UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO
LAB INGENIERÍA GENÉTICA
DANIEL DÁVILA (00204439); DANNY BRAVO (00200454)
2021 – 03 – 02
DEBER No. 2 RT-qPCR
INTRODUCCIÓN
La RT-qPCR también conocida como PCR cuantitativa de transcripción inversa es
una técnica la cual se encarga de detectar y cuantificar la cantidad de RNA que se encuentre
en una muestra de interés. Esto se logra a través de la enzima transcriptasa inversa la cual
transforma el RNA total o RNAm a DNAc, una vez que este proceso concluye entra en
juego el qPCR que se encarga de amplificar dianas específicas que se encuentran en el
DNA complementario, en este tipo de PCR la cantidad de DNA de la muestra se cuantifica
en tiempo real, usualmente para la detección se encuentran una serie de químicos los cuales
se encargan del marcaje del DNA, el marcaje fluorescente es posible debido a que existe
una unión con el dsDNA y de este modo mientras cada ciclo transcurre se va midiendo la
fluorescencia que va aumentando mientras la cantidad de DNA replicado aumenta (Tyler,
2010). Las aplicaciones de esta técnica son realmente variadas debido a que se pueden
aplicar para distintos enfoques, entre ellos se puede destacar la utilización de RT-qPCR
para la detección de organismos genéticamente modificados, cuantificar los niveles de
expresión génica, etc. Un uso muy característico es la detección de patógenos como virus
para lograr diagnosticar enfermedades infecciosas a tiempo como es el caso de COVID-19
(Yelin, 2020). La cuantificación de los resultados se realiza de dos formas distintas (relativa
o absoluta), al utilizar la cuantificación absoluta lo que se realiza es medir muestras
desconocidas a partir de la interpolación de su cantidad mediante una curca estándar, por
otra parte, al realizar una cuantificación relativa se la realiza con instrumentos SDS, estos
métodos pueden ser la realización de una curva estándar o un método comparativo de TC.
La utilización de estos métodos puede brindar resultados equivalentes, sin embargo, es muy
importante elegir de forma objetiva el método a utilizar dependiendo del trabajo que se
realizara (Lee, 2008).
EJERCICIO 1
-Tenemos 20 pacientes con sospecha de estar contagiados con el virus SARS-CoV-2, por lo
que queremos detectar su carga viral
- El Threshold para considerar que un paciente está con COVID-19 es cuanto tienen 1000
unidades de virus/ml
Se obtuvo tres curvas estándar. Graficar Log10 unidades de virus/ml vs Ct y
contestar:
Tabla 1: Valores CT (CT1, CT2, y CT3) correspondientes para 6 muestras de pacientes con sospecha
de infección a SARS-CoV-2. Concentración viral expresada en Log10 unidades de virus/ml
Muestra Log10 Unidades del Ct1 Ct2 Ct3
virus/ml
1 6 12 14,34 17,35
2 5 14,75 17,65 18,32
3 4 18,65 21,98 18,47
4 3 19,47 24,01 20,3
5 2 25,98 27,68 25,32
6 1 28,9 30,5 31,87
Gráfico 1: Log10 Unidades de SARS-CoV-2/ml en 6 muestras de pacientes vs su valor CT1 tras una
Pendiente: -3,4003 RT-qPCR.
R2= 0.9698
Gráfico 2: Log10 Unidades de SARS-CoV-2/ml en 6 muestras de pacientes vs su valor CT2 tras una
RT-qPCR.
Pendiente: -3,2263
R2= 0.9939
Gráfico 3: Log10 Unidades de SARS-CoV-2/ml en 6 muestras de pacientes vs su valor CT3 tras una
RT-qPCR.
Pendiente: -2,7266
R2= 0.8186
1. ¿Cuál es la curva estándar más confiable y por qué?
A partir de los datos de las pendientes y los R2, se deduce que la curva estándar más
confiable es la del Gráfico 2 (Log10 unidades virus/ml vs CT2), debido a que su valor R 2 es
el más cercano a 1 comparado con los otros 2 gráficos. Además, su pendiente es -3,2263 se
encuentra en el rango de pendiente para una curva estándar eficiente (-3,58; -3,10); a pesar
que la pendiente en el Gráfico 1 también se encuentra en ese rango (-3,4003), se prefiere el
Gráfico 2 por su valor R2.
2. ¿Cuál es la curva estándar menos confiable y por qué?
Es el Gráfico 3 (Log10 unidades virus/ml vs CT3), debido a que es la única curva cuya
pendiente no está en el rango de curva estándar eficiente (-2,7266); además, el valor R 2 es
el menor de las otras 2 gráficas y, por lo tanto, menor a 1 (menor correlación entre los
datos).
A partir de la curva estándar ideal, contestar:
3. ¿Cuál es la carga viral para cada uno de los 20 pacientes? Usa la mejor curva estándar
A partir de la segunda curva estándar (Log10 unidades virus/ml vs CT2) se tiene la
fórmula:
y=−3,2263 x +33,985
Para la muestra 1:
(18,40−33,985)
x= =4,831
−3,2263
4,831
10 =67 703 unidades de virus/ml
Para la muestra 2:
(26,9−33,985)
x= =2,196
−3,2263
2,196
10 =157 unidades de virus/ml
Para la muestra 3:
(26,68−33,985)
x= =2,264
−3,2263
2,264
10 =184 unidadesde virus /ml
Para la muestra 4:
(18,4−33,985)
x= =4,831
−3,2263
4,831
10 =67 703 unidades de virus/ml
*Para la muestra 5:
(13,47−33,985)
x= =6,359
−3,2263
106,359=2' 283 900unidades de virus/ml
Para la muestra 6:
(20,98−33,985)
x= =4,031
−3,2263
4,031
10 =10 738 unidades de virus /ml
Para la muestra 7:
(15,64−33,985)
x= =5,686
−3,2263
105,686=485 377unidades de virus/ml
*Para la muestra 8:
(12,61−33,985)
x= =6,625
−3,2263
6,625 '
10 =4 219260 unidades de virus/ml
Para la muestra 9:
(25,98−33,985)
x= =2,481
−3,2263
102,481=303 unidades de virus /ml
*Para la muestra 10:
(32,14−33,985)
x= =0,572
−3,2263
0,572
10 =4 unidades de virus /ml
*Para la muestra 11:
(39,9−33,985)
x= =−1,833
−3,2263
10−1,833 ≈ 0 unidadesde virus /ml
*Para la muestra 12:
(13,2−33,985)
x= =6,442
−3,2263
6,442 '
10 =2 769 263 unidades de virus /ml
Para la muestra 13:
(22−33,985)
x= =3,715
−3,2263
103,715=5 185 unidades de virus /ml
*Para la muestra 14:
(11,68−33,985)
x= =6,913
−3,2263
6,913 '
10 =8 193 929 unidades de virus /ml
Para la muestra 15:
(18,98−33,985)
x= =4,651
−3,2263
104,651=44 754 unidades de virus/ml
Para la muestra 16:
(25,06−33,985)
x= =2,766
−3,2263
2,766
10 =584 unidades de virus/ml
Para la muestra 17:
(16,5−33,985)
x= =5,420
−3,2263
105,420=262 736 unidades de virus /ml
Para la muestra 18:
(18,34−33,985)
x= =4,849
−3,2263
4,849
10 =70 665 unidades de virus/ml
Para la muestra 19:
(25,9−33,985)
x= =2,506
−3,2263
102,506=321 unidades de virus /ml
Para la muestra 20:
(15,78−33,985)
x= =5,643
−3,2263
5,643
10 =439224 unidadesde virus /ml
4. De las muestras analizadas, ¿existen algunas que no se pueda determinar la carga viral?
Explicar cada caso.
Las muestras 5, 8, 12 y 14 no pueden ser analizadas a pesar de que sí se puede
calcular su carga viral. La muestra 5 tiene un Ct de 13,47; la muestra 8 tiene un Ct de
12,61; la muestra 12 tiene un Ct de 13,2; y la muestra 14 tiene un Ct de 11,68. Estos Ct son
menores que el Ct mínimo de la curva estándar (14,34), por lo que no se pueden analizar
estas muestras ya que no se encuentran dentro de los parámetros de la curva (no es un
modelo de predicción).
De igual forma, las muestras 10 y 11 tampoco pueden ser analizadas. El Ct de la
muestra 10 es de 32,14; y el Ct de la muestra 11 es 39,9. Estos Ct son mayores al valor Ct
máximo usado en la curva estándar (30,5), por lo que no pueden considerarse para ser
analizadas debido a que no están dentro de los parámetros de la curva.
5. Explicar las ventajas y desventajas de utilizar el método de cuantificación absoluta para
este tipo de estudios.
Las ventajas de usar este método de cuantificación radican que puede servir para
calcular la concentración inicial de material genético de la muestra de forma rápida. Es
necesario reemplazar en una sola fórmula para obtener la concentración inicial de la
muestra. Además, de que en este tipo de estudios hay información en publicaciones sobre
los valores Ct para cierta concentración inicial de material genético, por lo que la
construcción de una curva estándar puede resultar más sencillo de elaborar.
Sin embargo, las desventajas de usar este método de cuantificación radican en que
es necesario tener una curva estándar de referencia para calcular la concentración inicial de
material genético en una muestra. Pueden existir muchas curvas óptimas, pero sólo algunas
pueden servir acorde a los parámetros requeridos, donde un máximo o mínimo valor Ct
implementado en esas curvas pueden no cubrir los valores Ct del qPCR de una muestra,
debido a que este método de cuantificación no es un modelo de predicción. Por ello, toma
tiempo y recursos el ampliar el rango de los valores Ct para una curva estándar eficiente e
incorporarlo con valores Ct de ciertas muestras.
EJERCICIO 2
Tenemos rosas sometidas a suelos con pH ácidos. pH muy bajo impide la absorción de agua
y nutrientes.
Suelos ácidos vs. neutros de Pichincha, Chimborazo y Azuay
Gen control: RES (Gen housekeeping cuya expresión no varía según tratamiento).
Gen en prueba: ACI (Gen que se activa cuando hay suelos muy ácidos). Permite la
absorción de agua y nutrientes.
Plantas utilizadas:
a) Determinar: 2^-∆∆CT de cada localidad. Deben tener tres valores, uno de cada
provincia.
ΔCT (CT ACI- CT RES)
Suelo ácido
ΔCT PA=27,43-55,36= -27,93
ΔCT CA= 42,12-51,32= -9,2
ΔCT AA= 29,24-48,67= -19,43
Suelo neutro
ΔCT PN= 40,62-47,89= -7,27
ΔCT CN= 48,98-52,80= -3,82
ΔCT AN= 48,91-49,73= -0,82
Tabla 2: ΔCT del gen ACI y el gen control RES a partir de 6 muestras de rosas sometidas a 2 tratamientos (rosas en Pichincha,
Chimborazo y Azuay con suelo ácido y rosas en Pichincha, Chimborazo y Azuay con suelo neutro).
Muestra en suelo Muestra en suelo
ΔCT ΔCT
ácido neutro
PA -27,93 PN -7,27
CA -9,2 CN -3,82
AA -19,43 AN -0,82
ΔΔCT (ΔCT suelo ácido – ΔCT suelo neutro)
ΔΔCT P= (-27,93) - (-7,27) = -20,66
ΔΔCT C= (-9,2) - (-3,82) = -5,38
ΔΔCT A= (-19,43) - (-0,82) = -18,61
Tabla 3: ΔΔCT del gen ACI y el gen control RES a partir de 6 muestras de rosas sometidas a 2 tratamientos (rosas en Pichincha,
Chimborazo y Azuay con suelo ácido y rosas en Pichincha, Chimborazo y Azuay con suelo neutro).
Muestra ΔΔCT
P -20,66
C -5,38
A -18,61
Tabla 4: 2- ΔΔCT del gen ACI y el gen control RES a partir de 6 muestras de rosas sometidas a 2 tratamientos (rosas en Pichincha,
Chimborazo y Azuay con suelo ácido y rosas en Pichincha, Chimborazo y Azuay con suelo neutro).
Muestra 2- ΔΔCT
P 1,66 x 106
C 41,64
A 4 x 105
b) Graficar: 2^-∆∆CT de cada localidad.
Gráfico 4: 2- ΔΔCT de ACI en rosas en las provincias de Pichincha, Chimborazo y Azuay.
c) Explicar los resultados obtenidos de manera detallada.
En el Gráfico 4 se observa que hay una mayor diferencia de expresión del gen ACI en
rosas de Pichincha, seguida de Azuay y al último Chimborazo.
El 2- ΔΔCT para las rosas de Pichincha es de 1,66 x 106, lo que indica que el gen ACI se
sobrexpresa 1,66 x 106 veces más en las rosas de Pichincha en los suelos ácidos respecto a
los suelos neutros.
El 2- ΔΔCT para las rosas de Chimborazo es de 41,64; lo que indica que el gen ACI se
sobrexpresa 41,64 veces en las rosas de Chimborazo en los suelos ácidos respecto a los
suelos neutros.
Finalmente, el 2- ΔΔCT para las rosas de Azuay es de 4 x 10 5; lo que indica que el gen
ACI se sobrexpresa 4 x 105 veces en las rosas de Azuay en los suelos ácidos respecto a los
suelos neutros.
Esto indica que, en suelos ácidos, el gen ACI de las rosas en Pichincha se sobrexpresa
más que las rosas de Azuay, u esta última se sobrexpresa más que las rosas de Chimborazo.
CONCLUSIONES
La capacidad que poseemos de RT-qPCR, es bastante amplia debido a la
versatilidad de su análisis, se encuentran resultados en tiempo real de las muestras que
estamos analizando y es por esto que incluso ahora es una de las herramientas principales
para realizar exámenes de COVID-19 en el mundo. Si bien tenemos una cuantificación
absoluta y relativa, cada una de estas abre la oportunidad de tener variedad para la
realización de pruebas. Una de ellas es la cuantificación absoluta mediante PCR digital,
cuando optamos por este método no es necesaria la utilización de estándares conocidos,
debido a que la muestra de interés se puede cuantificar directamente por el número de
réplicas que se obtengan de la PCR digital, esto dará la precisión a la prueba y del mismo
modo entre más se realicen será mejor para la fiabilidad del trabajo. Dentro de la
cuantificación absoluta también encontramos el método de la curva estándar, en el cual a
partir de un numero de datos conocidos se procede a cuantificar las incógnitas que se
encuentran dentro de la muestra, para esto es necesario encontrar una curva estándar, la
cual será un molde para comprar las incógnitas encontradas mediante la extrapolación de
las mismas. Finalmente encontramos la cuantificación relativa, básicamente dentro de este
método lo que se realiza es observar y comparar los cambios que han existido en la
expresión génica de una muestra con otro con el fin de que la muestra de comparación
funcione como un control. Las ventajas de cada uno de estos métodos son varios, en el caso
de PCR digital encontramos que son muy tolerantes a los inhibidores, es completamente
autosuficientes para lograr analizar muestras complejas y no se necesita depender de otros
controles ni estándares. El método de la curva estándar requiere de una menor cantidad de
validación y finalmente el comparativo TC se basa en la comparación del gen objetivo con
otro.
BIBLIOGRAFIA
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