamiento 4 °C

Almacenamiento 109 UFC/ml Batido

Activación 10 ml caldo MRS Almacenamiento

Incubación 24h Bebida probiótica

Bacterias activas

Figura 10: Diagrama de flujo para la elaboración de la bebida.

Fuente: Adaptado de Nelson et al. (1976); Gupta et al. (2010).

36
3.6. DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO
3.6.1. Diseño experimental

La presente investigación llevó a cabo en tres etapas, los experimentos se llevaron a cabo
siguiendo el esquema experimental mostrado en la Figura 11.

a. Caracterización fisicoquímica de las semillas de lupino: Etapa I

Se caracterizaron diez ecotipos de L. mutabilis Sweet antes y después del proceso de

desamargado.

b. Optimizar los factores de formulación de la bebida probiótica: Etapa II

b.1. Determinación de los factores que influyen en el crecimiento de las bacterias

probióticas (Screening)
Se determinaron los factores que influyen significativamente en el crecimiento de las
bacterias probióticas durante la elaboración de la bebida a base lupino. Para ello, se usó el
diseño de Taguchi con un arreglo ortogonal L8 (27) (Martil 1991; Ashengropha et al. 2013)
con los siguientes factores: la concentración de lupino (%), concentración de azúcar (%),
tipo bacteria probiótica (L. plantarum 299v y L. rhamnosus GG), concentración de inulina
(%) y concentración de CMC (%) (Cuadro 6). Los factores y sus niveles (Cuadro 6) se
establecieron en base a literatura científica (Ludeña et al. 2016; Mäkinen et al. 2016;
Savedboworn et al. 2017; Lorusso et al. 2018), y pruebas preliminares. El porcentaje de cada
ingrediente en peso/volumen se calculó tomado como base la cantidad de agua.

Cuadro 6: Factores y niveles en el diseño Taguchi L8 (27)

Niveles
Factores 1 2
(Mínimo) (Máximo)
F1→ Lupino (%) 15 65
F2→ Azúcar (%) 2 8
F3→ F1xF2 - -
F4→ Tipo de bacteria L. plantarum L. rhamnosus
F5→ F1xF4 - -
F6→ Inulina (%) 1 2
F7→ CMC (%) 0.2 0.8

37
En el Cuadro 7 se muestran los tratamientos generados por la metodología Taguchi con un
total de ocho tratamientos (formulaciones) por duplicado a ensayar y con el criterio mayor
es mejor. Cabe resaltar que el número de ensayos generados es equivalente a 128 ensayos
que correspondería a un diseño factorial de 27 experimentos.

Cuadro 7: Tratamientos generados por la metodología Taguchi

Ensayos Lupino Azúcar F1xF2 Tipo de F1xF4 Inulina CMC
(%) (%) bacteria (%) (%)
1 65 2 2 L. plantarum 2 1 0.8
2 15 2 1 L. plantarum 1 1 0.2
3 65 2 2 L. rhamnosus 1 2 0.2
4 15 2 1 L. rhamnosus 2 2 0.8
5 15 8 2 L. plantarum 1 2 0.8
6 15 8 2 [Link] 2 1 0.2
7 65 8 1 L. plantarum 2 2 0.2
8 65 8 1 L. rhamnosus 1 1 0.8
9 65 2 2 L. plantarum 2 1 0.8
10 15 2 1 L. plantarum 1 1 0.2
11 65 2 2 L. rhamnosus 1 2 0.2
12 15 2 1 L. rhamnosus 2 2 0.8
13 15 8 2 L. plantarum 1 2 0.8
14 15 8 2 [Link] 2 1 0.2
15 65 8 1 L. plantarum 2 2 0.2
16 65 8 1 L. rhamnosus 1 1 0.8

b.2. Determinación del tiempo de fermentación

Para determinar el tiempo de fermentación de la bebida a base de lupino se estableció como

parámetro deseado el valor de pH (4.5-4.7), que corresponde a un yogurt tradicional (FDA
and Australia New Zealand Food Standard Code Recommendations) y a bebidas no lácteas
(Bianchi et al. 2014; Lorusso et al. 2018). Así mismo, Ankenman y Morr (1996) mencionan
que un valor de pH de 4.7 o menor es importante para conseguir una buena textura, sabor,
aroma y estabilidad en tipo de productos.

38
Se plantearon las siguientes formulaciones preliminares: a) formulación 1: 66 % de lupino,
9 g de azúcar, 1 g de glucosa, 1 g de inulina, 0.2 g de CMC y 1 % de inóculo (Savedboworn
y Wanchaitanawong 2015) y b) formulación 2: 20 % de lupino, 2 g de azúcar, 1 g de glucosa,
1g de inulina, 0.8 g de CMC y 1 % de inóculo. La formulación 1 se fermentó durante 18 h
(Shirai et al. 1992) y la formulación 2 durante 12 h (Ludeña et al. 2016) usando las bacterias
probióticas (L. plantarum 299v y L. rhamnosus GG).

b.3. Optimización de la bebida

La bebida se optimizó mediante la Metodología de Superficie Respuesta (MSR) (Gupta et

al. 2010; Zanninia et al. 2018) usando como factores los identificados en la etapa de
Screnning y como variables respuestas la tasa de crecimiento de las bacterias probióticas y
pH de la bebida 4.5-4.7. Los niveles de los factores usados en la optimización se muestran
en el Cuadro 8. El Diseño central compuesto frontal (23) con 4 punto centrales usado en la
optimización se muestra en el Cuadro 9.

Cuadro 8: Niveles mínimos y máximos de los factores para la optimización de la bebida

Niveles
Factores -1 0 1
Lupino (%) 20 30 40
Azúcar (%) 6 7 8

El diseño empleado en la elaboración de la bebida a base de lupino, en términos de variables

sin codificar se muestra en la Cuadro 9.

39
Cuadro 9: Diseño empleado para la optimización por el método de superficie respuesta

Ensayos Lupino Azúcar Tasa de pH

(%) (%) crecimiento
(%)
1 30 8 - -
2 30 7 - -
3 20 6 - -
4 30 7 - -
5 20 7 - -
6 40 7 - -
7 40 8 - -
8 30 7 - -
9 30 7 - -
10 30 6 - -
11 20 8 - -
12 40 6 - -

c. Caracterización y estabilidad de la bebida probiótica: Etapa III

c.1. Evaluación sensorial

Se realizaron pruebas de aceptabilidad general de la formulación óptima de la bebida

probiótica, con la finalidad de evaluar la reacción del consumidor frente al producto final.

c.2. Estabilidad durante el almacenamiento

El pH, acidez, viscosidad y viabilidad de las bacterias de L. plantarum 299v se evaluaron en

la formulación óptima a 1, 7, 14, 21 y 28 días de almacenamiento a 4 °C de acuerdo a lo
descrito para bebidas con fuentes no lácteas (Aragon-Alegro et al. 2007).

40
Figura 11: Diseño experimental para la obtención de la bebida probiótica de lupino.

41
3.6.2. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos realizados en el presente trabajo se agrupan de acuerdo a las tres
etapas del diseño experimental:

Etapa I:

Los resultados del contenido de alcaloides, proteínas, compuestos fenólicos totales y

flavonoides (isoflavonas y flavonas) fueron analizados mediante el Diseño Completamente
al Azar (DCA), para evaluar las diferencias entre los diez ecotipos. Sí el ANOVA del DCA
es significativo, se realizó la prueba HSD de Tukey para la comparación de medias. Los
análisis estadísticos se realizaron, utilizando el software Statgraphics 18 (Statistical
Graphics, Washington, DC, EE. UU.).

Etapa II:

• La identificación de los factores significativos en la elaboración de la bebida se realizó

mediante la metodología Taguchi con un arreglo ortogonal L8 (27), para ello se utilizó el
sofware statistica v.7 (SatSoft Inc., USA)

• La optimización de los parámetros de formulación de la bebida se realizó mediante el

Método de Superficie Respuesta con un Diseño central compuesto frontal (23), con 4
punto centrales (12 experimentos) usando el software Desing expert (Versión 11) (Stat-
Ease Corporation, [Link].). Los valores de P < 0.05 se consideraron estadísticamente
significativos.

42
 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y METABOLITOS

SECUNDARIOS DE LAS SEMILLAS DE LUPINO
4.1.1. Caracterización físico-química de las semillas de lupino

a. Composición químico proximal

La composición químico proximal de los 10 ecotipos antes del proceso de desamargado se

muestran en el Cuadro 10. Se observa que el ecotipo Altagracia presenta mayor contenido
de proteínas (E2 = 49.3 %) comparado a los otros ecotipos, y el de menor contenido el
ecotipo Huánuco I (E5 = 45.2 %). Dichas diferencias pueden estar asociados con factores
genéticos y agronómicos (Roder et al. 2013; Carvajal-Larenas et al. 2016). El contenido de
proteínas promedio en los 10 ecotipos fue de 47.3 %, valor que se encuentra dentro del rango
de 32.0-52.6 % reportado por Carvajal-Larenas et al. (2016). Así mismo, es mayor respecto
a otras variedades como L. albus (38. 2 %), L. angustifolius (33.95 %) y L. luteos (42.2 %)
(Jiménez- Martínez et al. 2003b). Respecto al contenido de grasa, el ecotipo con mayor
contenido fue Andenes INIA (E9 = 20.8 %), proveniente del Departamento de Cusco y el de
menor concentración fue el ecotipo Yunguyo de Puno (E10 = 15.3 %). El contenido de grasa
promedio de los 10 ecotipos fue 17.8 %, encontrándose este valor dentro del rango de 13.0
a 24.6 % reportado por Carvalho et al. (2005). El promedio del contenido de cenizas en los
10 ecotipos fue de 3.7 %, resultados que concuerdan con los reportados por Güémes-Vera et
al. (2008).

El ecotipo con mayor contenido de carbohidratos fue Huánuco I (E5 = 34 %), y el de menor
contenido el ecotipo de Cusco (E9 = 27.7 %). El promedio del contenido de carbohidratos
fue 31.1 %, que se encuentra dentro de los valores de 26.1 y 43.2 % reportados por Jiménez-
Martínez et al. (2003b). Respecto al contenido de ceniza dentro de los 10 ecotipos evaluados,
el ecotipo con mayor contenido de ceniza fue E5 con 4.9 %, proveniente de Huánuco y con
menor contenido los ecotipos E2 de la Libertad y E6, E7 de Junín.
Cuadro 10: Composición químico proximal de 10 ecotipos de lupinos (Lupinus
mutabilis Sweet) sin desamargar (porcentaje en base seca)

Ecotipos Materia Proteína Grasa Ceniza Carbohidratos

seca (%) (%) (%) (%) (%)
E1 90.1±0.03 46.8±0.06c 15.9±0.01b 3.8±0.01d 33.4±0.03h
E2 90.2±0.02 49.3±0.06h 17.3±0.03c 3.2±0.03ab 30.1±0.06c
E3 90.2±0.02 48.5±0.06g 18.5±0.06e 3.5±0.03c 29.5±0.15b
E4 90.6±0.03 45.4±0.03b 18.1±0.03d 3.8±0.02d 32.7±0.08g
E5 90.1±0.03 45.2±0.02a 15.9±0.03b 4.9±0.01h 34.0±0.06i
E6 90.3±0.03 47.4±0.07de 19.0±0.05f 3.1±0.03a 30.5±0.10d
E7 90.6±0.02 47.7±0.05f 18.9±0.03f 3.2±0.03b 30.2±0.04c
E8 90.4±0.03 47.2±0.06d 18.1±0.06d 3.5±0.03c 31.2±0.15e
E9 89.5±0.03 47.4±0.03e 20.8±0.04g 4.1±0.01e 27.7±0.01a
E10 89.5±0.02 48.5±0.04g 15.3±0.04a 4.3±0.03f 31.9±0.05f
Resultados expresados como promedio ± desviación estándar.
Valores con letras diferentes (a-i) dentro de la misma columna difieren significativamente (p < 0.05)
E1: ecotipo Cajamarca; E2: ecotipo Altagracia de Otuzco-La Libertad; E3: ecotipo Paton grande de La
Libertad; E4: ecotipo Cholo fuerte de Ancash; E5: ecotipo Huánuco I de Santa Rosa-Marambuco; E6:
ecotipo Compuesto blanco semi precoz INIA; E7: ecotipo H6 INIA; E8: ecotipo Moteado beige de
Junín; E9: ecotipo Andenes INIA de Cusco y E10: ecotipo Yunguyo de Puno.

Respecto a las semillas desamargadas, al comparar la concentración de proteínas en los

Cuadro 10 y 11, se observan que tienen una mayor concentración de proteínas comparado a
las semillas sin desamargar. El proceso de desamargado acuoso puede inducir a cambios en
la composición química de los lupinos al disminuir carbohidratos, alcaloides, taninos, entre
otros compuestos soluble en agua lo que permite el aumento relativo de la proteína (Villacrés
et al. 2000; Carvajal-Larenas et al. 2016). Así mismo, el pH y la temperatura influyen en la
desnaturalización de las proteínas y la disminución de la solubilidad Jiménez-Martínez et al.
(2001). El contenido de proteína expresada en base seca difiere estadísticamente entre cada
ecotipo, siendo el ecotipo Altagracia proveniente de La Libertad-norte del Perú (E2), el que
presenta mayor contenido (52.2 %) y el de menor concentración (48.0 %) el ecotipo Huánuco
I de Santa Rosa- Marambuco del centro del Perú (Cuadro 10). El promedio del contenido de
proteínas en las semillas desamargadas es 50.2 %, valor que se encuentra dentro del rango
(51.1 -72.0 %) reportado en trabajos anteriores (Villacrés et al. 2000; Carbajal-Larenas et
al. 2016). Referido a otros componentes Curti et al. (2018), mencionan que el proceso de

44
desamargado modifica el contenido de ácidos grasos; así el contenido ácido esteárico
aumenta y el contenido de ácido linoleico y la relación w-6/w-3 disminuye.

Cuadro 11: Análisis de proteína de 10 ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet)

desamargados (porcentaje en base seca)

Ecotipos Materia seca Proteína

(%) (%)
E1 93.5±0.05 49.5±0.00c
E2 93.4±0.05 52.2±0.03h
E3 93.5±0.02 51.3±0.06g
E4 93.9±0.02 48.3±0.03b
E5 93.4±0.07 48.0±0.08a
E6 93.5±0.01 50.3±0.06e
E7 93.5±0.02 50.7±0.05f
E8 93.6±0.01 50.1±0.05d
E9 92.8±0.01 50.2±0.04e
E10 92.8±0.02 51.3±0.04g
Valores expresados como promedio ± desviación estándar. Valores con letras diferentes (a-h) dentro de la
misma columna difieren significativamente (p < 0.05).
E1: ecotipo Cajamarca; E2: ecotipo Altagracia de Otuzco-La Libertad; E3: ecotipo Paton grande de La
Libertad; E4: ecotipo Cholo fuerte de Ancash; E5: ecotipo Huánuco I de Santa Rosa-Marambuco; E6: ecotipo
Compuesto blanco semi precoz INIA; E7: ecotipo H6 INIA; E8: ecotipo Moteado beige de Junín; E9: ecotipo
Andenes INIA de Cusco y E10: ecotipo Yunguyo de Puno.

b. Tamaño

Las semillas de lupino del ecotipo Altagracia a una humedad de 9.8 % presentaron una
estructura rígida y con el proceso de desamargado las semillas incrementaron su humedad a
71.98 % haciéndolas más suave y consecuentemente más sensibles a procesos mecánicos.
Así mismo, Jiménez-Martínez et al. (2001) menciona que el remojo y la cocción de las
semillas aumentan la permeabilidad de la pared celular. Similar comportamiento ha sido
observado en diferentes frijoles adzuki (Oliveira et al. 2013). Al respecto, Miano et al.
(2015) mencionan que la humedad aumenta con el tiempo de remojo del grano, describiendo
un comportamiento sigmoidal, con una fase de retraso inicial seguida de una fase de mayor
tasa de absorción y, finalmente, una fase estacionaria. En cuanto al tamaño, las semillas sin
desamargar midieron, 1 y 0.8 cm de largo y ancho respectivamente, mientras que las semillas
desamargadas incrementaron su tamaño a 1.5 y 1 cm largo y ancho respectivamente (Figura

45
12). Ortega et al. (2010) mencionan que el agua absorbida es almacenada en la estructura
porosa de las semillas, hidratando el interior de las células y los espacios entre las paredes
celulares. Esto produce un aumento en el volumen total y cambios en tamaño y estructura
no reversibles cuando las semillas son secadas nuevamente.

Figura12: Semillas de Lupinus mutabilis S. Ecotipo Altagracia: A) sin desamargar

hidratadas, B) desamargadas.

c. Microestructura

Las imágenes SEM de las semillas sin desamargar del ecotipo Altagracia mostraron
diferencias estructurales entre la cáscara y el cotiledón (Figura 13). El cotiledón (Figura 13A
y B) presenta una superficie rugosa, y al ser magnificada (1200x) se puede observar una
estructura porosa con cavidades triangulares ordenadas homogéneamente. Estas estructuras
sumadas al hilum facilitarían el ingreso de solventes y la salida de solutos presentes en el
grano. Miano et al. (2015) han confirmado que el hilum y fisura hiliar es la entrada principal
de agua al grano. Por otro lado, la cáscara muestra una apariencia lisa (Figura 13 C y D), a
un mayor aumento (280x) la estructura es bastante plana. Al respecto Miano et al. (2015),
señalan que la superficie de la cubierta de la semilla está revestida por una cutícula que
contiene diferentes tipos de sustancias hidrofóbicas tales como cera, polisacáridos de lignina,
pectina, callos, quinonas, suberina, cutina que afectan la permeabilidad de las semillas de
lupino. Finalmente, la cubierta también contiene los compuestos fenólicos muy similares a
semillas de otras legumbres (Patterson et al. 2017).

46
Figura 13: Micrografía de la semilla sin desamargar: A) Cotiledón (34x), a: Hilum; B)
Ampliación del cotiledón (1200x); C) Cáscara (34x); D) Ampliación de cáscara (280x).

4.1.2. Metabolitos secundarios

a. Identificación y cuantificación de alcaloides en semillas sin desamargar y

desamargadas
• Alcaloides individuales en las semillas sin desamargar y desamargadas

Los alcaloides individuales fueron identificados por GC-MS en función de sus iones
característicos y por los tiempos de retención de los estándares. En las semillas sin
desamargar se identificaron ocho alcaloides, tales como: esparteína, angustifolina, α-
isolupanina, lupanina, nutallina, multiflorina, oxilupanina y 11, 12-dehidrolupanina (Cuadro
12). El perfil obtenido para los ecotipos estudiados fue similar a los hallazgos de estudios
anteriores de Muzquiz et al. (1994) y Wink et al. (1995). Aunque se han descrito otros
alcaloides tales como 13-hidroxlupanina, 17-oxosparteína y 11,12-deshidrosparteína en L.
mutabilis (Hatzold et al. 1983; Gross et al. 1988), que no se identificaron en los ecotipos
investigados. Algunos de los alcaloides detectados en las semillas estudiadas también son
comunes en otras especies, como angustifolina, lupanina y esparteína en semillas de L. albus,
esparteína en L. luteus, lupanina en L. hispanicus y angustifolina en L. angustifolius
(Jiménez-Martínez et al. 2001; Romeo et al. 2018).

47
Cuadro 12: Perfil de alcaloides en los ecotipos y parámetro de lipofilia (Log P)

Picos Alcaloides Iones identificados M+ ID RI /Exp RI/Lit Log P

1 Cafeína (Estándar interno) 194/109/82/67/55 194 S - - -
2 Esparteína 98/137/193/234 234 S 1803 1785 2.5
3 Angustifolina 55/94/112/150/193 234 S 2093 2083 1.4
4 α- Isolupanina 55/98/136/149/219/248 248 S 2122 2105 1.6
5 Lupanina 55/98/136/149/248 248 S 2176 2165 1.6
6 Nutallina 98/136/150/247/264 264 T 2271 2255 0.6
7 Multiflorina 55/110/134/149/246 246 T 2328 2310 1.5
8 Oxilupanina 55/134/152/165/246/264 264 T 2423 2410 0.6
9 11,12- Dehidrolupanina 134/148/231/246 246 T 2573 2190 1.5

M+: ion molecular; RI/Exp: Índice de retención obtenido en el experimento, calculado de acuerdo a Kovats [30]: 100 (tc-tn/ (tn+1)-tn) +n, donde tc es el tiempo
de retención del compuesto, tn es el tiempo de retención anterior n- alcano, tn+1 es el tiempo de retención del siguiente n-alcano and n es el anterior n-alcano;
RI/Lit: Índice de retención descrito en la literatura por Wink et al. (1995); ID: Identificación; S: Identificado por comparación con un estándar autentico, T:
Identificación tentativa por comparación de espectros de masa y RI en la literatura Wink et al. (1995) y NIST 05 base de datos. Log P: Valor del parámetro de
lipofilia, Calculado por XLogP3 3.0

48
Por otro lado, se presenta el parámetro de lipofilia (Log P) de los alcaloides individuales
identificados (Cuadro 12), este parámetro muestra las posibles relaciones entre estructura y
actividad (SAR). Se observa que la esparteína tiene el log P más alto (2,5) en comparación
a los otros alcaloides tales como lupanina, α -isolupanina, 11, 12-dehidrolupanina,
multiflorina y angustifolina con un promedio de Log P (1,5). Los alcaloides con los valores
más bajos de Log P fueron la nutallina y la oxilupanina. Es importante resaltar que los
alcaloides con Log P más alto son más hidrófobos, propiedad que facilita la entrada de los
alcaloides a las células a través de las membranas celulares hidrófobas (Kučerka et al. 2019).

Respecto al contenido de alcaloides individuales en las semillas sin desamargar de los diez
ecotipos, se encontró como alcaloide principal a la lupanina con un contenido entre 2.5-5.2
g/100 g en b.s. constituyendo en promedio el 77.2 % de los alcaloides totales (Cuadro 13).
Estos resultados concuerdan con los hallazgos de Gross et al. (1988) que mencionan que la
lupanina es el principal alcaloide en L. mutabilis, y representa más del 80 % de los alcaloides
totales. Así mismo, Rybiński et al. (2018) encontraron que la lupanina en L. albus representa
el 71.3 % de los alcaloides totales, siendo este valor más bajo en comparación con el nivel
reportado en L. mutabilis. Entre los ecotipos estudiados, E8 (Moteado beige de Junin) tuvo
mayor contenido de lupanina y alcaloides totales. El segundo alcaloide más abundante fue
esparteína con un rango de concentración de 0.2-0.9 g/100 g en b.s., resultado similar a
estudios de composición de alcaloides en semillas de L. mutabilis (Hatzold et al. 1983). La
esparteína representó en promedio el 9.9 % del total de alcaloides, y el ecotipo con el mayor
contenido de esparteína fue E5 (Huánuco I). Los alcaloides presentes en proporciones más
pequeñas incluyen la angustifolina y la multiflorina, ambos presentes en un nivel promedio
de 0.1 % de los alcaloides totales (Cuadro 13). Las proporciones relativas de estos dos
alcaloides son más bajas en comparación con las reportadas anteriormente para L. albus
(angustifolina 3.8 % y multiflorina 6.8 % del total de alcaloides) (Rybiński et al. 2018).
Finalmente, otros alcaloides presentes en los diez ecotipos amargos incluyen α-isolupanina,
nutallina, oxilupanina y 11,12-dehidrolupanina, que representan en promedio 0.4, 6.8, 4.0 y
1.4 % del total de alcaloides, respectivamente.

49
Cuadro 13: Alcaloides en semillas de lupino (Lupinus mutabilis Sweet) sin desamargar y desamargadas, determinadas por CG- FID (g/100
g b.s)

Alcaloides individualesa
Semillas Ecotipos Esparteína Angustifolina α- Isolupanina Lupanina Nuttalina Multiflorina Oxilupanina 11,12-
Dehidrolupanina
E1 0.640±0.008 f 0.005±0.000 bc 0.015±0.000 c 2.958±0.008 b 0.452±0.006 f 0.012±0.000 e 0.177±0.006 bc 0.083±0.003 d
E2 0.421±0.005 d 0.004±0.000 a,b 0.021±0.000 d 4.307±0.146 d 0.505±0.008 g 0.003±0.000 b 0.141±0.011 ab 0.052±0.000 b
E3 0.592±0.017 e 0.013±0.000 g 0.012±0.001 ab 4.262±0.179 d 0.546±0.015 h 0.008±0.000 d 0.220±0.014 cd 0.077±0.003 cd
E4 0.774±0.029 g 0.003±0.000 a 0.014±0.000 bc 3.322±0.014 c 0.375±0.030 e 0.010±0.000 d 0.099±0.001 a 0.031±0.000 a
Sin E5 0.890±0.017 h 0.007±0.000 e 0.010±0.000 a 2.504±0.044 a 0.281±0.008 cd 0.006±0.000 c 0.160±0.008b 0.047±0.001 ab
desamargar E6 0.274±0.004 b 0.009±0.000 f 0.027±0.000 e 4.164±0.026 d 0.314±0.004 d 0.001±0.000 a 0.263±0.016 de 0.099±0.003 e
E7 0.423±0.008 d 0.009±0.000 f 0.019±0.000 d 3.354±0.061 c 0.262±0.008 bc 0.003±0.000 b 0.233±0.013 cd 0.062±0.002 bc
E8 0.196±0.002 a 0.009±0.000 ef 0.027±0.000 e 5.231±0.045 f 0.145±0.003 a 0.001±0.001 a 0.294±0.016 e 0.073±0.003 cd
E9 0.377±0.003 c 0.009±0.000 f 0.020±0.000 d 4.771±0.065 e 0.236±0.010 b 0.001±0.000 a 0.266±0.026 de 0.099±0.001 e
E10 0.367±0.014 c 0.005±0.000 d 0.016±0.002 c 3.612±0.261 c 0.275±0.022 bcd 0.001±0.000 a 0.149±0.047 ab 0.069±0.016 cd
E1 0.002±0.000 e n/d n/d 0.003±0.000 c n/d n/d n/d n/d
E2 0.001±0.000 bc n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d
E3 0.001±0.000 a n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d
E4 0.002±0.000 d n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d

Desamargadas E5 0.001±0.000 ab n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d

E6 0.001±0.000 bc n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d
E7 0.001±0.000 bc n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d
E8 0.001±0.000 ab n/d n/d 0.002±0.000 b n/d n/d n/d n/d
E9 0.001±0.000 c n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d
E10 0.001±0.000 ab n/d n/d 0.001±0.000 a n/d n/d n/d n/d
aValores expresados como promedio ± desviación estándar. Valores con letras diferentes (a-h) dentro de la misma columna difieren significativamente (p < 0.05); n/d = no detectado (es decir por
debajo del límite de detección), b.s: base seca.
E1: ecotipo Cajamarca; E2: ecotipo Altagracia de Otuzco-La Libertad; E3: ecotipo Paton grande de La Libertad; E4: ecotipo Cholo fuerte de Ancash; E5: ecotipo Huánuco I de Santa Rosa-
Marambuco; E6: ecotipo Compuesto blanco semi precoz INIA; E7: ecotipo H6 INIA; E8: ecotipo Moteado beige de Junín; E9: ecotipo Andenes INIA de Cusco y E10: ecotipo Yunguyo de Puno.

50
Posterior al proceso de desamargado, sólo se identificaron dos alcaloides predominantes,
esparteína y lupanina en los diez ecotipos, mientras que no se detectaron los alcaloides que
estaban presentes en concentraciones más bajas en las semillas sin desamargar. El Cuadro
13 muestra los contenidos de lupanina y esparteína de 0.001-0.002 y 0.001-0.003 g/100 g,
respectivamente. Después del proceso de desamargado, el promedio del contenido de
esparteína representa el 54% y lupanina el 46% de los alcaloides totales. Estos alcaloides
(lupanina y esparteína), se redujeron en promedio de 99,9 y 99,7%, respectivamente. El nivel
de disminución en el contenido de lupanina es muy similar al obtenido por Santana et al.
(1996), quienes reportaron la eliminación del 99% del contenido inicial de lupanina presente
en las semillas de L. albus después de un proceso de fermentación. Durante la fermentación,
las bacterias utilizan la lupanina como fuente de carbono y energía.

• Alcaloides totales en semillas sin desamargar y desamargadas

El contenido total de alcaloides en las semillas de lupino sin desamargar se muestra en la

Figura 14A. Todos los ecotipos pueden considerarse variedades amargas, por su contenido
de alcaloides ≥ 5 g/100 g en b.s., mientras que el contenido en variedades no amargas
generalmente está entre 0.01-0.05 g/100 g en b.s. (Jiménez-Martínez et al. 2007). Los
ecotipos con mayor contenido de alcaloides fueron E2, E3, E6, E8 y E9, cada uno de los
cuales alcanzó un nivel cercano a 6 g/100 g en b.s. Los ecotipos E2 y E3 eran de la misma
región, pero de diferentes altitudes (3350 y 3496 metros a nivel del mar, respectivamente),
mientras que los ecotipos E6 y E8 eran de la parte central del Perú y el ecotipo E9 del sur de
Perú, pero todos fueron cultivados a altitudes similares. Los ecotipos que contenían niveles
intermedios de alcaloides (cerca del 5 g/100 g en b.s.) fueron E1, E4, E7 y E10, y el ecotipo
que contenía menos alcaloides fue E5 con un contenido total de 4 g/100 g en b.s. Ecotipos
con mayor contenido de alcaloides se cultivan en lugares a más de 3280 metros sobre el nivel
del mar, en estas zonas alto andinas, el clima es seco, templado y con baja humedad,
favoreciendo la acumulación de los alcaloides (Carvajal-Larenas et al. 2016). El contenido
de alcaloides es menor en los ecotipos cultivados a una altitud inferior a 3271 m.s.n.m y
superior a 3761 m.s.n.m. Estas diferencias pueden estar influenciadas por las diferencias
varietales, distribución de alcaloides en la planta y el tipo suelo de cultivo (Frick et al. 2018).

51
 A
B
A l c a l o i d e s t o t a l e s ( g / 1 0 0 g b .s .)

A l c a l o i d e s t o t a l e s ( g / 1 0 0 g b .s .)
0 .0 0 5
7
cd d cd
bc a
6 0 .0 0 4
b bc
a a
5 a a d
e bc bc
0 .0 0 3 cd bc bc
4 cd
d

3 0 .0 0 2

2
0 .0 0 1
1

0 0 .0 0 0
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10

Figura 14: Contenido de alcaloides totales en los diez ecotipos de Lupinus mutabilis. (A) Antes del proceso de desamargado; (B) después del
proceso de desamargado. Las barras representan la desviación estándar de tres réplicas independientes. Los valores con letras diferentes (a-e)
difieren significativamente (p <0.05)

52
El contenido de alcaloides totales en las semillas sin desamargar fue de 4 a 6 g/100 g b.s.,
siendo este resultado mayor comparado a los reportados en estudios previos de semillas de
L. mutabilis. Al respecto, Hatzold et al. (1983) reportaron contenidos totales de alcaloides
de 3.1 % en L. mutabilis. Así mismo, Gross et al. (1988) reportaron niveles bajos en
variedades modificadas de L. mutabilis ("Inti" 0.0075% y "2150" 0.015%). El nivel de
alcaloides totales de los ecotipos resultó ser mayor a otras variedades tales como L.
campestri, L. angustifolius, L. hispanicus, L. luteus y L. albus (1.9 a 2.7 %) (Jiménez-
Martínez et al. 2007).

En relación al contenido de alcaloides totales en las semillas desamargadas se muestran en

la Figura 14B. Todos los ecotipos presentaron contenidos de alcaloides residuales muy bajos
con promedio de 0.003 g/100 g en b.s. Los niveles residuales en las semillas desamargadas
son mucho más bajos que el límite permisible (20 mg/100 g) para el consumo humano y
animal (Calabrò et al. 2015). La disminución de los alcaloides en las semillas desamargadas
se debe a la solubilización en agua y la degradación térmica de los alcaloides y el incremento
de la permeabilidad del tegumento, lo que facilita la eliminación de los alcaloides (Jimenez-
Martínez et al. 2001; Frick et al. 2018). Así mismo, se puede observar que existen diferencias
en el porcentaje de disminución de alcaloides entre los ecotipos después del desamargado,
que explicarse por las diferencias en la estructura y composición del grano (Miano et al.
2015).

• Distribución de los alcaloides en los diferentes ecotipos

Se aplicó un análisis de componentes principales (PCA) para identificar patrones en el

conjunto de datos que resaltan las posibles similitudes y diferencias entre los ecotipos de
lupino, en términos de composición de alcaloides. Se retuvieron dos componentes
principales (PC), correspondientes a valores propios que explicaban el 73,6% de la
variabilidad total de los datos. El primer componente (PC1) fue responsable del 17% de la
variación, explicado principalmente por esparteína, nuttalina y multiflorina (Figura 15),
mientras que el componente dos (PC2) representó el 56.6% de la variación y se asoció con
el contenido total de alcaloides y con los compuestos como lupanina, oxilupanina,
angustifolina, α-isolupanina y 11,12-dehidrolupanina. Como se muestra en la Figura 15, los
ecotipos de lupino estudiados se dividieron en tres grupos. Un grupo incluye E8, E9 y E6
por presentar niveles más altos de lupanina, oxilupanina, angustifolina, α-isolupanina y 11,

53
12-dehidrolupanina, y un contenido más bajo de esparteína. E1, E3, E4 y E5 forman otro
grupo, del cual E1 y E3 tienen menos esparteína, pero más multiflorina y nuttalina en
comparación a otros ecotipos. E4 y E5 aparecen en el lado negativo de PC1 y PC2 con un
bajo contenido de lupanina, α-isolupanina, oxilupanina, angustifolina y 11, 12
dehidrolupanina, pero con mayor contenido de esparteína en comparación con otros
ecotipos. E2, E7 y E10 son similares con respecto a cada alcaloide. Los ecotipos con
contenidos más altos de lupanina tenían menor contenido de esparteína, mostrando una
relación inversa entre los contenidos de los dos alcaloides principales. En el futuro, los
alcaloides aislados se pueden seleccionar para aplicaciones farmacológicas y fertilizantes.
Para este propósito, se pueden tomar semillas de las regiones altoandinas de Junín y
Huánuco, que tienen un alto contenido de alcaloides totales con mayor contenido de lupanina
y esparteína, respectivamente.

Figura 15. Proyección de ecotipos de lupino y cargas por alcaloides en el plano compuesto
por componentes principales PC1 y PC2 que explican el 73,6% de la varianza total.

54
b. Identificación y cuantificación de isoflavonas y flavonas en semillas sin desamargar
y desamargadas.

• Selección del solvente y el método de extracción

Para seleccionar el tipo solvente y el método de extracción de isoflavonas y flavonas se

evaluaron 3 ecotipos de semillas de lupino sin desamargar en términos del contenido de
compuestos fenólicos. Del Cuadro 14, se observa que existen diferencias significativas entre
los 6 tratamientos (Método*Solvente) (p<0.05) con excepción del ecotipo (E5) (p<0.064)
para la extracción de compuestos fenólicos. Por otro lado, no existe diferencias significativas
(p>0.05) en la concentración de compuestos fenólicos de los ecotipos E1, E5 y E7, al
comparar los métodos de extracción (Ultraturrax y Sonicado). Sin embargo, si existe
diferencias significativas (p<0.05) entre los tipos de solventes utilizados, obteniéndose la
mayor concentración de compuestos fenólicos con el solvente S3 (metanol al 70 %
acidificado), está comportamiento fue similar en los tres ecotipos. Estos resultados
confirman que el metanol es más eficiente en la extracción de polifenoles de bajo peso
molecular (Dai et al. 2010).

De acuerdo al comportamiento observado en los tres ecotipos durante las interacciones

(método*solvente), y efecto de cada factor (método y solvente) sobre la concentración de
compuesto fenólicos. El presente estudio consideró elegir el método de Ultraturrax, en vista
que utiliza un menor tiempo de extracción (factor eficiencia) y el solvente S3 (metanol al
70% acidificado), ya que con este nivel se obtienen mayor concentración de compuestos
fenólicos en los tres ecotipos evaluados. El contenido de compuestos fenólicos de los tres
ecotipos evaluados a las condiciones elegidas fluctúan entre 8.92 y 10.6 mg EAG /g en b.s.
Valores similares han sido reportados por Chirinos et al. (2013a), quienes evaluaron 27
plantas peruanas dentro de ellas Lupinus mutabilis Sweet con un valor de 12.1 mg EAG /g
b.s. Así mismo, al comparar con otras leguminosas como el garbanzo los resultados
obtenidos fueron similares con valores de 10.8 mg de EAG /g (Sreerama et al. 2012).

55
Cuadro 14: Efecto del método de extracción y el tipo de solvente en el contenido de
compuestos fenólicos totales EAG (mg/100 g) de semillas sin desamargar

Factores en estudio Ecotipos

Tratamiento Método Solvente E1 E5 E7
T1 S1 9.30 ± 0.07ab 7.72 ± 0.14ab 7.52± 1.31c
T2 Sonicado S2 9.40 ± 0.01ab 6.77±1.54b 9.61±0.30 ab
T3 S3 9.80 ± 0.15a 8.24± 0.12ab 10.32 ± 0.13a
T4 S1 7.91 ± 1.22b 7.90 ± 0.31ab 8.30 ± 0.20bc
T5 Ultraturrax S2 8.09 ± 0.83b 7.31±0.81ab 7.35 ± 0.11c
T6 S3 10.6 ± 0.06a 8.92 ± 0.61a 10.59±0.01 a
p (Método*Solvente) 0.001 0.064 0.000
Sonicado 9.50±0.25a 7.57±1.00a 9.15±1.43a
Efecto del Método
Ultraturrax 8.87±1.50a 8.04±0.88a 8.74±1.45a
p (Método) 0.228 0.305 0.561
S1 8.60±1.08 b 7.81±0.23ab 7.90±0.94b
Efecto del solvente S2 8.74±0.89 b 7.04±1.14b 8.48±1.25 b
S3 10.2±0.45a 8.58±0.54a 10.45±0.17a
p (Solvente) 0.009 0.009 0.001
Valores expresados como promedio ± desviación estándar.
Valores con letras diferentes (a-c) dentro de la misma columna difieren significativamente (p < 0.05)
S1: Acetona al 70%; S2: Metanol al 70%; S3: Metanol al 70 % acidificado
T1: Sonicado – S1; T2: Sonicado – S2: T3: Sonicado – S3; T4: Ultraturrax – S1; T5: Ultraturrax – S2 y T6:
Ultraturrax – S3.
E1: ecotipo Cajamarca; E5: ecotipo Huánuco I de Santa Rosa-Marambuco; E7: ecotipo H6 INIA.

• Identificación de isoflavonas y flavonas en las semillas sin desamargar y

desamargadas por UPLC-DAD-MS2

Las isoflavonas y flavonas en los extractos de lupino se caracterizaron en función de su

máxima absorción UV, tiempo de retención en cromatografía liquida (LC), iones típicos de
espectroscopía de masas MS e iones de fragmentos de MS. Estos datos cualitativos se
compararon con los estándares de referencia y publicaciones anteriores. Como resultado, se
identificaron 21 flavonoides (isoflavonas y flavonas) en las semillas sin desamargar y
desamargadas. Los cromatogramas de LC de los extractos y la caracterización de los
flavonoides se dan en la Figura 16 y el Cuadro 15, respectivamente. De acuerdo con estudios
previos (Khan et al. 2015), la genisteína es la principal isoflavona en los extractos de lupino

56
tanto como aglicona y derivados glucosilados (Cuadro 15). Resultados que concuerdan con
lo reportado por Gálvez et al. (2009), quienes detectaron genisteína y derivados de genisteína
en las cáscaras y cotiledones de cultivares SLp-1, SLp-4 y H-6 de L. mutabilis.
Probablemente las agliconas de genisteína y derivados glucosilados pudieron ser mutabileína
y mutabilina, respectivamente como se reportó en semillas de L. mutabilis (Dini et al. 1998).
En el presente estudio los derivados de genisteína estaban presentes como mono-, di- y tri-
sacáridos como restos de azúcar. Basado en el patrón de fragmentación de la generación de
iones [M+H-acilado de azúcar]+. Kachlicki et al. (2016), encontraron ciertos monosacáridos
acilados con ácidos alifáticos, principalmente como malonilhexósido ([M+H-248]+) y
acetilhexósido ([M+H-204]+). Estos sustituyentes de azúcar podrían haberse unido sólo a los
grupos hidroxilo de la genisteína aglicona. Esta identificación se basó en lo reportado por
Waridel et al. (2001) que demostraron que los O-glucósidos de los flavonoides no producían
iones de fragmentos [M+H-120]+ en comparación con sus contrapartes C-glucosiladas.
Dentro de las isoflavonas mencionadas en el presente estudio, cabe resaltar que los
compuestos 8, 16 y 17 sólo se presentaron en semillas desamargadas.

Adicionalmente, en el presente estudio se encontraron varias isoflavonas desconocidas. El

Anexo 2, muestra un compuesto desconocido de isoflavona (compuesto 20) que exhibe una
absorción máxima típica de UV a una longitud de onda de 260 nm. En comparación con la
genisteína aglicona, la diferencia de 30 Da en el peso molecular podría indicar la presencia
de un grupo metoxilo en el compuesto desconocido. Sin embargo, cuando se probó un
estándar de tectorigenina, esta no coincidía, aunque tenía un grupo metoxilo más en el
carbono seis (C6) del anillo A que la genisteína. Otra posibilidad es que el compuesto
desconocido sea 3′-O-metillorobol (5,7,4′-trihidroxi-3′-metoxi-isoflavona), que se aislaron
previamente de extractos de hojas de lupino blanco (L. albus, [Link] Mutant) descrito
por Tahara et al. (1984). Kachlicki et al. (2005), estudiaron las raíces de tres especies de
altramuces (L. albus, L. angustifolius y L. luteus) usando LC/UV y LC/ESI/MSn, los
resultados sugirieron que la 2′-hidroxigenisteína junto con sus glucósidos fueron las
principales isoflavonas en los extractos. Este grupo de compuestos también se encuentran en
semillas y tejidos foliares de especies de altramuces (Stobiecki et al. 2010; Wojakowska et
al. 2013; Aisyah et al. 2016). Considerando la sustitución del metilo como la característica
estructural común de los flavonoides, también era probable que el compuesto desconocido
en las muestras pudiera ser 2'-hidroxigenisteína metilada. En vista que anteriormente se ha
reportado la identificación de 2'-hidroxigenisteína en hipocótilos germinados de L. albus L.

57
cv multolupa (Barceló y Muñoz 1989). Además, las muestras de lupino estudiadas también
contenían otros compuestos de isoflavonas desconocidos, identificados como compuestos 6,
9, 14 y 17que podrían ser varios derivados O-glicosilados del compuesto 20, como sugieren
los datos de MS y MS2 (Cuadro 15).

58
Figura 16: Cromatograma LC de isoflavonas y flavonas en ecotipos de lupino: A. Sin desamargar; B. Desamargado. El número de picos se
detalla en el Cuadro 15.

59
En cuanto a las flavonas, se ha informado ampliamente que las apigeninas glicosiladas son
las principales flavonas de los lupinos (Dueñas et al. 2009; Siger et al. 2012; Wojakowska
et al. 2013). En contraste con estudios previos, los extractos de Lupinus mutabilis contenían
sólo dos tri-glucósidos de apigenina, identificados como apigenina 7-O-apiofuranosil-6,8-
di-C-glucósido y apigenina-pentosido-6,8-di-C-glucósido (Cuadro 15).

Así mismo, el compuesto 21 se identificó preliminarmente como una flavona dado su

absorción máxima de UV a aproximadamente 340 nm (Anexo 3). Como el peso molecular
del compuesto 21 era 30 Da más que el de la apigenina, podría tratarse de un derivado
metoxilado. Muth et al. (2008) investigaron los perfiles de flavonoides en extractos de hojas
de lupino azul (L. angustifolius), y propusieron que 3′-O-metiluteuteolina (crisoeriol)
glicosilada era la flavona dominante. Stobiecki et al. (2010) y Wojakowska et al. (2013),
revelaron la presencia de crisoeriol y sus glucósidos O-/C en las raíces y hojas de algunas
especies de altramuces mexicanos. Sin embargo, confirmamos por coinyección que el
compuesto 21, no era crisoeriol, debido al diferente tiempo de retención mostrado en el
cromatograma LC. Otra posibilidad es que el compuesto 21 podría haber sido diosmetina
(luteolina 4'-O-metil éter), que se encontró previamente en las semillas de lupinos (L.
angustifolius, cv. Zapatón), especialmente en las germinadas (Dueñas et al. 2009). El
presente estudio no pudo confirmar esta suposición. Además, de acuerdo con los resultados
de MS2, algunos derivados O-glicosilados del compuesto 21 también se identificaron a partir
de extractos de lupino estudiados, incluidos los compuestos 10, 11, 12, 15 y 18. Es
importante resaltar que, los compuestos 10 y 21 sólo se presentaron en semillas
desamargadas estos son eliminados durante el proceso de desamargado acuoso (Cortés et al.
2020).

60
Cuadro 15. Identificación de isoflavonas y flavonas en 10 ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet), por UPLC-DAD-MS2
N° UV λmax [M+H]+/ [M-]- [A+H]+/ [A-H]- Producción de iones de [M+H]+
Identificación
pico (nm) en MS (m/z) en MS (m/z) (MS2, m/z)
1 Genisteína 4′,7-O-diglucosido 260,330 595/593 271/431,269 595→271
2 Isoflavona-pentósido-pentósido-hexósido 260,327 727/725 595,463,301/593,461,299 727→523,487,457,445,439,427,421,409,403,391,
desconocida 379,361,349,337,325,307,295
595→481,458,421,409,403,391,379,365,347,337,
325,307,295,271
463→301,286,269,241,229,213,199,153
3 Apigenina-pentósido-6,8-di-C-glucósido 271,337 727/725 595,577/605,593,473,455, 727→541,523,511,505,481,457,445,439,427,421,
383,353,335 409,403,391,379,355,349,337,325,307,295
595→421,409,403,391,379,361,349,337,325,307,
295
4 Apigenina 7-O-apiofuranosil-6,8-di-C- 270,337 727/725 595,577/605,593,473,455, 727→541,523,511,505,481,457,445,439,427,421,
glucósido 383,353,335 409,403,391,379,355,349,337,325,307,295
595→421,409,403,391,379,361,349,337,325,307,
295
5 Genisteína 7-O-glucósido 260,330 433/431 271/269 433→271,253,243,241,215,153
6 Isoflavona O-hexóxido 1 desconocida 261,330 463/461 301/299 463→301,286,269,241,229,213,199,153
7 Genisteína 4′-O-glucósido 260,330 433/431 271/269 433→271,253,243,241,215,153
8 Genisteína 7-O-xilosilglucósido 265,330 565/563 433,271/269 433→271,153
9 Isoflavona O-hexóxido 2 desconocida 260,330 463/461 301/299 463→301,286,269,241,229,213,199,153
10 Flavona O-glucósido desconocida 267,345 463/461 301/299 463→301,286,258
11 Flavona O-hexóxido-pentósido 270,345 595/593 463,301/461,299 595→301,286,258
desconocida
12 Flavona O-hexóxido desconocida 268,347 463/461 301/299 463→301,286,258
13 Genisteína O-malonilhexósido 265,335 475/473 519,271/269
14 Isoflavona O-malonilhexósido desconocida 261,330 549/547 505,301/503,299 549→301,286,269,241,153
15 Flavona O-malonilhexósido desconocida 267,345 549/547 505,301/503,299 549→301,286,258
16 Genisteína O-acetilhexósido 261,330 475/473 271/269
17 Isoflavona O-acetilhexósido desconocida 262,330 505/503 301/299 505→301,286,269,241,153
18 Flavona O-acetilhexósido desconocida 268,343 505/503 301/299 505→301,286,258
19 Genisteína aglicona 261,330 271/269 271→253,197,169,153
20 Isoflavona aglicona desconocida 262,330 301/299 -/284,269 301→269,241,229,213,201,187,153
21 Flavona aglicona desconocida 268,346 301/299 -/284,269 301→286,258,229,203,187,153

61
• Cuantificación de isoflavonas y flavonas en las semillas sin desamargar y
desamargadas

El contenido de isoflavonas y flavonas de los 10 ecotipos sin desamargar y desamargados se

cuantificaron mediante análisis por HPLC. La cuantificación de isoflavonas y flavonas se
realizó a 260 nm y 340 nm, respectivamente usando como estándares genisteína y apigenina.
En el Cuadro 16, se muestran las rectas de calibración usadas para la cuantificación.

Cuadro 16: Longitud de onda y rectas de calibración para la cuantificación de flavonas

e isoflavonas

Compuestos Longitud de onda Ecuación b Valor de R2

registrada
Flavonasa
Apigenina aglicona 340 nm y = 2x10 -8 x + 0.0008 0.999
Isoflavonasa
Genisteina aglicona 260 nm y = 1x10- 7 x – 0.0004 0.999
a
Se disolvieron 1 ~ 2 mg de cada compuesto de referencia en 10 ml de metanol y luego se diluyeron a
cuatro concentraciones diferentes con 3 repeticiones. Las curvas de calibración se construyeron trazando
las áreas de pico en las longitudes de onda registradas del cromatograma HPLC en función de las
concentraciones.
b
La ecuación se expresó como y = A x + B, donde y fue la concentración de fenólicos (mg / ml), y x el
área bajo curva en el cromatógrafo LC

El contenido de isoflavonas y flavonas en las semillas de lupino se muestra en el Cuadro 17.

Es importante resaltar que el contenido total de isoflavonas y flavonas, es la suma de todos
los compuestos aglicona y derivados glucosídicos en cada uno de los 10 ecotipos antes y
después del proceso de desamargado. Respecto a las isoflavonas totales (expresadas como
genisteína) en las semillas sin desamargar, los ecotipos que mostraron mayor contenido
fueron E6 = 212.18 mg de genisteína /100 g y E7 = 208.24 mg de genisteína /100 g de Junín;
E3 = 201.82 mg de genisteína /100 g y E2 = 201.15 mg de genisteína /100 g de La Libertad
y el menor contenido de isoflavonas se encontró en los ecotipos E1, E5 y E9 provenientes
de Cajamarca, Huánuco y Cusco respectivamente. El promedio de isoflavonas en los 10
ecotipos sin desamargar fue de 185.3 mg de genisteína /100 g b.s, resultado que fue mayor
a lo reportado por Gálvez et al. (2009) quienes obtuvieron 37.6 mg de genisteína/100 g b.s
en semillas enteras. Al comparar el contenido de isoflavonas de los 10 ecotipos de L.
mutabilis sin desamargar con otras leguminosas como la soya, los resultados fueron menores
a 265 mg/100 g en b.s, representando a la suma de genisteina, daidzeina, glicetina y

62
equivalentes aglicona (Mortensen et al. 2009). Sin embargo, el contenido de isoflavonas fue
similar a otras variedades cultivadas en el estado de Paraná Brasil (54 a 147 mg/100 g)
reportados por Carrão-Panizzi et al. (1998). El nivel de isoflavonas fue menor que las
encontradas en soya de variedades Koreanas (949 mg/100 g) (Genovese et al. 2004).

Respecto al contenido de flavonas en las semillas sin desamargar el ecotipo con mayor
concentración fue E5 = 47.12 mg de apigenina/100 g b.s, frente a otros ecotipos, y el menor
contenido de flavonas se encontró en el ecotipo E1 de Cajamarca. El promedio del contenido
de flavonas en los 10 ecotipos fue de 40 mg de apigenina /100 g b.s. Las diferencias del
contenido de isoflavonas y flavonas pueden atribuirse a las diferencias entre los ecotipos, a
las condiciones geográficas, a la etapa de maduración, a las condiciones posteriores a la
cosecha y a los métodos de extracción (Bednarek et al. 2003; Faraj; Chirinos et al. 2013a).

Cuadro 17: Isoflavonas y flavonas en los ecotipos de lupino (Lupinus mutabilis Sweet)
sin desamargar y desamargados
Ecotipos Isoflavonas % Flavonas %
(mg de genisteína /100 g b.s) (mg de apigenina /100 g b.s)
SD D SD D
E1 152.84 ± 1.1a 142.81 ± 0.73cd 93 33.80 ± 0.32a 18.58 ± 0.11e 55
bd f de b
E2 201.15 ± 7.5 176.36 ± 2.08 88 39.81 ± 0.60 15.18 ± 0.12 38
E3 201.82 ± 3.9d 109.52 ± 3.33a 54 40.29 ± 0.73e 15.69 ± 0.36bc 39
E4 184.10 ± 4.3b 136.06 ± 1.78b 74 40.37 ± 0.40e 12.42 ± 0.15a 31
E5 159.46 ± 9.6a 163.47 ± 1.66e 102 47.12 ± 1.62f 21.57 ± 0.37f 46
d g e e
E6 212.18 ± 0.5 185.20 ± 3.35 87 40.19 ± 0.21 17.96 ± 0.15 45
E7 208.24 ± 7.4d 139.89 ± 1.95bc 67 38.41 ± 1.07cde 16.25 ± 0.10cd 42
E8 185.76 ± 3.7bc 134.20 ± 2.83bc 72 37.77 ± 0.25cd 18.23 ± 0.36e 48
E9 163.74 ± 5.2a 144.78 ± 0.48cd 88 34.67 ± 0.84ab 16.81 ± 0.25d 48
b d bc d
E10 183.40 ± 5.2 147.15 ± 1.44 80 36.85 ± 0.77 16.49 ± 0.38 45
Valores expresados como promedio ± desviación estándar. Valores con letras diferentes (a-g) dentro de la
misma columna difieren significativamente (p < 0.05). b.s.: Base seca; % (porcentaje de disminución), SD:
Sin desamargar; D: Desamargados. E1: ecotipo Cajamarca; E2: ecotipo Altagracia de Otuzco-La Libertad;
E3: ecotipo Paton grande de La Libertad; E4: ecotipo Cholo fuerte de Ancash; E5: ecotipo Huánuco I de
Santa Rosa-Marambuco; E6: ecotipo Compuesto blanco semi precoz INIA; E7: ecotipo H6 INIA; E8:
ecotipo Moteado beige de Junín; E9: ecotipo Andenes INIA de Cusco y E10: ecotipo Yunguyo de Puno.

El proceso de desamargado disminuyó el contenido de isoflavonas y flavonas (Cuadro 17).

El ecotipo con mayor contenido de isoflavonas fue E6 = 185.20 mg de genisteína/100 g

63
frente a otros ecotipos y el promedio de isoflavonas residuales en los 10 ecotipos
desamargados fue de 148 mg de genisteína /100 g, representando este valor un gran potencial
en las semillas de lupino desamargado, en vista que las isoflavonas se han asociado con
efectos beneficiosos en los humanos, como la prevención del cáncer, enfermedades
cardiovasculares, osteoporosis y síntomas menopáusicos (Adlercreutz y Mazur, 1997). Así
mismo se puede observar diferentes porcentajes de disminución de las isoflavonas, ello
debido a las diferentes estructuras de las semillas de lupino.

Del mismo modo se observó una disminución del contenido de flavonas posterior al proceso
de desamargado mostrando al ecotipo E5 = 21.57 mg apigenina/100 g en b.s con contenido,
el promedio de flavonas en las semillas desamargadas de los 10 ecotipos fue 17 mg de
apigenina/100 g b.s. La disminución del porcentaje de flavonas es variable entre los
diferentes ecotipos. Finalmente cabe resaltar que las flavonas tienden a disminuir más que
las isoflavonas posteriores al desamargado acuoso (Cuadro 17)

4.2. SELECCIÓN DEL ECOTIPO PARA LA ELABORACIÓN DE LA BEBIDA

El trabajo de investigación tuvo como objetivo obtener una bebida probiótica proteica, para
elegir al ecotipo apropiado se tomaron ciertos criterios tales como: a) mayor contenido de
proteínas b) bajo nivel de alcaloides residuales en las semillas desamargadas, debido a que
los alcaloides son considerados antimicrobianos y un nivel alto podría haber tenido efecto
en la viabilidad de las bacterias probióticas c) el contenido de isoflavonas y flavonas, ya que
son consideradas como prebióticos, pero en concentraciones altas podrían inhibir el
crecimiento microbiano.

Por lo tanto, de los 10 ecotipos caracterizados, se observó que el ecotipo Altagracia tenía
una mayor concentración de proteínas (Cuadro 11), frente a otros ecotipos. Respecto al
contenido de alcaloides residuales en los ecotipos desamargados no existieron diferencias
significativas (p<0.05) (Figura 14b), excepto para el ecotipo Cajamarca que tenía mayor
concentración de alcaloides. Cabe resaltar que, en todos los ecotipos desamargados, los
niveles residuales de alcaloides se encontraban por debajo de las especificaciones
establecidas por las autoridades sanitarias del Reino Unido, Francia y Australia (Calabrò et
al. 2015). Así mismo el contenido de isoflavonas y flavonas estuvieron en un nivel

64
intermedio. De acuerdo a lo mencionado se seleccionó al ecotipo Altagracia proveniente de
la Libertad para la elaboración de la bebida.

4.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS FACTORES SIGNIFICATIVOS EN LA

ELABORACIÓN DE LA BEBIDA

Se evaluaron siete factores con dos niveles, mediante el método Taguchi, haciendo un total
de 8 corridas por duplicado (Cuadro 18). Los valores de la tasa de crecimiento de L.
plantarum 299v y L. rhamnosus GG (%), estuvieron entre los rangos de (7.94-22.2 %) y
(30.3-58.9 %) respectivamente. Del Cuadro 18 se puede observar que la mayor tasa de
crecimiento, se obtuvo con la bacteria L. rhamnosus GG, y la menor tasa de crecimiento con
L. plantarum 299v a concentraciones menores de azúcar y lupino. La tasa de crecimiento de
las bacterias ácido lácticas está influenciada por muchos factores, entre ellos, el estrés ácido
y osmótico, que se produce por la producción de ácido láctico y la aplicación de aditivos
alimentarios durante la fabricación de leches fermentadas (Lucas et al. 2004)

Los valores ETA (Valores señal /ruido) presentados en la Figura 17, muestran a los factores
significativos y no significativos que influyeron en el crecimiento de las bacterias
probióticas. Los factores significativos fueron la concentración de lupino, concentración de
azúcar, tipo de bacteria e interacción lupino-tipo de bacteria; dichos factores exceden la
región delimitada correspondiente al valor ETA. Los factores que no tuvieron significancia
(no exceden la región delimitada del valor ETA) fueron: Concentración de inulina,
concentración de CMC e interacción lupino-azúcar, porque, al realizar la variación de un
nivel bajo a un nivel alto, no afectan el crecimiento de las bacterias probióticas. Cabe resaltar
respecto a las concentraciones de inulina de 1 y 2 %, ciertamente no fueron significativas en
la tasa de crecimiento de las bacterias probióticas, sin embargo, Guven et al. (2005),
mencionan que la inulina tiene un efecto prebiótico, por que promueve el crecimiento de las
bacterias probióticas, pero dichos resultados se dan con mayores concentraciones de inulina
respecto a la investigación realizada. Es importante considerar que productos fermentados,
como por ejemplo leche de soja fermentada con probióticos, que contienen
fructooligosacáridos (FOS), inulina y pectina, aumentan la actividad inhibidora de la enzima
convertidora de angiotensina I y mejoran el efecto antihipertensivo in vitro (Yeo y
Liong 2010 ).

65
Cuadro 18: Tratamientos según diseño experimental Taguchi L8 (27) y tasa de crecimiento de bacterias probióticas

R1 y R2: Repeticiones de la determinación de la tasa de crecimiento de bacterias probióticas en la bebida [⟮UFC/ml ⟯inicial / ⟮UFC/ml⟯final] x 100.
Factores de control Tasa de crecimiento de
Tratamientos bacterias probióticas (%)
Lupino Azúcar F1xF Tipo de F1xF4 Inulina CMC R1 R2 Promedio
(%) (%) 2 bacteria (%) (%)
1 65 2 - L. plantarum - 1 0.8 17.65 19.00 18.3

2 15 2 - L. plantarum - 1 0.2 9.57 7.06 8.3

3 65 2 - L. rhamnosus - 2 0.2 33.33 40.14 36.7

4 15 2 - L. rhamnosus - 2 0.8 28.41 32.22 30.3

5 15 8 - L. plantarum - 2 0.8 6.83 9.05 7.9

6 15 8 - L. rhamnosus - 1 0.2 61.82 55.96 58.9

7 65 8 - L. plantarum - 2 0.2 23.38 21.03 22.2

8 65 8 - L. rhamnosus - 1 0.8 55.79 45.87 50.8

66
 Average Eta by Factor Levels
Mean=27.3413 Sigma=6.44408 MS Error=1.54685 df=7
(Dashed line indicates ±2*Standard Error)
33

32
F1: Concentración de
31 lupino.
F2: Concentración de
30 azúcar.
ETA = -10*log10(1/N*Sum(1/y²))

29
F3: Interacción lupino-
azúcar.
28 F4: Tipo de bacteria.
F5: Interacción lupino-
27
tipo de bacteria.
26 F6: Concentración de
inulina.
25
F7: Concentración de
24 CMC.

23

22

21
Repeticiones F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7
(Las líneas punteadas indican ± 2* error estándar)

Figura 17: Valores señal/ruido (ETA) de cada factor evaluado en la tasa de crecimiento de bacterias probióticas aplicando Taguchi L8 (27)

67
Cuadro 19: Niveles con mayor crecimiento de bacterias probióticas con descenso de pH
(4.5 - 4.7) en la bebida fermentada según Taguchi

FACTORES Parámetro Nivel

seleccionado
F1→ Lupino (%) 65 2
F2→ Azúcar (%) 8 2
F3→ F1xF2 - -
F4→ Tipo de bacteria L. plantarum 299v 1
F5→ F1xF4 - -
F6→ Inulina (%) 2 2
F7→ CMC (%) 0.8 2

4.4. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE FERMENTACIÓN DE LA BEBIDA

Para determinar el tiempo de fermentación se realizaron pruebas preliminares con dos

formulaciones (Formulación 1 y 2) como se detalló en el ítem [Link].2. El criterio considerado
fue el nivel de pH de la bebida fermentada, para ello se partió con un tiempo de 18 horas de
fermentación, en vista que el cultivo de las bacterias acido lácticas a temperaturas controladas
alcanza la fase estacionaria entre las 10 -18 h de fermentación (GRAS notice (GRN) 2020). La
Figura 18 muestra el comportamiento del pH para cada bebida en función del tiempo de
fermentación (18 y 12 h): Control (bebida sin inóculo), bebida con L. plantarum 299v y bebida
con L. rhamnosus GG. En la Figura 18A (Formulación 1), se puede observar que la bebida sin
inoculo tiende a mantener el pH durante las 8 h, posteriormente tiende a bajar lentamente hasta
las 18 h de fermentación. En la bebida inoculada con L. rhamnosus GG, el pH tiende a disminuir
muy lentamente, observándose durante las 4 primeras horas una disminución de 5.42 a 5.21,
posterior a ello se mantiene constante hasta las 15 h (pH = 5.02) y finalmente a las 18 h alcanza
un pH de 4.71. Por otro lado, en la bebida inoculada con L. plantarum 299v, la disminución del
pH se dio rápidamente observándose que a las 12 h fue 4.67 y a las 18 h de 4.41. En cuanto a
la Formulación 2 (Figura 18B), se observó un comportamiento similar a lo descrito para la
Formulación 1. De acuerdo a los resultados obtenidos y a los niveles de pH establecidos para
la bebida (4.5 - 4.7), se consideró realizar la fermentación por un tiempo de 12 h, en vista que
el pH deseado para la bebida oscilo en ese tiempo.

68
 6 .0 A

5 .5
pH

5 .0

4 .5

4 .0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

T i e m p o d e f e r m e n t a c ió n ( h o r a s )

6 .5 B

6 .0

5 .5
pH

5 .0

4 .5

4 .0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

T ie m p o (h o r a s )

Figura 18: Cinética de cambio de pH en la bebida fermentada: A) 18 h de fermentación, B)

12 h de fermentación. (▲) Control (sin inóculo), (●) L. plantarum 299v, (■) L. rhamnosus
GG.

69
Así mismo, las pruebas sensoriales contribuyeron a la decisión (preliminares) de elegir entre
las 12 y 18 h de fermentación, dichos resultados pueden ser reforzados por Li et al. (2014),
quienes encontraron que el sabor y apariencia de la leche de soja fermentada eran los mejores
después de las 12 h de fermentación. Del mismo modo cabe resaltar lo mencionado por
Salmerón et al. (2014), que el crecimiento máximo de los lactobacilos en sustratos de
cereales se logra dentro de las primeras 10 h. Por otro lado, los resultados muestran que las
bacterias de L. rhamnosus GG tiene un buen crecimiento en un medio vegetal, pero, no se
da la disminución del pH del medio, dando lugar al desarrollo de bacterias no deseadas, que
presentaron un sabor desagradable en la bebida, al respecto Molin (2001) menciona que, las
bacterias de L. rhamnosus GG generalmente se asocian con productos lácteos, mientras que
las bacterias de L. plantarum se encuentran en alimentos fermentados de origen vegetal. De
acuerdo a lo mencionado se consideró realizar la optimización sólo con L. plantarum 299v,
que es conocida por su capacidad de adaptarse a diferentes tipos de ecosistemas y sustratos
vegetales (Ribeiroa et al. 2020).

4.5. DETERMINACIÓN DEL FACTOR DE DILUCIÓN PARA L. plantarum 299v

Para el recuento estándar en placa, se realizaron las diluciones seriadas de la bebida de

lupino, y se pudo determinar el factor de dilución de las bacterias de L. plantarum 299v, con
el método de recuento en placa de siembra por extensión en superficie. En la Figura 19 se
presenta las colonias de las bacterias, con características bastante notorias en el medio de
cultivo MRS, mostrando formas muy definidas que facilitaron su conteo. El factor de
dilución determinado fue de 10-6 UFC/ml (Figura 19), concentración que permitió contar
adecuadamente las bacterias.
La ICMSF (2000), que las bacterias mesófilas para su optimo conteo deben estar dentro del
rango de 30 y 300 colonias.

70
Figura 19: Factor de dilución para el crecimiento de L. plantarum 299v

4.6. OPTIMIZACIÓN DE LOS FACTORES DE FORMULACIÓN DE LA BEBIDA

PROBIÓTICA

El desarrollo de un nuevo alimento probiótico exige varios factores a tener en cuenta; entre
ellos el más importantes es el nivel de bacterias viables en el producto final. En tal sentido,
se optimizaron los factores de formulación para maximizar el crecimiento de las bacterias
probióticas y alcanzar un pH entre 4.5 - 4.7 en la bebida a base de lupino. Para ello se
consideraron tres factores significativos obtenidos en la etapa de Screening (Método
Taguchi): Concentración de lupino, concentración de azúcar y tipo de bacteria (L. plantarum
299v y L. rhamnosus GG). Sin embargo, por razones expuestas anteriormente se procedió a
la optimización sólo con la bacteria L. plantarum 299v como constante, para lo cual se
consideraron dos factores: Concentración de lupino y concentración de azúcar. Así mismo,
los otros ingredientes adicionales se mantuvieron constantes, como la concentración de
inulina con 2 % y carboximetil celulosa (CMC) con 0.8 %, ya que las respuestas no difirieron
entre la menor y mayor concentración para la tasa de crecimiento de las bacterias probióticas.

Para la etapa de optimización se consideró un diseño central compuesto con cara centrada
(ɑ = 1) de acuerdo a la metodología descrita por Ayala y Pardo (1995), la fermentación se
llevó a cabo durante un período de 12 h, necesario para alcanzar el nivel de pH deseado (4.5
- 4.7). Los 12 experimentos del diseño central compuesto con cara centrada con dos factores
y tres niveles (Cuadro 9), que incluyen 4 réplicas en el punto central para ajustar una
superficie de segundo orden. El efecto de las diferentes concentraciones de los dos factores
en la tasa de crecimiento de L. plantarum 299v y el pH se muestra en el Cuadro 20. Se

71
observó que a mayor concentración lupino (40 %) y mayor concentración de azúcar (8 %)
se obtiene una tasa de crecimiento de 27.88 %, siendo está menor a una concentración de
lupino de 30 % y 8 % de azúcar (32.11 %). Este comportamiento se podría atribuir al estrés
osmótico que afecta la viabilidad de las bacterias probióticas en las matrices
alimentarias. Así, en algunos lactobacilos expuestos a niveles variables de concentraciones
de azúcar, mostraron pérdidas de viabilidad probiótica debido al estrés osmótico (Sunny et
al. 2007).

Cuadro 20: Valores experimentales y predichos de la tasa de crecimiento de L.

plantarum 299v y pH.

Ensayos Lupino Azúcar L. plantarum 299v pH

(%) (%) Experimental Predicho Experimental Predicho
1 30 8 32.11 30.57 4.71 4.74
2 30 7 28.00 28.84 4.68 4.71
3 20 6 25.29 24.90 4.57 4.58
4 30 7 27.73 28.84 4.7 4.71
5 20 7 25.91 25.45 4.57 4.57
6 40 7 26.76 26.61 4.48 4.47
7 40 8 27.88 28.57 4.53 4.52
8 30 7 29.46 28.84 4.71 4.71
9 30 7 29.58 28.84 4.73 4.71
10 30 6 27.11 28.05 4.73 4.70
11 20 8 26.09 26.94 4.6 4.58
12 40 6 26.12 25.57 4.42 4.44

4.6.1. Efecto de los factores sobre la tasa de crecimiento de L. plantarum 299v

• Evaluación del modelo matemático

El modelo matemático de segundo orden (cuadrático) obtenido para este diseño, es una
relación empírica entre la tasa de crecimiento de las bacterias probióticas y las variables
independientes en unidades codificadas, como se indica en la siguiente ecuación:

Ecuación en términos de factores codificados

Y= + 28.84 + 0.5783*A + 1.26*B + 0.2400*AB – 2.81* A2 + 0.4638*B2 …… (1)

72
Mediante la conversión de los valores codificados en valores reales (unidades no
codificadas), se presenta la siguiente ecuación:

Ecuación en términos de factores reales

Log UFC/ml = +20.75125 + 1.57658 * Lupino – 5.95250 * Azúcar + 0.024000 *Lupino*

azúcar – 0.028113 *Lupino 2 + 0.463750 * Azúcar 2 …………(2)
El análisis de varianza del modelo cuadrático de la ecuación 1, se presentan en el Cuadro 21.
La evaluación estadística, el análisis de varianza del modelo cuadrático indica que fue
significativo (P < 0.05) como es evidente en la prueba F de Fisher (modelo F, la razón de la
regresión cuadrática media al residual cuadrático medio es 5.02) y tiene un valor de
probabilidad [(modelo P > F) = 0.0374]. Los valores p correspondientes sugieren que, entre
las variables de prueba utilizadas en el estudio, B (concentración de azúcar), A2 (lupino x
lupino) son términos significativos del modelo con valores p inferiores a 0.05. Según Gupta
et al. (2010) la significancia indica que pueden actuar como nutrientes limitantes y una
pequeña variación en sus concentraciones alterará el crecimiento de las bacterias probióticas
en gran medida. Por otro lado, otros términos, como A (concentración de lupino), AB (lupino
x azúcar), B2 (azúcar x azúcar) no fueron significativos. Resultados similares se observaron
en el estudio de Gupta et al. (2010), quienes evaluaron el crecimiento de L. plantarum en
avena fermentada.

Cuadro 21: Análisis de varianza y regresión para el crecimiento de L. plantarum 299v

Fuente Suma de Grados de Cuadrado F- value p-value Sig.
cuadrados libertad medio
Modelo 33.51 5 6.70 5.02 0.0374 *
A-Lupino 2.01 1 2.01 1.50 0.2662 n. s
B-Azúcar 9.53 1 9.53 7.13 0.0370 *
AB 0.2304 1 0.2304 0.1725 0.6924 n. s
A² 21.08 1 21.08 15.78 0.0074 *
B² 0.5735 1 0.5735 0.4293 0.5366 n. s
Residual 8.02 6 1.34
Lack of Fit 5.23 3 1.74 1.88 0.3085 n. s
Error puro 2.78 3 0.9276
Total 41.52 11
*Significancia a un nivel de α = 0,05; n.s = No significativo

73
La prueba de falta de ajuste del modelo (lack of fit) 0.3085 fue no significativa (p >0.05)
para todas las variables, indicando que los resultados experimentales se ajustan
adecuadamente al modelo para predecir el crecimiento de las bacterias. La idoneidad del
modelo se confirmó también con el coeficiente de determinación (R2 = 0.8070), que indica
que el modelo podría predecir el 80.70 % de variabilidad en la respuesta. El valor bajo del
coeficiente de variación (CV = 4.18) indico la fiabilidad de los experimentos y un alto grado
de precisión. El valor de la precisión Adeq, es decir, la relación señal/ruido de 6.9373
indicaba una señal adecuada. Además, existe un grado de correlación entre los valores
experimentales y estimados, debido el R2 ajustado de 0.6461 (Figura 20)

Figura 20: Valores predichos y experimentales de la tasa de crecimiento de L. plantarum

299v.

• Análisis de la superficie de respuesta

La superficie de respuesta tridimensional generado a partir del modelo cuadrático (Ecuación

2) para estudiar la interacción de los dos factores evaluados, y para visualizar los efectos
combinados de los factores sobre el crecimiento de L. plantarum 299v en la bebida de lupino
(Figura 21). El objetivo principal fue identificar el valor óptimo de las variables
independientes de manera eficiente para maximizar la respuesta.

74
Como se observa en el Cuadro 20, las bacterias probióticas tuvieron una buena tasa de
crecimiento en las diferentes formulaciones de la bebida de lupino. Obteniéndose la máxima
tasa de crecimiento de 30.63 (equivalente al valor experimental validado 31.7 = 13 x 108
UFC/ml (9.11 log) final /41 x 106 UFC/ml (7.61 log) inicial, con los valores óptimos de los
factores no codificados de 31.5 % de concentración de lupino y 8 % de concentración de
azúcar, durante 12 h de fermentación (Figura 21). Todos los puntos óptimos se ubicaron
dentro de la región experimental y variaron alrededor de sus puntos centrales en diferente
medida. Estudios previos han reportado tendencias similares con L. plantarum Q823 y L.
casei Q1, con recuentos bacterianos iniciales de 8 log UFC/ml, y posterior al proceso de
fermentación de 6 h a 30 °C, fueron capaces de crecer a un nivel de 9.5 log UFC /ml en
bebida fermentada de quinoa (Ludeña et al. 2016). El nivel de bacterias en la bebida de
lupino fue superior a los estudios obtenidos con arroz fermentado, con un máximo de 8.42
log UFC/ml de L. plantarum TISTR 2075 a un mayor tiempo de fermentación (24 h)
(Savedboworn et al. 2017) y a 6.8 × 107 UFC/ ml para leche de soya después de un tiempo
de fermentación de 16-18 h (Mital y Steinkraus 1974). Por otro lado, los valores del nivel de
bacterias del estudio fueron inferiores a los niveles obtenidos en una bebida de trigo
germinado (10.43 log UFC/mL) con L. acidophilus NCDC-14 durante 8 h de fermentación
(Sharma et al. 2014).

Figura 21: Superficie de respuesta estimada para la tasa de crecimiento de L. plantarum

299v

75
Del mismo modo, el contenido de oligosacáridos presentes en las semillas de lupino como
base prebiótica pudo haber influido en el crecimiento de las bacterias, en vista que estas
semillas son consideradas de alto contenido de galatósidos (7-15 %), pertenecientes a la
familia de las rafinosas, que son utilizados por las bacterias probióticas (Martínez-
Villaluenga 2007). Así mismo, el contenido fenólico en la bebida también puede influir en
la viabilidad de los probióticos, ejerciendo una actividad protectora o antimicrobiana ( Succi
et al. 2017; Terpou et al. 2019), como las isoflavonas que se encuentran en las semillas de
lupino, al respecto Faraj y Vasanthan (2004), mencionan que la fermentación convierte los
glicócidos de isoflavonas en agliconas a través de la hidrólisis del enlace glucosídico y la
posterior utilización de la glucosa por parte de las bacterias para la obtención de energía.

4.6.2. Efecto de los factores sobre el pH

• Evaluación del modelo matemático

El modelo matemático de segundo orden (cuadrático) obtenido para este diseño, es una
relación empírica entre el pH y las variables independientes en unidades codificadas, como
se indica en la siguiente ecuación:

Ecuación en términos de factores codificados

Y= + 4.71 – 0.0517*A + 0.02*B + 0.02*AB – 0.185* A2 ……… (3)
Mediante la conversión de los valores codificados en valores reales (unidades no
codificadas), se presenta la siguiente ecuación:

Ecuación en términos de factores reales

pH = +3.51000 + 0.089833*Lupino – 0.040000*Azúcar + 0.002000*Lupino*azúcar –
0.001817*Lupino 2 …………. (4)

El análisis de varianza del modelo cuadrático de la ecuación 1, se presentan en el Cuadro 22.

La evaluación estadística, el análisis de varianza del modelo cuadrático indica que fue
significativo (P < 0.05) como es evidente en la prueba F de Fisher (modelo F, la razón de la
regresión cuadrática media al residual cuadrático medio es 46.63) y tiene un valor de
probabilidad [(modelo P > F) = 0.0001]. Los valores p correspondientes sugieren que, entre
las variables de prueba utilizadas en el estudio, A (concentración de lupino), A2 (lupino x

76
lupino) son términos significativos del modelo con valores p inferiores a 0.05. Por otro lado,
otros términos, como B (concentración de azúcar), AB (lupino x azúcar) y B2
(Azúcar*Azúcar) fueron no significativos.

Cuadro 22: Análisis de varianza y regresión para el pH

Fuente Suma de Grados de Cuadrado F-value p-value Sig.
cuadrados libertad medio
Model 0.1193 5 0.0239 34.08 < 0.0002 *
A-Lupino 0.0160 1 0.0160 22.88 0.0031 *
B-Azúcar 0.0024 1 0.0024 3.43 0.1135 n. s
AB 0.0016 1 0.0016 2.29 0.11813 n. s
A² 0.0913 1 0.0913 130.38 < 0.0001 *
B² 0.0003 1 0.0003 0.3810 0.5598 n. s
Residual 0.0042 6 0.0007
Lack of Fit 0.0029 3 0.0010 2.23 0.2635 n. s
Error puro 0.0013 3 0.0004
Total 0.1235 11
*Significancia a un nivel de α = 0,05; n.s = No significativo

La prueba de falta de ajuste del modelo (lack of fit) 0.2635 fue no significativa (p>0.05) para
todas las variables, indicando que los resultados experimentales se ajustan adecuadamente
al modelo para predecir el pH del medio de fermentación. La idoneidad del modelo se
confirmó con el coeficiente de determinación (R2 = 0.9660), que indica que el modelo podría
predecir el 96.60% de variabilidad en la respuesta. El valor bajo del coeficiente de variación
(CV = 0.5728) indico la fiabilidad de los experimentos y un alto grado de precisión. El valor
de la precisión Adeq, es decir, la relación señal/ruido de 15.8575 indicaba una señal
adecuada.

• Análisis de la superficie de respuesta

La superficie de respuesta tridimensional generado a partir del modelo cuadrático (Ecuación

4) muestra la interacción de los dos factores evaluados, y permite visualizar los efectos
combinados de los factores sobre el pH en la bebida (Figura 22). Con los parámetros de
formulación optimizados (concentración de lupino 31.5 % y 8 % de concentración de azúcar)
se pudo obtener un valor de pH de 4.73.

77
Figura 22: Superficie de respuesta estimada para pH del medio fermentación

4.6.3. Validación del modelo

La verificación de los resultados óptimos para el crecimiento de las bacterias probióticas se
llevó a cabo durante las 12 h de fermentación. Se encontró que los valores experimentales
están de acuerdo con el valor estimado por el modelo (Cuadro 23).

Cuadro 23: Condición óptima recomendado por el modelo de segundo orden, respuesta
estimada y experimental

Condiciones óptimas No codificado

Concentración de lupino (%) 31.5
Concentración de azúcar (%) 8
Variable respuesta Estimada *Experimental Rango
Tasa de crecimiento % 30.63 31.7 ±1.23 25.29 - 32.11
pH 4.73 4.75 4.42-4.73
*Valores expresados como promedio ± desviación estándar.

78
4.7. CARACTERÍSTICAS DE LA BEBIDA PROBIÓTICA ÓPTIMA

Las características fisicoquímicas de la bebida óptima a base de lupino, se muestran en el

Cuadro 24. Así mismo se ha incluido en el cuadro el análisis proximal de las semillas de
lupino desamargado, valores que permitirán estimar los cambios de la composición de la
bebida posterior al proceso de fermentación. La bebida presentó una humedad de 87.4 % y
12.6 % de sólidos totales, resultados muy similares a 86.8 % de humedad y 13.19 % sólidos
totales reportados por Sharma et al. (2014). El porcentaje de proteína fue de 2.2 % en base
húmeda, valores que se encuentran dentro del rango de las bebidas a base de leguminosas
que contienen entre 1.5 a 3.0 % de proteínas (Jiménez-Martínez et al. 2003a). En cuanto al
contenido de grasa, ceniza y carbohidratos la bebida de lupino presentó 1.1 %, 0.4 % y 8.9
% respectivamente, valores muy cercanos a los obtenidos por Sharma et al. (2014).

El pH de la bebida disminuyó de 6.11 a 4.75, después de 12 h de fermentación, con un

incremento de la tasa de crecimiento de las bacterias probióticas, tendencia muy similar fue
reportado por Lorusso et al. (2018), quienes obtuvieron una reducción de pH de 6.0 a 3.9 en
una bebida fermentada de quinoa durante 20 h de fermentación. El pH final (4.75) de la
bebida de lupino fue superior a 4.02 de una bebida tipo yogurt de L. campestri durante 8 h
de fermentación (Jiménez-Martínez et al. 2003a). Del mismo modo, fue superior al ser
comparado con una bebida fermentada a base de quinua (Ludeña et al. 2016; Lorusso et al.
2018). Los valores de pH en la bebida se encontraban dentro del rango de bebidas
fermentadas a base de cereales, estos valores bajos pueden crear un ambiente no favorable
para los microorganismos patógenos (Salmerón et al. 2014). Frente a este comportamiento
Matusek et al. (2009), mencionan que la disminución del pH favorece la degradación rápida
de los oligosacáridos, por lo que se tendría mayor disponibilidad de nutrientes. Es decir en
un entorno de pH bajo, las células pueden utilizar el azúcar metabolizable para
proporcionar trifosfato de adenosina (ATP) a F0 F1 -ATPasa a través de la glucólisis,
permitiendo la exclusión de protones y manteniendo así su viabilidad (Hutkins y Nannen
1993).

Respecto a la tasa de crecimiento de las bacterias de L. plantarum 299v en la bebida fue de

30.63 % (equivalente al valor experimental validado 31.7 = 13 x 108 UFC/ml (final) /41 x
106 UFC/ml (inicial)), reflejando un contenido final de 13 x 108 UFC/ml. Dicha cantidad de
bacterias viables, se encuentra dentro del rango de 107-109 UFC/g o ml de un producto en el

79
momento de consumo para ejercer efectos de actividad probiótica si es consumido
diariamente (Van Niel et al. 202; Bernat et al. 2013). Así mismo, las regulaciones de Canadá
e Italia, consideran a las siguientes especies bacterianas Bifidobacterium (adolescentis,
animalis, bifidum, breve and longum) y Lactobacillus (acidophilus, casei, fermentum,
gasseri johnsonii, paracasei, plantarum, rhamnosus y salivarius), cuando se entregan en los
alimentos a un nivel de 1 × 109 UFC/ por porción, como probióticos (Heath Canada 2009).
Por otro lado, el nivel de bacterias viables en la bebida fermentada a base de lupino fue
inferior a los resultados obtenidos por (Molin et al. 1991), quienes obtuvieron ≈1 × 1012 UFC
de L. plantarum 299v en una papilla de avena fermentada.

Cuadro 24: Características fisicoquímicas de la bebida fermentada y semillas de lupino

Componente Lupino a Lupino b Bebida probiótica c
Humedad (%) 72.0 ± 0.35 22.7 ± 0.11 87.4 ± 0.021
Proteína (%) 14.6 ± 0.17 4.6 ± 0.05 2.2 ± 0.00
Base Grasa (%) 7.1 ± 0.06 2.2 ± 0.02 1.1 ± 0.014
fresca Ceniza (%) 0.8 ± 0.0 0.3 ± 0.0 0.4 ± 0.00
CHO (%) 5.5 ± 0.14 1.7 ± 0.04 8.9 ± 0.007
pH - - 4.75
Tasa de 31.7 = 13 x 108
crecimiento - -
UFC/ml
Valores expresados como promedio ± desviación estándar.
a
Calculado en 100 g de muestra, b Calculado en 31.5 g, c Calculado en 100 mL de bebida fermentada.

La bebida a base de lupino tiene un gran potencial debido a que las bacterias ácido lácticas
(BAL) metabolizan diferentes sustratos, lo que lleva a cambios bioquímicos en la
composición de la bebida mejorando las propiedades nutricionales, la biodisponibilidad de
los compuestos nutritivos, las propiedades sensoriales de las matrices alimentarias e
incrementando la vida útil (Septembre-Malaterre et al. 2018; Guerin et al. 2020; Petrova y
Petrov 2020). Así, los alimentos fermentados de origen vegetal presentan una mayor
actividad antioxidante, debido principalmente al aumento de los compuestos fenólicos y
flavonoides por hidrólisis microbiana. Las enzimas microbianas hidrolizan glucósidos
fenólicos y liberan agliconas, que tiene mayor capacidad antioxidante (Sun Jin et al. 2014).
La fermentación en fase líquida que se produce en las bebidas conduce a una rápida
bioconversión, junto con la liberación directa de los metabolitos en el medio de cultivo en
comparación con las fermentaciones en estado sólido (Subramaniyam y Vimala 2012).

80
Finalmente es importante resaltar que la bebida fermentada a base de lupino, puede
representar un producto potencial para la salud, debido a que contiene varios productos
llamados postbióticos, que son subproductos metabólicos (compuestos bioactivos) solubles
secretados por microorganismos probióticos vivos, liberados de la matriz alimentaria, y
después de su lisis bacteriana, ofrecen efectos positivos al huésped. Así mismo los
postbióticos pueden denominarse metabióticos, biogénicos o metabolitos y/o sobrenadantes/
extractos libres de células (Aguilar et al. 2018)

4.7.1. Evaluación sensorial de la bebida

La evaluación sensorial de la bebida óptima se realizó mediante una prueba de aceptabilidad

general, para ello se consideró agregar jalea de fresa. La prueba se realizó con 80 panelistas
sin entrenar, quienes evaluaron las propiedades sensoriales de la bebida. La media de los
puntajes obtenidos por los panelistas se muestra en la Figura 23. La bebida optimizada tuvo
una puntuación de 5.4 ± 2.4 en aceptabilidad general, la que encuentra dentro de los rangos
"me gusta" y "me gusta mucho" de la escala no estructurada (1-10 cm). Cabe resaltar que los
resultados pudieron estar influenciados por la adición de jalea de fresa, así como también
por los metabolitos producidos a partir del metabolismo de las bacterias, que proporcionan
importantes atributos de sabor (Salmerón et al. 2014). Debido a que las bacterias probióticas
fermentan los carbohidratos de frutas, verduras, cereales y legumbres produciendo gas y
alcohol (Mohammadi et al. 2011). Las bacterias probióticas el género L. plantarum se
caracteriza por la formación de diacetil (un fuerte olor a mantequilla) y acetoína (un olor
similar al yogur), que podría mejorar el sabor de los alimentos fermentados, como el yogur
(Xiao y Lu 2014).

Por otro lado, Singh et al. (2017), afirman que los compuestos fenólicos presentes en el
lupino también pueden afectar las propiedades sensoriales de los alimentos. Cabe resaltar
que, elaborar bebidas no lácteas es un desafío, en vista que las legumbres presentan
componentes distintos a los que se pueden encontrar en frutas y lácteos, facilitando la
aceptabilidad del consumidor. Esta afirmación es reforzada por Sethi et al. (2016), que
señalan que, en las alternativas lácteas a base de legumbres, la aceptabilidad sensorial es un
factor limitante. Por la presencia de ácidos grasos insaturados y la presencia de lipoxigenasas
(Maestri et al. 2000 ) quienes catalizan la formación de hidroperóxidos, a partir de ácidos
grasos insaturados, cuando se degradan, dando lugar a compuestos volátiles y no volátiles,

81
como aldehídos y alcoholes de cadena media (n -hexanal y n-hexanol), que se asocian con
sabor a frijol o desagradable (Silva et al. 2020). Sin embargo, los procesos tanto tecnológicos
como fermentativos, pueden mejorar la calidad sensorial (eliminar el sabor a frijol) (Caplice
et al. 1999).
Así mismo es importante tener en cuenta que los métodos de conservación también puede
influir en las propiedades sensoriales. Mäkinen et al. (2015) mencionan que la
pasteurización, el tratamiento UHT, mejora la estabilidad microbiológica y extiende la vida
útil del producto. Sin embargo, el tratamiento térmico puede causar cambios en las
propiedades de las proteínas y vitaminas, lo que influye en la estabilidad, el sabor, el aroma
y el color del producto final.

15
P u n t a j e p r o m e d io

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
N ú m ero d e ju eces

Figura 23: Evaluación de aceptabilidad general de la bebida fermentada, cada barra

representa el promedio de 5 jueces de los 80 evaluados.

4.7.2. Estabilidad durante el almacenamiento de la bebida probiótica

• Viabilidad de las bacterias probióticas

El comportamiento de las bacterias probióticas en la bebida durante 28 días de

almacenamiento a 4 °C se muestra en la Figura 24. La bebida fermentada a base de lupino
frutada con jalea de fresa posterior a los 7 días, mostró una disminución ligera a un nivel de
9.04 log UFC/ml, y a los 14 días de almacenamiento la tendencia de la viabilidad tiende a
bajar un ciclo logarítmico y posteriormente se mantiene constante durante los 28 días. La
disminución ligera de las bacterias puede verse afectadas también por la acidez y los bajos
niveles de pH, debido a la producción de ácido láctico y ácidos orgánicos, que inhiben el

82
crecimiento microbiano en su forma no disociada, disociada o indirectamente mediante la
liberación de protones (H +) en el medio (Rathore et al. 2012). Al respecto Champagne et
al. (2008), mencionan que, por lo general los jugos de frutas con bajo pH y un alto contenido
de ácidos orgánicos imponen un desafío de estrés significativo a los probióticos.

El recuento de células viables de L. plantarum 299v posterior a los 28 días fue de 8.75 log
(57 x 107) UFC/ml, con una reducción de 0.26 log aun pH de 3.85. Sin embargo, cabe resaltar
que el nivel obtenido al final del almacenamiento se encontró muy por encima del mínimo
terapéutico recomendado de 6 log UFC/ml en el momento del consumo (Organización de
las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y Organización Mundial de la
Salud 2001). Dichos valores del estudio también fueron superiores a los obtenidos por
Angelov et al. (2006), durante 21 días de almacenamiento de una bebida de avena.

El mantenimiento de la viabilidad de las bacterias pudo estar influido por la presencia de

inulina en la bebida, como lo mencionan Capela et al. (2006), la adición de oligofructosa
como prebiótico al yogur (1,5 % p/v) mejoró la viabilidad de los organismos probióticos
durante el almacenamiento refrigerado. Los fructanos, fructo oligosacáridos e inulina, así
como los galacto oligosacáridos (GOS) y la lactulosa, son los compuestos más utilizados
como prebióticos que ayudan a mejorar la actividad de los probióticos (Markowiak et al.
2017; Rastall et al. 2015). Así mismo, Savedboworn et al. (2017), determinaron que la
suplementación de inulina al 2 % proporcionó el mayor número de células viables de 8.90
UFC/ml después de la fermentación de extracto de arroz Plai Ngahm Prachin Buri. Respecto
a la reducción obtenida al final del almacenamiento, este valor fue más bajo frente a lo
reportado en otros productos como jugos, donde mencionan que la disminución de 0.4 log
después de 6 semanas de almacenamiento a 4 °C se observó en naranja y piña, los cuales
tenían un valor de pH de aproximadamente 3.8. Disminuciones más resaltantes fueron de
8.0 log, la viabilidad celular en los jugos puede estar fuertemente influenciado por los altos
niveles de compuestos fenólicos y al muy bajo pH de estos jugos por ejemplo granada y
fresa con pH ≤ 3 (Nualkaekul et al. 2011), dicho comportamiento no se observó en el trabajo
de investigación en vista que el valor de pH final de almacenamiento fue de 3.85 (Cuadro
25).

Como se mencionó anteriormente la viabilidad de las bacterias en el producto probiótico

durante el almacenamiento, es considerado un factor crítico, la viabilidad de los probióticos

83
en las leches fermentadas podría verse afectada significativamente por la formulación y los
factores del proceso durante la producción (Lucas et al. 2004). La bebida a base de lupino
cumple con el nivel exigido de probióticos viables posterior al proceso de almacenamiento.
Sin embargo, se vienen desarrollando trabajos de investigación relacionados a bacterias
probióticas no viables, los llamados paraprobióticos, que son células microbianas
(probióticas o no probióticas) intactas inactivas (no viables), que cuando se administran en
cantidades suficientes confieren beneficios a los consumidores (Cuevas-Gonzáleza et al.
2020). Esto significaría que las bacterias no viables intactas, que se incrementan durante el
almacenamiento en la bebida de lupino, podrían también ejercer efectos saludables.

1 0 .0

AF DF
9 .5

9 .0
L o g U F C /m l

8 .5

8 .0

7 .5

7 .0
7 14 21 28

T i e m p o d e a l m a c e n a m ie n t o ( d ía s )

Figura 24: Viabilidad de L. plantarum 299v (●) durante el almacenamiento. AF (antes de

fermentar), DF (Después de fermentar).

• Características morfológicas

Las imágenes de microscopía electrónica de barrido indicaron diferencias en la

microestructura de las muestras antes y después de fermentar (Figura 25 A y B). La bebida
antes de fermentar es mucho más rugosa con presencia de partículas irregulares, en contraste
a la bebida después de fermentar, que es más homogénea. Dicha estructura en la bebida

84
fermentada puede estar relacionado con la producción de exopolisacaridos (EPS) generados
por los procesos metabólicos de las bacterias. Según Gangoiti et al. (2017) los EPS
contribuye con la reología de los alimentos fermentados y proporciona posibles propiedades
promotoras de la salud en los avances de los alimentos funcionales.

Por otro lado, a mayor aumento las bacterias de Lactobacillus plantarum 299v presentes en
la bebida se muestran como barras regulares de aproximadamente 1.9 - 2 μm de largo, con
algunas formas más cortas y alargadas (Figura 24C). Las bacterias presentan una distribución
aleatoria en la bebida fermentada, asociada con la penetración de las mismas en los espacios
intracelulares, poros y capilares de los tejidos vegetales (Brackett y Splittstoesser 2001).

85
Figura 25: Microestructuras mediante SEM de la bebida de lupino: A) Antes de fermentar (500x), B) Después de fermentar (250x) y C)
Viabilidad de L. plantarum 299v después de fermentar (4000x)
a: bacterias; Det: detector con detector de electrones retrodispersados (BSED - Back Scattered Electron Detector); Mag: magnificación o aumento y WD: distancia de trabajo.

86
• Características fisicoquímicas y reológicas

En el Cuadro 25 se muestra las características fisicoquímicas de la bebida a base de lupino

almacenada durante un periodo de 28 días a 4 °C. El pH de la bebida al inicio del
almacenamiento fue de 4.72, posterior a los 28 días el pH desciende a 3.85. lo cual se asocia
directamente con la disminución de la viabilidad de las bacterias probióticas. En trabajos
anteriores se observó una disminución en el pH de un producto similar al yogur a base de
maíz simbiótico de aproximadamente 4.50 a 3.88 durante el almacenamiento (Wang, Zheng,
Liu, Wang y Guo 2017). En cuanto a la acidez titulable de la bebida, inicialmente fue 0.31
%, posterior a la etapa de almacenamiento alcanzo a 0.76 %. Los valores de acidez obtenida
al inicio del almacenamiento fueron similares a los reportados por Beuchat et al. (1978), en
leche de maní fermentada (0.3-0.53 %) durante 48-72 h. El patrón de comportamiento del
pH y la acidez titulable de la bebida se atribuye a la acumulación de algunos ácidos orgánicos
y ácido acético como resultado de las actividades metabólicas de los microorganismos
fermentativos como las bacterias del ácido láctico (Gesinde et al. 2008; Almeida et al.
2007).

Cuadro 25: Características fisicoquímicas y reológicas de la bebida fermentada

Tiempo de pH AT Firmeza Viscosidad

almacenamiento (% ácido láctico) (mN) (cP)
(días)
1 4.72±0.015a 0.31±0.02a 62.63±1.47a 1327.8±6.94 a
7 4.18±0.006b 0.53±0.01b 61.75±0.29ab 869.0±2.31 b
14 4.02±0.035c 0.54±0.02b 60.37±0.28ab 464.6±3.95 d
21 3.87±0.006d 0.71±0.01c 59.30±1.69c 465.2±4.67 d
28 3.85±0.020d 0.76±0.01d 60.93±1.42ab 534.4±5.09 c
Valores expresados como promedio ± desviación está[Link]: Acidez titulable. *Bebida sin frutar

Por otro lado, la firmeza de la bebida posterior al proceso de fermentación fue de 62.63 mN.
Durante los 28 días de almacenamiento, la tendencia de la firmeza de la bebida tuvo un
comportamiento constante con excepción del día 21 (Cuadro 25). Características muy
similares se observaron en trabajos previos de yogurt fortificado con fitoesteroles (Izadi et
al. 2015). Al respecto Tamime et al. ( 1991), reportaron que la diferencia en la firmeza de
los yogures podría atribuirse a la estructura de la matriz proteica del gel. Finalmente, la
viscosidad de la bebida disminuyó de 1327.8 ± 6.94 a 534.4 ± 5.09 cP durante los 28 días de

87
almacenamiento, este comportamiento probablemente esté relacionado con la capacidad de
retención de agua (Duru et al. 2019). Sathe et al. (1982) mencionan que la capacidad de
absorción de agua de la harina de L. mutabilis es menor debido a la presencia de grasa (17,9
%); así mismo, la baja capacidad de absorción de agua puede estar relacionada con una baja
disponibilidad de aminoácidos polares, que son los sitios principales para la interacción de
proteínas con el agua. Los valores obtenidos de la viscosidad de la bebida fueron muy
inferiores a los reportados por Izadi et al. (2015); sin embargo, al comparar con una bebida
fermentada a base de quinoa, los valores obtenidos fueron mayores (Lorusso et al. 2018)

88
 V. CONCLUSIONES

1. Se realizó la caracterización física y química proximal, observándose una mayor

concentración de proteínas posterior al proceso de desamargado.

2. Se identificaron y cuantificaron los alcaloides en los diez ecotipos de lupino (Lupinus

mutabilis Sweet) sin desamargar y desamargados, identificándose ocho alcaloides en las
semillas sin desamargar y dos alcaloides residuales posterior al proceso de desamargado
acuoso, la concentración de los alcaloides en las semillas desamargadas tuvieron un
valor muy bajo respecto al nivel máximo permitido por las regulaciones internacionales.

3. Se identificaron y cuantificaron los flavonoides (isoflavonas y flavonas) en los diez

ecotipos de lupino sin desamargar y desamargados. Observándose que posterior al
proceso de desamargado acuoso los flavonoides disminuyen en los distintos ecotipos,
así mismo se observaron diferencias significativas entre los diez ecotipos evaluados.

4. De las semillas desamargadas, se seleccionó el ecotipo apropiado para la elaboración de

la bebida, siendo el ecotipo Altagracia el que presentó mayor concentración de
proteínas, niveles no significativos de alcaloides residuales y un importante contenido
de flavonoides (isoflavonas y flavonas).

5. Se evaluó los factores de formulación de la bebida sobre el crecimiento de Lactobacillus

plantarum 299v y el nivel de pH. La viabilidad de las bacterias probióticas y el pH en
la bebida a base de lupino estuvo influenciada principalmente por el tipo de bacteria
probiótica, concentración de azúcar y relación de lupino: agua. La tasa de crecimiento
de las bacterias probióticas en la bebida fue significativa, lo que permitió considerarla
bebida potencialmente probiótica de acuerdo a los niveles terapéuticos establecidos, y
el nivel de pH alcanzo valores deseados en la bebida.
6. Se realizó la caracterización fisicoquímica y sensorial de la bebida probiótica óptima,
cuyos resultados mostraron una buena aceptabilidad por parte de los consumidores.

7. Se identificaron los cambios fisicoquímicos en la bebida durante el tiempo de

almacenamiento, la bebida presentó características similares a otras bebidas a base de
fuentes vegetales en relación al pH, acidez, viscosidad y nivel de viabilidad de bacterias
probióticas, demostrándose en el estudio, que las matrices vegetales podrían actuar
como vehículos de bacterias.

90
 VI. RECOMENDACIONES

1. Evaluar tipos de estabilizantes y tiempos de homogenización para mejorar la

viscosidad de la bebida probiótica.

2. Identificar y cuantificar los metabolitos secundarios generados posterior al proceso

de fermentación.

3. Realizar estudios in vitro que simulen la digestión, para evaluar la estabilidad de los
probióticos, utilizados en la matriz alimentaria.
 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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VIII. ANEXOS
Anexo 1: Curva de calibración para la determinación de compuestos fenólicos totales.

Absorbancia a 755 nm

Concentración de ácido gálico (mg/ml)

111
Anexo 2: Información del compuesto 20 (aglicona de isoflavona desconocida). a. Absorción
UV, b. Espectro de masas (MS) a modo negativo, c. Espectro de masas (MS) a modo positivo,
d. Scanner del producto de 301 ([M+H]+, m/z).

112
Anexo 3: Información del compuesto 21 (aglicona de flavona desconocida). a. Absorcion UV,
b. Espectro de masas (MS) a modo negativo, c. Espectro de masas (MS) a modo positivo, d.
Scanner del producto de 301 ([M+H]+, m/z).

113
Anexo 4: Análisis de varianza del diseño experimental Taguchi L8 (27)

Análisis de varianza
(Mean = 27.3413 Sigma = 6.44408
SS DF MS F p
F1 66.4462 1 66.4462 42.9558 0.000318
F2 24.3355 1 24.3355 15.7323 0.005417
F3 0.2066 1 0.2066 0.1336 0.725566
F4 440.3982 1 440.3982 284.7064 0.000001
F5 61.0353 1 61.0353 39.4578 0.000411
F6 13.3789 1 13.3789 8.6491 0.021684
F7 6.2643 1 6.2643 4.0497 0.084070
Residual 10.8280 7 1.5469

114
 Anexo 5: Artículos publicados y por publicar derivadas de la tesis

Artículos publicados en revistas indizadas

✓ Cortés-Avendaño, P; Tarvainen, M; Suomela, JP; Glorio-Paulet, P; Yang, B; Repo-

Carrasco-Valencia, R. 2020. Profile and Content of Residual Alkaloids in Ten Ecotypes
of Lupinus mutabilis Sweet after Aqueous Debittering Process. Plant Foods for Human
Nutrition.

Publicaciones en congresos científicos

✓ Identificación y cuantificación de alcaloides de lupino (Lupinus mutabilis Sweet).

Valparaíso-Chile. 2017.

✓ Optimization of fermentation parameters for the growth of Lactobacillus plantarum

299v in lupin (Lupinus mutabilis. Sweet). Cochabamba, Bolivia. 2019.

Artículos en preparación

✓ Profile and Content of Isoflavone and flavone in Ten Ecotypes of Lupinus mutabilis
Sweet after Aqueous Debittering Process.

✓ Development of non-dairy probiotic drink based of Lupinus mutabilis Sweet

115