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011290NEIS104 - ES Listeria

Microbiología de la cadena alimentaria. Método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes y de Listeria spp. Parte 1: Método de detección. (ISO 11290-1:2017).

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Microbiología de la cadena alimentaria. Método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes y de Listeria spp. Parte 1: Método de detección. (ISO 11290-1:2017).

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Norma Española

UNE-EN ISO 11290-1

Enero 2018

Microbiología de la cadena alimentaria

Método horizontal para la detección y el recuento de
Listeria monocytogenes y de Listeria spp.
Parte 1: Método de detección
(ISO 11290-1:2017)

Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico

CTN 34 Productos alimentarios, cuya secretaría
desempeña FIAB.

Asociación Española
de Normalización
Génova, 6 - 28004 Madrid
915 294 900
info@[Link]
[Link]

Este documento ha sido adquirido por UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER a través de la suscripción a AENORmás.
Para uso en red interna se requiere de autorización previa de AENOR.
UNE-EN ISO 11290-1

Microbiología de la cadena alimentaria

Método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes y de
Listeria spp
Parte 1: Método de detección
(ISO 11290-1:2017)

Microbiology of the food chain. Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria
monocytogenes and of Listeria spp. Part 1: Detection method (ISO 11290-1:2017).

Microbiologie de la chaîne alimentaire. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de

Listeria monocytogenes et de Listeria spp. Partie 1: Méthode de recherche (ISO 11290-1:2017).

Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 11290-1:2017,

que a su vez adopta la Norma Internacional ISO 11290-1:2017.

Esta norma anula y sustituye a las Normas UNE-EN ISO 11290-1:1997 y

UNE-EN ISO 11290-1:1997/A1:2005.

Las observaciones a este documento han de dirigirse a:

Asociación Española de Normalización

Génova, 6
28004 MADRID-España
Tel.: 915 294 900
info@[Link]
[Link]
Depósito legal: M 1140:2018

UNE 2018
Prohibida
Publicado la reproducción
por sin el consentimiento
AENOR INTERNACIONAL de UNE.
S.A.U. bajo licencia de la Asociación Española de Normalización.
Reproducción
Todos prohibida
los derechos de propiedad intelectual de la presente norma son titularidad de UNE.

ICS 07.100.30 Sustituye a EN ISO 11290-1:1996

Versión en español

Microbiología de la cadena alimentaria

Método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes y de
Listeria spp
Parte 1: Método de detección
(ISO 11290-1:2017)

Microbiology of the food chain. Microbiologie de la chaîne alimentaire. Mikrobiologie der Lebensmittelkette.
Horizontal method for the detection Méthode horizontale pour la recherche Horizontales Verfahren für den
and enumeration of Listeria et le dénombrement de Listeria Nachweis und die Zählung von Listeria
monocytogenes and of Listeria spp. monocytogenes et de Listeria spp. monocytogenes und von Listeria spp.
Part 1: Detection method Partie 1: Méthode de recherche Teil 1: Nachweisverfahren
(ISO 11290-1:2017). (ISO 11290-1:2017). (ISO 11290-1:2017).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2017-04-06.

Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las
condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma
nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas
normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN/CENELEC, o a través de sus
miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra
lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al
Centro de Gestión, tiene el mismo rango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes:
Alemania, Antigua República Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia,
Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda,
Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino
Unido, República Checa, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Rue de la Science, 23, B-1040 Brussels, Belgium

 2017 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

Índice

Prólogo europeo .................................................................................................................................6

Declaración ...........................................................................................................................................6

Prólogo ...................................................................................................................................................7

0 Introducción ........................................................................................................................9

1 Objeto y campo de aplicación........................................................................................9

2 Normas para consulta ................................................................................................... 10

3 Términos y definiciones............................................................................................... 10

4 Principio ............................................................................................................................ 11
4.1 Generalidades .................................................................................................................. 11
4.2 Enriquecimiento primario en un medio líquido de enriquecimiento
selectivo con concentración reducida de agentes selectivos (medio
semi-Fraser) ..................................................................................................................... 11
4.3 Enriquecimiento secundario con un medio líquido de
enriquecimiento selectivo con la concentración completa de agentes
selectivos (medio Fraser) ............................................................................................ 11
4.4 Siembra en placa e identificación ............................................................................. 11
4.5 Confirmación .................................................................................................................... 12

5 Reactivos y medios de cultivo .................................................................................... 12

6 Equipamiento y material fungible............................................................................ 12

7 Toma de muestras .......................................................................................................... 13

8 Preparación de la muestra para análisis ............................................................... 13

9 Procedimiento ................................................................................................................. 13
9.1 Porción para análisis y suspensión inicial ............................................................ 13
9.2 Enriquecimiento primario .......................................................................................... 14
9.3 Enriquecimiento secundario ...................................................................................... 14
9.4 Siembra en placa identificación ................................................................................ 14
9.4.1 Generalidades .................................................................................................................. 14
9.4.2 Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti.................................................... 15
9.4.3 Segundo medio selectivo ............................................................................................. 15
9.5 Confirmación de Listeria monocytogenes o Listeria spp. ................................ 15
9.5.1 Selección de colonias para su confirmación ......................................................... 15
9.5.2 Confirmación de L. monocytogenes .......................................................................... 16
9.5.3 Confirmación de Listeria spp...................................................................................... 21
9.6 Interpretación de las propiedades morfológicas y fisiológicas y de
las reacciones bioquímicas ......................................................................................... 22
9.7 Caracterización adicional de las cepas aisladas (opcional) ............................ 22

10 Expresión de los resultados ........................................................................................ 22

11 Características de funcionamiento del método ................................................... 23

11.1 Estudios de validación del método .......................................................................... 23

11.2 Sensibilidad ...................................................................................................................... 23
11.3 Especificidad .................................................................................................................... 23
11.4 Nivel de detección (LOD50) .......................................................................................... 23

12 Informe del análisis ....................................................................................................... 23

13 Garantía de la calidad ................................................................................................... 23

Anexo A (Normativo) Diagrama del procedimiento.................................................... 24

Anexo B (Normativo) Composición y preparación de los reactivos y

medios de cultivo .......................................................................... 25

Anexo C (Informativo) Distinción de Listeria spp. frente a otros géneros ............ 39

Anexo D (Informativo) Reacciones de identificación de las especies de

Listeria .............................................................................................. 40

Anexo E (Informativo) Medios de agar selectivos para Listeria ................................ 42

Anexo F (Informativo) Resultados de los estudios interlaboratorios para la

detección de Listeria monocytogenes .................................... 43

Bibliografía ........................................................................................................................................ 48

Prólogo europeo

El texto de la Norma EN ISO 11290-1:2017 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 34
Productos alimenticios en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 275 Análisis de los productos
alimenticios. Métodos horizontales, cuya Secretaría desempeña DIN.

Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto
idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de diciembre de 2017, y todas las normas
nacionales técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de diciembre de 2017.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén
sujetos a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de
dichos derechos de patente.

Esta norma anula y sustituye a la Norma EN ISO 11290-1:1996.

Esta norma europea ha sido elaborada bajo un Mandato dirigido a CEN por la Comisión Europea y por
la Asociación Europea de Libre Comercio.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma
europea los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Antigua República
Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia,
España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania,
Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía,
Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

Declaración

El texto de la Norma ISO 11290-1:2017 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 11290-1:2017
sin ninguna modificación.

Prólogo

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos

nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas
internacionales normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo
miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el
derecho de estar representado en dicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y
privadas, en coordinación con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la
Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todas las materias de normalización electrotécnica.

En la parte 1 de las Directivas ISO/IEC se describen los procedimientos utilizados para desarrollar esta
norma y para su mantenimiento posterior. En particular debería tomarse nota de los diferentes
criterios de aprobación necesarios para los distintos tipos de documentos ISO. Esta norma se redactó
de acuerdo a las reglas editoriales de la parte 2 de las Directivas ISO/IEC. [Link]/directives.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan
estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de
cualquiera o todos los derechos de patente. Los detalles sobre cualquier derecho de patente
identificado durante el desarrollo de esta norma se indican en la introducción y/o en la lista ISO de
declaraciones de patente recibidas. [Link]/patents.

Cualquier nombre comercial utilizado en esta norma es información que se proporciona para
comodidad del usuario y no constituye una recomendación.

Para obtener una explicación sobre el significado de los términos específicos de ISO y expresiones
relacionadas con la evaluación de la conformidad, así como información de la adhesión de ISO a los
principios de la Organización Mundial del Comercio (OMC) respecto a los Obstáculos Técnicos al
Comercio (OTC), véase la siguiente dirección: [Link]

Este documento ha sido preparado por el Comité Europeo de Normalización (CEN), Comité Técnico
CEN/TC 275, Análisis de los productos alimenticios. Métodos horizontales, en colaboración con el Comité
Técnico de ISO ISO/TC 34, Productos alimenticios, Subcomité SC 9, Microbiología, en base al acuerdo de
cooperación técnica entre ISO y CEN (Acuerdo de Viena).

Esta segunda edición anula y sustituye a la primera edición (Norma ISO 11290-1:1996) que ha sido
revisada técnicamente. También incorpora la corrección ISO 11290-1:1996/Corr.1:2004.

Los cambios principales respecto a la Norma ISO 11290-1:1996 son los siguientes:

– La detección de Listeria monocytogenes se ha modificado en las condiciones que se relacionan a

continuación:

– Enriquecimiento primario en medio semi-Fraser: incubación durante 25 h ± 1 h.

– Enriquecimiento secundario en medio de Fraser: incubación durante 24 h ± 2 h[29].

– Los medios de Fraser y semi-Fraser se pueden refrigerar antes de la transferencia o el aislamiento

en agar selectivo durante un tiempo máximo de 72 h.

– Conservación en las placas de aislamiento: las placas incubadas se pueden mantener refrigeradas
durante un tiempo máximo de dos días antes de su lectura.

– La apariencia microscópica para la confirmación es opcional si el medio de agar de aislamiento

permite distinguir entre Listeria spp. patogénicas y no patogénicas.

– Los análisis de CAMP y catalasa son opcionales.

– Inclusión de nuevas características de funcionamiento.

– Además, se ha incluido la detección de Listeria spp. en el campo de aplicación y se ha cambiado el

título en consecuencia.

En la dirección electrónica de ISO se puede consultar una lista de todas las partes de la serie de
Normas ISO 11290.

0 Introducción
Los cambios principales introducidos en este documento en relación a la Norma ISO 11290-1:1996,
relacionados en el prólogo, se consideran importantes (véase la Norma ISO 17468[28]). Se evaluaron los
cambios técnicos y se consideró que no ejercían un efecto significativo sobres las características de
funcionamiento del método ni sobre los resultados del análisis.

Debido a la gran variedad de productos alimenticios para consumo humano y animal, este método
horizontal puede no resultar adecuado en todos sus detalles para determinados productos, para los
cuales puede ser necesario utilizar métodos distintos o específicos. No obstante, está previsto que este
método horizontal se vaya a aplicar en la medida de lo posible en todos los casos y que su falta de
aplicación solamente se deba a razones técnicas justificadas.

La próxima vez que se revise este documento, se tendrá en cuenta toda la información disponible en
ese momento en relación al grado de seguimiento que ha tenido este método horizontal y los motivos
de la falta de seguimiento en determinados productos.

La armonización de los métodos de análisis no puede ser inmediata y pueden existir ya normas
internacionales y/o normas nacionales para ciertos grupos de productos que no se ajusten a este
método horizontal. Cabe esperar que cuando se revisen dichas normas, se modificarán para adaptarse
a este documento de forma que, finalmente, las únicas diferencias que queden respecto a este método
horizontal serán las estrictamente necesarias en base a razones técnicas bien establecidas.

ATENCIÓN – Para salvaguardar la salud del personal del laboratorio es esencial que los análisis
de detección de L. monocytogenes y Listeria spp. se realicen exclusivamente en laboratorios
bien equipados, bajo la supervisión de un microbiólogo experimentado, y que se preste el
máximo cuidado en la eliminación de todos los materiales sometidos a incubación. Las
personas que utilicen este documento deberían estar familiarizadas con las prácticas normales
de laboratorio. Este documento no pretende abarcar todos los problemas de seguridad
relacionados con su uso, en caso de que existan, sino que es responsabilidad del usuario
establecer las prácticas de seguridad e higiene adecuadas. En particular, se recomienda
encarecidamente que los análisis de detección de L. monocytogenes se realicen en laboratorios
que posean condiciones de bioseguridad de nivel 2. Se recomienda encarecidamente que el
personal femenino del laboratorio sea consciente del riesgo especial para el feto en desarrollo
ocasionado por infección de la madre por exposición a L. monocytogenes y Listeria spp. y que
las mujeres embarazadas y las personas con enfermedades subyacentes o situaciones
reconocidas de inmunidad celular reducida no manipulen cultivos de L. monocytogenes o
Listeria spp.

1 Objeto y campo de aplicación

Este documento describe un método horizontal para:

– la detección de L. monocytogenes; y

– la detección de Listeria spp. (incluida L. monocytogenes).

El documento resulta aplicable para:

– productos destinados al consumo humano y a la alimentación de los animales; y

– muestras ambientales recogidas del área de producción de alimentos y de manipulación de

alimentos.

Es posible que algunas especies de Listeria que se han descrito posteriormente no puedan detectarse o
confirmarse mediante este método [5], [10], [12], [14], [25], [26], [27].

2 Normas para consulta

Los documentos indicados a continuación, en su totalidad o en parte, son normas para consulta
indispensables para la aplicación de este documento. Para las referencias con fecha, solo se aplica la
edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición (incluida cualquier
modificación de esta).

ISO 6887 (todas las partes), Microbiología de la cadena alimentaria. Preparación de las muestras de
ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico.

ISO 7218, Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal. Requisitos
generales y guía para el examen microbiológico.

ISO 11133, Microbiología de los alimentos para consumo humano, alimentación animal y agua.
Preparación, producción, conservación y ensayos de rendimiento de los medios de cultivo.

3 Términos y definiciones
Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes.

ISO e IEC mantienen bases de datos terminológicas para su utilización en normalización en las
siguientes direcciones:

– Electropedia de IEC: disponible en [Link]

– Plataforma de búsqueda Online de ISO: disponible en [Link]

3.1 Listeria monocytogenes:

Microorganismos que forman colonias típicas en medios sólidos selectivos y que muestran las
características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas descritas cuando los análisis se realizan de
acuerdo con este documento.

3.2 detección de Listeria monocytogenes:

Determinación de la presencia o ausencia de Listeria monocytogenes (3.1) en una determinada masa o
volumen de un producto o en una superficie determinada, cuando los análisis se realizan de acuerdo
con este documento.

3.3 Listeria spp.:

3.4 detección de Listeria spp.:

Determinación de la presencia o ausencia de Listeria spp. (3.3) en una determinada masa o volumen de
un producto o en una superficie determinada, cuando los análisis se realizan de acuerdo con este
documento.

4 Principio

4.1 Generalidades
Listeria spp. puede estar presente en cantidades reducidas y suele venir acompañada por cantidades
considerablemente superiores de otros microorganismos, por lo que resulta necesario un
enriquecimiento selectivo. También resulta necesario detectar Listeria spp. dañadas y sometidas a
estrés, para las que el medio de enriquecimiento primario selectivo con una cantidad reducida de
inhibidores cumple, al menos en parte, esta función.

NOTA La presencia de L. monocytogenes puede quedar enmascarada por la presencia de otras especies de Listeria, en
especial por L. innocua o L. ivanovii.

Dentro del marco de este documento, la detección de L. monocytogenes y de Listeria spp. requiere de
cuatro etapas sucesivas, como se describe en el diagrama de flujo del anexo A.

4.2 Enriquecimiento primario en un medio líquido de enriquecimiento selectivo con

concentración reducida de agentes selectivos (medio semi-Fraser)
Inoculación de un medio de enriquecimiento primario selectivo que contiene una concentración
reducida a la mitad de acriflavina y ácido nalidíxico (medio semi-Fraser, véase el capítulo B.1), que
también se utiliza como medio de dilución para la porción para análisis (9.1).

Incubación de la suspensión inicial a 30 °C durante un tiempo de 24 h a 26 h.

4.3 Enriquecimiento secundario con un medio líquido de enriquecimiento selectivo

con la concentración completa de agentes selectivos (medio Fraser)
Inoculación de un medio líquido de enriquecimiento secundario selectivo de concentración completa
(medio Fraser) con el cultivo procedente del apartado 4.2.

Incubación del medio de Fraser a 37 °C durante 24 h[29].

4.4 Siembra en placa e identificación

Los cultivos obtenidos en los apartados 4.2 y 4.3 se siembran en placa sobre dos medios sólidos
selectivos:

– Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti (véase las referencias [16] y [17] de la bibliografía, y
el capítulo B.3);

– cualquier otro método sólido selectivo escogido por el laboratorio, complementario al Agar de
Listeria conforme a Ottaviani y Agosti, que utilice un sustrato y/o un principio diferente del
utilizado en el Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti (véase el capítulo B.4). Véase el anexo
E para más información sobre los medios.

Incubación en el Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti a 37 °C durante un tiempo total de

48 h. Si se evidencia la presencia de supuestas colonias de L. monocytogenes o Listeria spp. a las 24 h
de incubación, se puede detener la incubación en este momento. Incubación del segundo medio
selectivo a la temperatura adecuada y examen tras el tiempo apropiado.

4.5 Confirmación
Sub-cultivo de las colonias identificadas como supuestas colonias de L. monocytogenes o Listeria spp.
Sembradas en placa según se indicó en el apartado 4.4 y confirmación por medio de análisis
morfológicos y/o bioquímicos adecuados.

5 Reactivos y medios de cultivo

Consúltense en la Norma ISO 11133 las prácticas de laboratorio actualizadas.

La composición y el análisis de funcionamiento de los reactivos y los medios de cultivo, así como su
preparación, se describen en el anexo B.

6 Equipamiento y material fungible

El equipamiento habitual para microbiología (según se describe en la Norma ISO 7218) y, en parti-
cular, lo siguiente.

6.1 Aparato para la esterilización en seco (horno) o la esterilización en húmedo (autoclave).

Según se especifica en la Norma ISO 7218.

6.2 Cabina de secado o incubador, capaz de mantener una temperatura comprendida entre 25 °C
y 50 °C.

6.3 Incubadores, capaces de mantener una temperatura de 30 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C y 25 °C ± 1 °C

(opcional).

6.4 Baño de agua, capaz de mantener una temperatura de 47 °C a 50 °C.

6.5 Asas de siembra estériles, de un diámetro aproximado de 3 mm o de 10 l, así como

alambres o agujas de inoculación.

6.6 pH-metro, capaz de proporcionar lecturas con una aproximación de 0,01 unidades a 25 °C y
que permita realizar las mediciones con una exactitud de ± 0,1 unidades de pH.

6.7 Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de capacidades nominales de 1 ml y de 10 ml.

6.8 Placas Petri, por ejemplo de 90 mm de diámetro.

6.9 Microscopio, preferiblemente equipado con contraste de fases, junto con portaobjetos y
cubreobjetos.

6.10 Nevera, capaz de mantener una temperatura de 5 °C ± 3 °C.

7 Toma de muestras
La toma de muestras no es parte del método descrito en este documento. Si no existe una norma
internacional específica relacionada con la toma de muestras del producto estudiado, se recomienda
que las partes interesadas alcancen un acuerdo sobre este punto. Para productos alimenticios
destinados al consumo humano y animal, remítase a la Especificación Técnica ISO/TS 17728[3]. Para
muestras ambientales, se utiliza la Norma ISO 18593[2]; véase la referencia [24] de la bibliografía.

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y que no
haya sufrido daño o transformación durante el transporte o el almacenamiento (véase la Norma
ISO 7218).

8 Preparación de la muestra para análisis

La muestra de análisis se prepara de acuerdo con la norma internacional específica referida al
producto correspondiente [véase la Norma ISO 6887 (todas sus partes) y la Norma ISO 18593[2]]. Si no
existe una norma internacional específica, se recomienda que las partes interesadas alcancen un
acuerdo sobre este punto.

9 Procedimiento

9.1 Porción para análisis y suspensión inicial

Consúltese la Norma ISO 6887 (todas sus partes) así como cualquier otra norma internacional
específica adecuada para el producto estudiado.

Se utiliza el medio selectivo de enriquecimiento primario descrito en el capítulo B.1 (medio semi-
Fraser) como diluyente para la preparación de la suspensión inicial.

De forma general, para preparar la suspensión inicial se añade una cantidad de porción para análisis
de 25 g o 25 ml sobre 225 g o 225 ml del medio selectivo de enriquecimiento primario (B.1), lo cual
supone una dilución decimal, y se homogeniza. El medio selectivo de enriquecimiento primario se pre-
calienta a temperatura ambiente antes de su uso.

Este documento se ha validado para porciones para análisis de 25 g o ml. Puede utilizarse una porción
para análisis de tamaño inferior sin necesidad de una validación/verificación adicional, siempre que se
mantenga la misma proporción entre el medio de enriquecimiento primario y la porción para análisis.
Puede utilizarse una porción para análisis mayor que la validada inicialmente siempre que un estudio
de validación/verificación haya demostrado que no se producen efectos negativos sobre la detección
de L. monocytogenes o de Listeria spp.

NOTA 1 La validación se puede realizar siguiendo los documentos adecuados de la Norma ISO 16140 (todas sus partes)[1]. La
verificación de muestras combinadas se puede realizar siguiendo el protocolo descrito en el anexo D de la Norma
ISO 6887-1:2017 (protocolo de verificación para muestras combinadas en análisis cualitativos). Véase las referen-
cias [21] y [22] de la bibliografía, ya que proporcionan información en el caso particular de muestras combinadas de
Listeria.

NOTA 2 Si se utilizan cantidades superiores, se recomienda pre-calentar el medio selectivo de enriquecimiento primario a
una temperatura de 30 °C ± 1 °C antes de mezclarlo con la porción Para análisis.

9.2 Enriquecimiento primario

Se incuba el medio de enriquecimiento primario (medio de semi-Fraser, véase el capítulo B.1)
preparado conforme al apartado 9.1 durante 25 h ± 1 h a 30 °C (6.3).

NOTA 1 Durante la incubación se puede desarrollar una coloración negra.

NOTA 2 La muestra pre-enriquecida se puede conservar tras su incubación durante un tiempo máximo de 72 h a una
temperatura de 5 °C (6.10) antes de su transferencia al medio de Fraser.

(Véase la referencia [20] de la bibliografía).

9.3 Enriquecimiento secundario

9.3.1 Tras la incubación de la suspensión inicial (enriquecimiento primario) durante 25 h ± 1 h

(9.2), se transfieren 0,1 ml del cultivo obtenido en el apartado 9.2 (independientemente de su color) a
un tubo o una botella que contenga 10 ml del medio de enriquecimiento secundario (medio de Fraser)
(B.2).

9.3.2 Se incuba el medio inoculado (9.3.1) durante 24 h ± 2 h a 37 °C (6.3).

NOTA En el caso de la detección de Listeria spp. diferentes de Listeria monocytogenes, la incubación durante un período
adicional de 24 h puede permitir la recuperación de un número mayor de especies.

9.4 Siembra en placa identificación

9.4.1 Generalidades

[Link] Utilizando el cultivo de enriquecimiento primario (9.2) incubado durante 25 h ± 1 h a 30 °C

(6.3), se inocula con un asa de siembra (6.5) la superficie del primer medio selectivo en placa, Agar de
Listeria conforme a Ottaviani y Agosti (B.3), de forma que se obtengan colonias bien separadas.

Se procede de la misma manera con el segundo medio selectivo en placa de elección (B.4).

NOTA El medio de Fraser y el medio de semi-Fraser se pueden conservar refrigerados a 5 °C (6.10) antes del aislamiento en
el medio de agar selectivo durante un tiempo máximo de 72 h [20].

[Link] Utilizando el medio de enriquecimiento secundario incubado durante 24 h ± 2 h a 37 °C

(6.3) (9.3.2), se repite el procedimiento descrito en el apartado [Link] con los dos medios selectivos en
placa.

[Link] Las placas Petri preparadas en los apartados [Link] y [Link] se colocan en posición
invertida y se llevan a un incubador mantenido a una temperatura de 37 °C (6.3) en el caso del Agar de
Listeria conforme a Ottaviani y Agosti (B.3). En el caso del segundo medio selectivo (B.4), se siguen las
instrucciones del fabricante.

[Link] En el caso del Agar de Listeria, conforme a Ottaviani y Agosti, se incuba durante un tiempo
total de 48 h ± 2 h. Si se observa la aparición de supuestas colonias de L. monocytogenes o de Listeria
spp. evidentes a 24 h ± 2 h, la incubación se puede detener en este momento. En el caso del segundo
medio de agar selectivo, se incuba durante el tiempo apropiado. Se examina en las placas ([Link]) la
presencia de supuestas colonias de L. monocytogenes o de Listeria spp.

NOTA Tras la incubación, las placas se pueden conservar refrigeradas a 5 °C (6.10) durante un tiempo máximo de 48 h antes
de su lectura.

9.4.2 Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti

Se consideran supuestas colonias de L. monocytogenes a las colonias de color verde azulado rodeadas
por un halo opaco (colonias típicas). Las colonias de L. ivanovii también son de color verde azulado
rodeadas por un halo opaco.

Se consideran supuestas colonias de Listeria spp. a las colonias de color verde azulado con o sin halo
opaco.
NOTA 1 Algunas cepas de L. monocytogenes sometidas a condiciones de estrés, en especial a estrés ácido, pueden mostrar un
halo extremadamente débil (o incluso ausencia de halo).

NOTA 2 Algunas L. monocytogenes poco frecuentes se caracterizan por una actividad PIPLC (fosfolipasa C de fosfatidil
inositol; phosphatidyl inositol phospholipase C) lenta. Dichas bacterias se detectan cuando la duración total de la
incubación es superior a, por ejemplo, cuatro días. Algunas de esas cepas podrían ser patogénicas [13]. No se han
descrito cepas de L. monocytogenes negativas para PIPLC.

NOTA 3 Algunos organismos diferentes de Listeria spp. pueden producir colonias de color azul en este medio. Véase el
anexo C y la referencia [23] de la bibliografía.

9.4.3 Segundo medio selectivo

Tras el tiempo de incubación adecuado, se examina en las placas la presencia de colonias que puedan
considerarse supuestas colonias de Listeria spp. L. monocytogenes, en base a sus características en el
tipo de medio utilizado (B.4) Véase el anexo E para más información.

9.5 Confirmación de Listeria monocytogenes o Listeria spp.

9.5.1 Selección de colonias para su confirmación

[Link] Para la confirmación de las supuestas colonias de L. monocytogenes, se recoge como mínimo
una colonia considerada como supuesta de L. monocytogenes (véanse 9.4.2 y 9.4.3). Es suficiente un
aislado confirmado por muestra. Si la primera colonia resulta negativa, se recogen del medio selectivo
colonias adicionales consideradas supuestas de L. monocytogenes (hasta un máximo de cinco colonias
de cada placa de cada medio selectivo).

Las colonias escogidas se siembran en estrías sobre la superficie de placas de medio de agar no
selectivo previamente secadas, por ejemplo de agar de sangre, de agar nutritivo, de agar de extracto de
levadura con soja y triptona (TSYEA; tryptone soya yeast agar) (B.14) en condiciones que vayan a
permitir el desarrollo de colonias bien aisladas.

El uso de agar de sangre con cultivos puros permite la interpretación de la hemolisis, cuando se
produce, ya en esta fase (véase [Link].2 y el anexo D). Si la siembra en el agar de sangre no muestra
hemolisis, el análisis de hemolisis se debe realizar por inoculación puntual ([Link].2) o en un medio
líquido ([Link].3).

Las placas se llevan a un incubador mantenido a 37 °C (6.3) durante un tiempo de 18 h a 24 h o hasta

que hayan alcanzado un crecimiento satisfactorio.

Si las colonias no han quedado bien aisladas, se escoge una colonia típica de L. monocytogenes y se
siembra en otra placa de agar no selectivo. Se realizan los siguientes análisis (9.5.2) sobre las colonias
de cultivos puros crecidas en medio de agar no selectivo.

[Link] Para la confirmación de las supuestas colonias de Listeria spp., se recoge como mínimo una
colonia considerada supuesta de Listeria. spp. (véanse 9.4.2 y 9.4.3). Es suficiente un aislado
confirmado por muestra. Si la primera colonia resulta negativa, se recogen del medio selectivo colonias
adicionales consideradas como supuestas de Listeria spp. (hasta un máximo de cinco colonias de cada
placa de cada medio selectivo).

Se utilizan placas de TSYEA para la confirmación de Listeria spp.

Las colonias escogidas se siembran en estrías sobre la superficie de placas de TSYEA previamente
secadas (B.14) en condiciones que permitan el desarrollo de colonias bien aisladas.

Las placas se llevan a un incubador mantenido a 37 °C (6.3) durante un tiempo de 18 h a 24 h o hasta

que hayan alcanzado un crecimiento satisfactorio.

Las colonias típicas de Listeria spp. en TSYEA presentan un diámetro de 1 mm a 2 mm, son convexas,
incoloras y opacas con el borde completo. Cuando las placas se observan a la luz (natural o artificial)
bajo un ángulo de unos 45°, las colonias exhiben un color gris azulado y una superficie granulada.

Si las colonias no han quedado bien aisladas, se escoge una colonia típica de Listeria spp. y se siembra
en otra placa de medio de agar no selectivo.

Se realizan los siguientes análisis (9.5.3) sobre las colonias típicas procedentes de un cultivo puro
crecido en TSYEA.

9.5.2 Confirmación de L. monocytogenes

[Link] Generalidades
Se realizan los análisis de confirmación para L. monocytogenes. Deben utilizarse cepas de control
positivas y negativas adecuadas para cada uno de los análisis de confirmación.

Como mínimo, se realizan los análisis obligatorios relacionados en la tabla 1 (en negrita).

Tabla 1 – Análisis de confirmación para L. monocytogenes

Análisis de confirmación para L.

Análisis Resultados
monocytogenes
Obligatorios Aspecto microscópicoa ([Link]) Cocobacilos o en forma de bastoncillo corto y delgado
Beta-hemolisis ([Link]) +
L-Ramnosa ([Link]) +
D-Xilosa ([Link]) –
Opcionales Catalasa ([Link]) +
Movilidad a 25 °C ([Link]) +
Análisis de CAMP ([Link]) +
a El aspecto microscópico es opcional para el Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti y también para el segundo
medio si permite la distinción entre Listeria spp. patogénicas y no patogénicas.

En el anexo D se pueden consultar los detalles de los resultados de los análisis de confirmación.

NOTA Puede utilizarse un procedimiento alternativo al mencionado en la Norma ISO 7218 para confirmar si un aislado es de
Listeria monocytogenes siempre que se verifique que el procedimiento mencionado resulta adecuado.

Pueden utilizarse galerías miniaturizadas para la identificación bioquímica de Listeria monocytogenes

(véase la Norma ISO 7218) siempre que se demuestre su fiabilidad.

Algunas cepas poco frecuentes de L. monocytogenes no muestran beta-hemolisis ni una reacción

positiva en el análisis de CAMP bajo las condiciones descritas en este documento. Si las colonias típicas
en Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti con actividad PIPLC, incluso si ésta es baja, son
negativas para la hemolisis, se recomienda realizar análisis adicionales (por ejemplo, tinción de Gram,
catalasa, movilidad, análisis de CAMP, PCR) para determinar si dicho aislado corresponde a L.
monocytogenes no hemolítica.

[Link] Reacción de catalasa (opcional)

Se recoge una colonia aislada obtenida en el apartado [Link] y se resuspende en una gota de
disolución de peróxido de hidrógeno (B.6) dispuesta sobre un portaobjetos. La formación inmediata de
burbujas de gas indica que la reacción es positiva.

NOTA En ocasiones, una reacción de catalasa realizada sobre una colonia procedente de medio de agar de sangre puede
ocasionar un resultado falso positivo.

[Link] Análisis de movilidad (opcional)

Se recoge una colonia aislada obtenida en el apartado [Link] y se resuspende en un tubo con un medio
líquido nutritivo no selectivo.

Se incuba en el incubador (6.3) mantenido a 25 °C durante un tiempo de 8 h a 24 h hasta que el medio

adquiera una apariencia turbia.

Se recoge una gota del cultivo anterior utilizando un asa de siembra (6.5) y se deposita sobre un
portaobjetos de vidrio limpio de un microscopio. Se coloca un cubreobjetos encima y se examina en un
microscopio (6.9).

Listeria spp. (incluida L. monocytogenes) tienen una apariencia de bastoncillos cortos delgados con
movimiento de tipo voltereta.

Los cultivos crecidos a temperaturas superiores a 25 °C pueden no mostrar este movimiento. Siempre
se comparan con un cultivo de Listeria conocido. Los cocos, los bacilos de gran tamaño o las bacterias
en forma de bastoncillo con movilidad natatoria rápida no corresponden a Listeria spp.

Como análisis alternativo de movilidad, se diluye un fragmento de una colonia asilada obtenida en agar
no selectivo en agua estéril (u otro diluyente adecuado) utilizando una aguja de inoculación (6.5).
Listeria spp. (incluida L. monocytogenes) tienen una apariencia de bastoncillos cortos delgados con
movimiento de tipo voltereta.

Como análisis adicional alternativo de movilidad, se inocula el agar de movilidad (B.7) con un cultivo
procedente de una colonia típica obtenida en el apartado 9.5.11 utilizando una aguja de inoculación
(6.5). Se incuba a 25 °C durante 48 h ± 2 h.

Se examina el crecimiento alrededor del punto de inoculación. Listeria spp. son móviles, lo cual propor-
ciona un aspecto típico de crecimiento en forma de paraguas. Si no ha habido un crecimiento suficiente,
se incuba durante un período adicional de cinco días y se vuelve a observar el punto de inoculación.

NOTA Se han aislado recientemente algunas especies nuevas de Listeria[5],[10],[12],[14],[25],[26],[27]. La mayor parte de ellas no
presentan movimiento en el agar de movilidad.

[Link] Aspecto microscópico (opcional en el caso de usar agar específico para Listeria spp.
patogénicas)
Se realiza una preparación microscópica (por ejemplo, una tinción de Gram, microscopía en húmedo)
sobre una colonia bien aislada procedente del apartado [Link]. Listeria spp. (incluida L. monocyto-
genes) aparecen como bacterias positivas para la tinción de Gram (si se realiza esta tinción), con forma
de bastoncillos cortos y delgados o de cocobacilos con movimiento de tipo voltereta cuando proceden
de un cultivo reciente.

Consúltese la Norma ISO 7218 sobre la preparación microscópica para la tinción de Gram.

[Link] Análisis de hemolisis

[Link].1 Generalidades
Se escoge uno de los análisis de hemolisis ([Link].2 o [Link].3).

NOTA Existen cepas poco frecuentes de L. monocytogenes que no muestran b-hemolisis ni reacción positiva en el análisis de
CAMP bajo las condiciones descritas en este documento.

[Link].2 Hemolisis en agar de sangre

Si las características morfológicas y fisiológicas son indicativas de Listeria spp., se inoculan placas de
agar de sangre (B.8) para determinar la reacción de hemolisis.

Se seca bien la superficie del agar antes de su uso. Se recoge una colonia aislada procedente del
apartado [Link] utilizando un alambre de siembra (6.5) y se inocula con él en una sección del agar. Se
repite este proceso con todos los cultivos. En la misma placa, si es posible, se inoculan cultivos de
control positivos (L. monocytogenes) y negativos (L. innocua). Por ejemplo, pueden utilizarse L.
monocytogenes 4b WDCM 00021 o L. monocytogenes 1/2a WDCM 00109 y L. innocua WDCM 00017.

Tras una incubación a 37 °C (6.3) durante 24 h ± 2 h, se examinan las cepas de análisis y los controles.
L. monocytogenes muestra zonas estrechas claras y limpias de hemolisis; L. innocua no muestra
ninguna zona clara alrededor del punto de inoculación. L. seeligeri muestra habitualmente una zona de
hemolisis débil. L. ivanovii suele mostrar principalmente zonas anchas de hemolisis. claramente
delimitadas. Las placas se examinan bajo una luz intensa para comparar los cultivos de análisis con los
controles.

NOTA 1 La reacción de hemolisis se observa con mayor facilidad retirando todo tipo de colonias crecidas en la superficie del
agar alrededor de la posición de la inoculación.

NOTA 2 El análisis de hemolisis se puede realizar inoculando la placa de agar de sangre utilizada para el análisis de CAMP.

[Link].3 Reacción de hemolisis utilizando corpúsculos de eritrocitos

La reacción de hemolisis también se puede realizar utilizando corpúsculos de eritrocitos de la
siguiente manera.

Se dispersa una colonia en 150 l de un medio nutritivo líquido no selectivo y se incuba a 37 °C (6.3)
durante 2 h. Se añaden 150 l de una suspensión de corpúsculos de eritrocitos (B.10). Se incuba a
37 °C (6.3) durante un tiempo de 15 min a 60 min y a continuación se enfría hasta 5 °C (6.10) durante
un tiempo aproximado de 2 h. Se examina la actividad hemolítica. Si la reacción resulta dudosa se deja
a 5 °C (6.10) durante un tiempo de hasta 24 h ± 2 h. La sedimentación de los corpúsculos de eritrocitos
(formación de un punto de color rojo en el fondo de los tubos) indica que la reacción es negativa.

Se incluyen controles positivos y negativos. Véase el apartado [Link].2 para las cepas de control.

[Link] Análisis de CAMP (opcional)

Si el resultado del análisis de hemolisis resulta difícil de interpretar se recomienda realizar el análisis
de CAMP para demostrar con claridad que la hemolisis se debe a la actividad listeriolisina.

Para realizar el análisis de CAMP se requiere del uso de una cepa -hemolítica de Staphylococcus
aureus (por ejemplo, WDCM 00034) y una cepa de Rhodococcus equi (por ejemplo, WDCM 0028). No
todas las cepas de S. aureus resultan adecuadas para el análisis de CAMP. Se siembra cada uno de los
cultivos de S. aureus y R. equi en forma de una sola línea a lo largo de toda la placa de agar de sangre
(B.8.3 o B.11.4) de forma que los dos cultivos queden en posiciones paralelas y diametralmente
opuestas (véase la figura 1). Se requiere que el inóculo resulte delgado y homogéneo, lo cual se puede
conseguir utilizando un asa o un alambre de inoculación (6.5) mantenidos en ángulo recto respecto al
agar.

Se siembra una colonia bien aislada de la cepa en estudio ([Link]) de manera semejante en ángulo
recto respeto a los cultivos anteriores, de forma que los cultivos de análisis y los cultivos de S. aureus y
R. equi no lleguen a tocarse, pero se acerquen a una distancia de 1 mm a 2 mm en la zona más próxima.
Pueden sembrarse varias cepas de análisis en la misma placa.

Leyenda
1 Banda estrecha de -hemolisis
2 Ausencia de hemolisis
3 Banda ancha de -hemolisis
4 L. monocytogenes
5 L. innocua
6 L. ivanovii

Figura 1 – Inoculación e interpretación de las placas de análisis de CAMP

Las líneas verticales de la figura 1 representan las estrías sembradas de S. aureus (S) y R. equi (R). Las
líneas horizontales representan las estrías sembradas de los cultivos de análisis. Las áreas sombreadas
indican las zonas de hemolisis reforzada. El área de puntos indica la zona de influencia del cultivo de S.
aureus.

De forma simultánea, se siembran cultivos de control de L. monocytogenes, L. innocua y L. ivanovii. Por

ejemplo, pueden utilizarse L. monocytogenes 4b WDCM 00021, L. monocytogenes 1/2a WDCM 00109, L.
innocua WDCM 00017 y L. ivanovii WDCM 00018. Los cultivos de partida se conservan según se indica
en la Norma ISO 11133.

Si se utiliza agar de sangre (B.8.3), las placas se incuban a 37 °C durante un tiempo de 18 h a 24 h. Si se

utilizan placas de doble capa (B.11.4), se incuba a 37 °C durante un tiempo de 12 h a 18 h.

Una reacción positiva con R. equi se manifiesta como una zona de hemolisis ancha (de 5 mm a 10 mm)
en forma de “punta de flecha”. La reacción se considera negativa si aparece una pequeña zona de
hemolisis leve que se extiende solamente a lo largo de una distancia de 1 mm en la intersección entre
la cepa de análisis y la zona de difusión del cultivo de R. equi.

Una reacción positiva con S. aureus se manifiesta como una zona pequeña de hemolisis reforzada que
se extiende solamente unos 2 mm desde la cepa de análisis y dentro de la zona de hemolisis leve
debida al crecimiento del cultivo de S. aureus. No se producen zonas de hemolisis de gran tamaño en el
área de S. aureus y L. monocytogenes.

[Link] Utilización de hidratos de carbono

Utilizando un asa de siembra (6.5), se inoculan todos los medios de utilización de hidratos de carbono
(B.12) con los cultivos obtenidos en el medio de agar no selectivo ([Link]). Se incuba a 37 °C. Las
reacciones positivas (generación de ácido) se manifiestan por la aparición de un color amarillo y se
producen fundamentalmente en un tiempo de 24 h a 48 h para tubos de microvolúmenes y de hasta
cinco días para los tubos de macrovolúmenes. Se utilizan L-ramnosa y D-xilosa para la confirmación de
L. monocytogenes, que es positiva para L-ramnosa y negativa para D-xilosa (véase el anexo D).

NOTA Existen cepas poco frecuentes de L. monocytogenes que no fermentan L-ramnosa [15],[18].

Las reacciones son más rápidas trabajando con microvolúmenes. El nivel de inoculación en relación al
volumen total es un factor importante. Es importante verificar en cada protocolo escogido el tiempo
necesario para alcanzar la coloración amarilla. Se recomienda utilizar controles. Por ejemplo, pueden
utilizarse L. monocytogenes 4b WDCM 00021, L. innocua WDCM 00017 y L. ivanovii WDCM 00018. Los
cultivos de partida se conservan según se indica en la Norma ISO 11133.

9.5.3 Confirmación de Listeria spp.

[Link] Generalidades
Los análisis de confirmación de Listeria spp. se realizan a partir de una colonia típica ([Link]). Deben
utilizarse cepas de control positivas y negativas adecuadas para cada uno de los análisis de
confirmación.

Como mínimo, se realizan los análisis obligatorios relacionados en la tabla 2 (en negrita).

Véase el anexo D en relación a análisis adicionales si se necesitan identificar las especies de Listeria.

Tabla 2 – Análisis de confirmación para Listeria spp.

Análisis Listeria spp. Resultados

Obligatorios Aspecto microscópico ([Link]) Cocobacilos o en forma de bastoncillos cortos y delgados
Catalasa ([Link]) –
Opcionales Análisis VP ([Link]) +
Movilidad a 25 °C ([Link]) +

NOTA 1 Puede utilizarse un procedimiento alternativo al mencionado en la Norma ISO 7218 para confirmar si un aislado es
de Listeria spp. siempre que se verifique que el procedimiento mencionado resulta adecuado.

NOTA 2 Es posible que algunas especies de Listeria que se han aislado recientemente puedan no corresponder a este esque-
ma, en especial en relación a la movilidad, el análisis VP y al crecimiento a 37 °C (véase, por ejemplo, las referencias
[4], [10], [25], [26] y [27] de la bibliografía).

[Link] Reacción de la catalasa

Se recoge una colonia aislada procedente del apartado [Link] y se realiza el análisis según se describe
en el apartado [Link].

[Link] Análisis de movilidad (opcional)

Se recoge una colonia aislada procedente del apartado [Link] y se realiza el análisis según se describe
en el apartado [Link].

[Link] Aspecto microscópico

Se recoge una colonia aislada procedente del apartado [Link] y se realiza el análisis según se describe
en el apartado [Link].

[Link] Reacción de Voges – Proskauer (VP) (opcional)

Se inocula un tubo que contenga 3 ml de medio VP (B.13.1) utilizando un asa de siembra (6.5). Se
incuba a 37 °C durante 24 h ± 2 h. Tras la incubación, se añaden 0,6 ml de disolución de -naftol al 5%
(B.13.2) y 0,2 ml de disolución de hidróxido potásico al 40% (B.13.3). Se agita bien y se inclina el tubo
(para incrementar el área de contacto aire-líquido). Se examina después de un tiempo de 15 min y de
1 h. La aparición de un color rojo intenso indica que la reacción es positiva. Listeria spp. son positivas
para VP.

NOTA Se han aislado recientemente algunas especies nuevas de Listeria[5],[10],[12],[14],[25],[26],[27]. La mayor parte de ellas son
negativas para VP.

9.6 Interpretación de las propiedades morfológicas y fisiológicas y de las reacciones

bioquímicas
Todas las Listeria spp. son cocobacilos o bacterias de tamaño pequeño, con forma de bastoncillo,
positivas para la tinción de Gram, que muestran una reacción positiva en el análisis de catalasa.

L. monocytogenes se confirma en base a los análisis relacionados en la tabla 1 y Listeria spp. se

confirma en base a los análisis relacionados en la tabla 2.

9.7 Caracterización adicional de las cepas aisladas (opcional)

Los aislados considerados como L. monocytogenes (9.6) se pueden enviar para su caracterización
adicional a un Laboratorio de Referencia en Listeria nacional o regional reconocido o (en caso de no
tener acceso) a los Centros Colaboradores de la Organización Mundial de la Salud para Listeria. El
envío debe ir acompañado por toda la información posible relacionada con la(s) cepa(s).

Véase el anexo D en relación a los análisis adicionales si se necesitan identificar las especies de Listeria.

10 Expresión de los resultados

De acuerdo con la interpretación de los resultados (véase 9.6), se indica si se ha detectado o no se ha
detectado L. monocytogenes y/o si se ha detectado o no se ha detectado Listeria spp. en la porción para
análisis, especificando la masa en gramos o el volumen en mililitros de la muestra analizada, la
superficie en centímetros cuadrados o por unidad de muestra.

11 Características de funcionamiento del método

11.1 Estudios de validación del método

Las características de funcionamiento del método se determinaron en estudios interlaboratorios
realizados para determinar la especificidad, la sensibilidad y, cuando ha sido posible, el nivel de
detección (LOD50) del método. Los datos se resumen en el anexo E. Los valores procedentes de los
estudios interlaboratorios pueden no resultar aplicables para tipos de alimentos distintos de los
indicados en el anexo E.

11.2 Sensibilidad
La sensibilidad se define como el número de muestras que se han identificado como positivas dividido
entre el número de muestras analizadas para un determinado nivel de contaminación. Por
consiguiente, los resultados dependen del nivel de contaminación de la muestra.

11.3 Especificidad
La especificidad se define como el número de muestras que se han identificado como negativas
dividido entre el número de muestras en blanco analizadas.

11.4 Nivel de detección (LOD50)

El nivel de detección al 50% (LOD50) corresponde a la concentración (cfu/porción para análisis) para
la cual la probabilidad de detección es del 50%.

12 Informe del análisis

El informe del análisis debe especificar el método utilizado y los resultados obtenidos. También debe
mencionar todos los detalles experimentales no descritos en este documento, o considerados
opcionales, junto con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber influido sobre los
resultados (véase el capítulo 10).

El informe del análisis debe incluir toda la información necesaria para la identificación completa de la
muestra.

13 Garantía de la calidad
El laboratorio debería poseer un sistema de control de la calidad bien definido, para asegurar que las
técnicas, los reactivos y los aparatos son adecuados para el análisis. El uso de controles positivos,
controles negativos y de muestras en blanco forman parte del análisis. El análisis del funcionamiento
de los medios de cultivo está detallado en el capítulo B.5 y se describe en la Norma ISO 11133.

Anexo A (Normativo)

Diagrama del procedimiento

Figura A.1 – Diagrama del procedimiento

Anexo B (Normativo)

Composición y preparación de los reactivos y medios de cultivo

B.1 Medio selectivo de enriquecimiento primario: medio de semi-Fraser

B.1.1 Medio basal

B.1.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejidos animales 5,0 g

Digerido enzimático de caseína 5,0 g
Extracto de carne 5,0 g
Extracto de levadura 5,0 g
Cloruro sódico 20,0 g
Hidrógeno fosfato disódico dihidratado 12,0 g
Dihidrógeno fosfato potásico 1,35 g
Esculina 1,0 g
Agua 1 000 ml

B.1.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes básicos o el medio basal completo deshidratado en el agua, calentando
en caso necesario.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 7,2 ± 0,2 a 25 °C.

El medio básico se dispensa en matraces de capacidad adecuada para disponer de las porciones del
tamaño adecuado para el análisis (véase 9.1).

Se esteriliza en el autoclave (6.1) a 121 °C durante 15 min.

La disolución de cloruro de litio (B.1.2) y la disolución de ácido nalidíxico (B.1.3) se pueden añadir al
medio basal (B.1.1) antes de autoclavar.

B.1.2 Disolución de cloruro de litio

B.1.2.1 Composición

Cloruro de litio 3g
Agua 10 ml

B.1.2.2 Preparación
Se añade el cloruro de litio sobre el agua.

Se esteriliza por filtración a través de una membrana de 0,45 m.

AVISO – Se toman todas las precauciones necesarias al disolver el cloruro de litio en el agua
dado que es una reacción fuertemente exotérmica. Además, esta disolución es irritante para las
membranas mucosas.

B.1.3 Disolución de la sal sódica del ácido nalidíxico

B.1.3.1 Composición

Sal sódica del ácido nalidíxico 0,1 g

Hidróxido sódico, disolución a 0,05 mol/l 10 ml

B.1.3.2 Preparación

Se disuelve la sal del ácido nalidíxico en la disolución de hidróxido sódico.

Se esteriliza por filtración a través de una membrana de 0,45 m.

B.1.4 Disolución de hidrocloruro de acriflavina

B.1.4.1 Composición

Hidrocloruro de acriflavina 0,25 g

Agua 100 ml

B.1.4.2 Preparación

Se disuelve el hidrocloruro de acriflavina en el agua.

Se esteriliza por filtración a través de una membrana de 0,45 m.

B.1.5 Disolución de citrato de amonio y hierro (III)

B.1.5.1 Composición

Citrato de amonio y hierro (III) 5,0 g

Agua 100 ml

B.1.5.2 Preparación

Se disuelve el citrato de amonio y hierro (III) en el agua.

Se esteriliza por filtración a través de una membrana de 0,45 m.

B.1.6 Medio completo

B.1.6.1 Composición

Medio basal (B.1.1) 100 ml

Disolución de cloruro de litio (B.1.2) 1,0 ml
Disolución de la sal sódica del ácido nalidíxico (B.1.3) 0,1 ml
Disolución de hidrocloruro de acriflavina (B.1.4) 0,5 ml
Disolución de citrato de amonio y hierro (III) (B.1.5) 1,0 ml

B.1.6.2 Preparación

Inmediatamente antes de su uso, se añaden las cuatro disoluciones (B.1.2 a B.1.5) a porciones de
100 ml del medio basal (B.1.1).

B.2 Medio selectivo de enriquecimiento secundario: medio de Fraser

B.2.1 Medio basal

B.2.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejidos animales 5,0 g

B.2.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando en caso
necesario.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 7,2 ± 0,2 a 25 °C.

El medio se dispensa en tubos de análisis de capacidad adecuada para disponer de las porciones del
tamaño adecuado para el análisis.

Se esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 min.

B.2.2 Disolución de hidrocloruro de acriflavina

Véase el apartado B.1.4.

B.2.3 Disolución de citrato de amonio y hierro (III)

Véase el apartado B.1.5.

B.2.4 Medio completo

Inmediatamente antes de su uso, se añaden a cada tubo de medio basal (B.2.1) (10 ml de volumen)
porciones de 0,1 ml de las disoluciones B.2.2 y B.2.3. Se mezcla suavemente.

B.3 Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti [16],[17]

B.3.1 Medio basal

B.3.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejidos animales 18 g

Digerido enzimático de caseína 6g
Extracto de levadura 10 g
Piruvato sódico 2g
Glucosa 2g
Glicerofosfato de magnesio 1g
Sulfato de magnesio (anhidro) 0,5 g
Cloruro sódico 5g
Cloruro de litio 10 g
Hidrógeno fosfato disódico (anhidro) 2,5 g

5-Bromo-4-cloro-3-indolil--D-glucopiranósido 0,05 g

Agar de 12 g a 18 g a
Agua 930 ml b
a En función de la capacidad gelificante del agar.
b 925 ml si se utiliza la disolución de anfotericina B (véase B.3.5.2).

B.3.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes deshidratados o el medio basal completo deshidratado en el agua a
ebullición.

Se esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 min.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 7,2 ± 0,2 unidades.

B.3.2 Disolución de ácido nalidíxico

Sal sódica del ácido nalidíxico 0,02 g

Hidróxido sódico (0,05 mol/l) 5 ml

Se disuelve la sal sódica del ácido nalidíxico en 5 ml de la disolución de hidróxido sódico y se esteriliza
por filtración a través de una membrana de 0,45 m.

B.3.3 Disolución de ceftazidima

Ceftazidima 0,02 g
Agua 5 ml

Se disuelve la ceftazidima en 5 ml de agua y se esteriliza por filtración a través de una membrana de

0,45 m.

B.3.4 Disolución de polimixina B

Sulfato de polimixina B 76 700 UI

Agua 5 ml

Se disuelve la polimixina B en 5 ml de agua. Se esteriliza por filtración a través de una membrana de

0,45 m.

B.3.5 Suplemento de antibióticos

B.3.5.1 Disolución de cicloheximida

Cicloheximida 0,05 g
Etanol 2,5 ml
Agua 2,5 ml

Se disuelve la cicloheximida en 2,5 ml de etanol y a continuación se añaden 2,5 ml de agua. Se esteriliza

por filtración a través de una membrana de 0,45 m.

B.3.5.2 Disolución de anfotericina B (como alternativa a la disolución de cicloheximida).

Anfotericina B 0,01 g
HCl (1 mol/l) 2,5 ml
Dimetilformamida (DMF) 7,5 ml

Se disuelve la anfotericina en la disolución de HCl/DMF. Se esteriliza por filtración a través de una

membrana de 0,45 m. Pueden utilizarse otras técnicas de disolución (por ejemplo, en agua o en
medio basal en caliente) de acuerdo con los proveedores de los medios.

AVISO – La disolución de HCl/DMF es tóxica; se manipula con precaución.

B.3.6 Aditivos

Se disuelven 2 g de L--fosfatidilinositol1) en 50 ml de agua.

Pueden utilizarse 2 g de lecitina de soja que contenga como mínimo entre un 9% a un 15% de
fosfatidilinositol sin fraccionar en lugar del L--fosfatidilinositol[6],[9],[19].

Se agita aproximadamente durante 30 min hasta obtener una suspensión homogénea. Se autoclava a
121 °C durante 15 min y se enfría hasta una temperatura de 47 °C a 50 °C.

B.3.7 Medio completo

B.3.7.1 Composición

Medio basal (B.3.1) 930 ml a

Disolución de ácido nalidíxico (B.3.2) 5 ml

Disolución de ceftazidima (B.3.3) 5 ml

Disolución de polimixina B (B.3.4) 5 ml

Disolución de cicloheximida (B.3.5.1) 5 ml

o disolución de anfotericina B (B.3.5.2) 10 ml

Aditivos (B.3.6) 50 ml
a 925 ml si se utiliza la disolución de anfotericina B.

B.3.7.2 Preparación
Se añaden las disoluciones sobre el medio basal fundido a una temperatura de 47 °C a 50 °C (6.4),
mezclando extensivamente después de cada adición.

1) P6636®, suministrado por Sigma, es un ejemplo de un producto comercial adecuado disponible. Se ofrece esta informa-
ción por su utilidad para los usuarios de este documento sin que ello constituya una recomendación por parte de ISO
hacia dicho producto.

El pH del medio completo debe ser de 7,2 ± 0,2 unidades a 25 °C.

El medio debe ser ligeramente opalescente de forma homogénea.

B.3.7.3 Preparación de las placas de agar

Se dispensan en cada placa Petri de 18 ml a 20 ml del medio completo recién preparado y a
continuación se deja solidificar.

B.4 Segundo medio sólido selectivo en placa

La elección del segundo medio se deja al criterio del laboratorio de análisis. Si se utiliza un medio
comercial, se siguen las instrucciones del fabricante en relación a su preparación y uso.

B.5 Análisis del funcionamiento para la garantía de la calidad de los medios de

cultivo
El análisis del funcionamiento de los medios de cultivo se debe realizar conforme a la Norma
ISO 11133, que incluye las definiciones de productividad, selectividad y especificidad. La tabla 1 ofrece
detalles sobre las cepas de control que se utilizan para el análisis del funcionamiento de los medios de
cultivo descritos en este documento.

Para el segundo medio de aislamiento se realiza el análisis del funcionamiento indicado en la Norma
ISO 11133, o conforme a las indicaciones del fabricante.

NOTA En el caso de Listeria spp., podría resultar informativo añadir otra cepa de control (de otra especie de Listeria) para el
análisis de la productividad.

Tabla B.1 – Análisis del funcionamiento de los medios de cultivo para Listeria monocytogenes
Reacciones
Números
Medios de Método de características del
Medioa Función Incubación Cepas de control en el Criterios
referencia control microorganismo
WDCM c
en estudio
Semi- Productividad Listeria
00021b
Fraser monocytogenes 4b
00012 o
+ Escherichia colid
00013
 10 colonias
+ Enterococcus 00009 o en Agar de
faecalisd 00087 Colonias verde-
Listeria
– Cualitativo azuladas con halo
Listeria conforme a
00109 opaco
monocytogenes 1/2a Ottaviani y
(25 ± 1) h/ Agosti
(30 ± 1) °C 00012 o
+ Escherichia colid
00013
+ Enterococcus 00009 o
faecalisd 00087
Selectividad 00012 o Inhibición total
Escherichia colid – Cualitativo –
00013 (0) en TSA
00009 o  100 colonias
Enterococcus faecalisd – Cualitativo –
00087 en TSA
Fraser Productividad Listeria
00021b
monocytogenes 4b
00012 o
+ Escherichia colid
00013
 10 colonias
+ Enterococcus 00009 o en Agar de
faecalisd 00087 Colonias verde-
Listeria
– Cualitativo azuladas con halo
Listeria conforme a
00109 opaco
monocytogenes 1/2a Ottaviani y
(24 ± 2) h/ Agosti
(37 ± 1) °C 00012 o
+ Escherichia colid
00013
+ Enterococcus 00009 o
faecalisd 00087
Selectividad 00012 o Inhibición total
Escherichia colid – Cualitativo –
00013 (0) en TSA
00009 o  100 colonias
Enterococcus faecalisd – Cualitativo –
00087 en TSA
Agar de Productividad Listeria
00021b Colonias verde-
Listeria monocytogenes 4b Buen
conforme a – Cualitativo azuladas con halo
Listeria crecimiento (2)
Ottaviani y 00109 opaco
Agosti monocytogenes 1/2a
Selectividad 00012 o
(48 ± 4) h/ Escherichia colid
00013 Inhibición total
(37 ± 1) °C – Cualitativo –
00009 o (0)
Enterococcus faecalisd
00087
Especificidad Colonias verde-
Listeria innocua 00017 – Cualitativo – azuladas sin halo
opaco
a Nombres completos de las abreviaturas de los medios.
b Cepas que se utilizan como mínimo.
c Consúltese el catálogo de cepas de referencia disponible en [Link] para información sobre los números de las cepas de la
colección de cultivos y los detalles de contacto.
d Cepa de libre elección, tiene que utilizarse una de las cepas como mínimo.

B.6 Disolución de peróxido de hidrógeno

Se utiliza una fracción en masa del 3%, es decir, una disolución de volumen 10.

B.7 Agar de movilidad

B.7.1 Composición

Digerido enzimático de caseína 20,0 g

Digerido enzimático de tejidos animales 6,1 g
Agar 3,5 g
Agua 1 000 ml

B.7.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua a ebullición.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 7,3 ± 0,2 unidades a 25 °C.

El medio se dispensa en tubos en alícuotas de 5 ml aproximadamente.

Se esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 min.

B.8 Agar de sangre

B.8.1 Medio basal

B.8.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejidos animales 15 g

Digerido de hígado 2,5 g
Extracto de levadura 5g
Cloruro sódico 5g
Agar de 9 g a 18 g a
Agua 1 000 ml
a En función de la capacidad gelificante del agar.

B.8.1.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua a ebullición.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 7,2 ± 0,2 unidades a 25 °C.

El medio se dispensa en matraces de capacidad adecuada para disponer de las porciones del tamaño
adecuado para el análisis.

Se esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 min.

B.8.2 Sangre desfibrinada (de oveja, ternera o vaca)

B.8.3 Medio completo

B.8.3.1 Composición

Medio basal (B.8.1) 100 ml

Sangre desfibrinada (B.8.2) de 5 ml a 7 ml

B.8.3.2 Preparación
Se añade la sangre sobre el medio basal previamente enfriado a una temperatura de 47 °C a 50 °C
(6.4). Se mezcla bien.

El medio se dispensa en placas Petri estériles en las cantidades adecuadas para el análisis. Se deja
solidificar.

B.9 Disolución salina tamponada con fosfato (PBS)

B.9.1 Composición

Hidrógeno fosfato disódico dihidratado 8,98 g

Dihidrógeno fosfato sódico 2,71 g
Cloruro sódico 8,5 g
Agua 1 000 ml

B.9.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 7,2 ± 0,2 unidades a 25 °C.

Se esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 min.

B.10 Suspensión de corpúsculos de eritrocitos

Los corpúsculos de eritrocitos se mantienen a una temperatura de 5 °C ± 2 °C hasta el momento de su uso.

Antes de su uso, se buscan signos de hemolisis (aparición de coloración roja) en la capa superior del
suero. Si no se ha producido hemolisis, se añaden 2 ml de corpúsculos de sangre recogidos de la parte
inferior sobre 98 ml de PBS (B.9).

Si se ha producido hemolisis, se resuspenden aproximadamente 4 ml de la capa de los corpúsculos de

la sangre en 10 ml de tampón PBS, se mezcla cuidadosamente y se centrifuga. Si el sobrenadante
adquiere un color rojo evidente, debido a una hemolisis acusada, no se utiliza esta suspensión
concentrada y se desecha. De no ser así, se decanta el sobrenadante y se añaden 2 ml de esta
disolución de corpúsculos de sangre sobre 98 ml de PBS. Esta suspensión se conserva durante cinco
días a 5 °C ± 2 °C. Si se produce hemolisis, se desecha.

B.11 Medio CAMP (medio de Christie, Atkins, Munch-Petersen) y cepas de

análisis

B.11.1 Generalidades
Pueden utilizarse las placas de agar de sangre (B.8) para este análisis, pero es preferible utilizar placas
de agar de doble capa con una capa muy fina de sangre (B.11.4).

B.11.2 Medio basal

Véase el apartado B.8.1.

B.11.3 Medio de sangre

Véase el apartado B.8.3.

B.11.4 Medio completo

Se dispensan cantidades de aproximadamente 10 ml del medio basal (B.11.2) en placas Petri estériles
y se deja solidificar. Se vierte una capa muy fina del medio de sangre (B.11.3) empleando cantidades
no superiores a 3 ml por cada placa.

Se deja solidificar. Si el medio de sangre se añade sobre placas con medio basal preparado con
antelación, puede ser necesario calentar las placas durante 20 min introduciéndolas en un incubador a
37 °C antes de verter la capa de medio de sangre.

B.12 Medio de utilización de hidratos de carbono (L-Ramnosa y D-Xilosa)

B.12.1 Medio basal

B.12.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejidos animales 10 g

Extracto de carne 1g
Cloruro sódico 5g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agua 1 000 ml

B.12.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes en el agua, calentando en caso necesario.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 6,8 ± 0,2 unidades a 25 °C.

El medio se dispensa en tubos de capacidad adecuada para disponer de las porciones del tamaño
adecuado para el análisis.

Se esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 min.

B.12.2 Disoluciones de hidratos de carbono

B.12.2.1 Composición

Hidrato de carbono a 5g
Agua 100 ml
a L-ramnosa o D-xilosa

B.12.2.2 Preparación
Se disuelven los componentes en el agua y se esteriliza por filtración a través de una membrana de
0,45 m.

B.12.3 Medio completo

Para cada hidrato de carbono, se añaden en condiciones asépticas x ml de disolución B.12.2 sobre
9x ml del medio basal (B.12.1).

B.13 Reactivos de la reacción de Voges-Proskauer (VP)

B.13.1 Medio VP

B.13.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejidos animales 7g

Cloruro sódico 5g
Glucosa 5g
Agua 1 000 ml

B.13.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes en el agua, calentando en caso necesario.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 6,9 ± 0,2 unidades a 25 °C.

El medio se dispensa en tubos en cantidades de 3 ml.

Se esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 min.

NOTA Las formulaciones comerciales preparadas con un pH comprendido en un rango de 0,5 unidades alrededor de 6,9 se
consideran aceptables.

B.13.2 Disolución de α-naftol en etanol

B.13.2.1 Composición

-Naftol 5g

Etanol al 96% (fracción en volumen) 100 ml

B.13.2.2 Preparación
Se disuelve el -naftol en el etanol.

AVISO – El -naftol es tóxico; se manipula con cuidado.

B.13.3 Disolución de hidróxido potásico

B.13.3.1 Composición

Hidróxido potásico 40 g
Agua 100 ml

B.13.3.2 Preparación
Se disuelve el hidróxido potásico en el agua.

B.14 Agar de extracto de levadura con soja y triptona

B.14.1 Composición

Digerido enzimático de caseína 17 g

Digerido con papaína de harina de soja 3g
Extracto de levadura 6g
Glucosa 2,5 g
Cloruro sódico 5g
Hidrógeno fosfato dipotásico 2,5 g
Agar de 12 g a 18 g a
Agua 1 000 ml
a En función de la capacidad gelificante del agar.

B.14.2 Preparación
Se disuelven los componentes deshidratados o el medio completo deshidratado en el agua a ebullición.

Se ajusta el pH en caso necesario, de forma que tras la esterilización quede a 7,3 ± 0,2 a 25 °C.

Se esteriliza en un autoclave a 121 °C durante 15 min.

B.14.2.1 Preparación de las placas de agar

Se depositan entre 18 ml y 20 ml del medio completo recién preparado en cada placa Petri y se deja
solidificar.

Anexo C (Informativo)

Distinción de Listeria spp. frente a otros géneros

Tabla C.1 – Distinción de Listeria spp. frente a otros géneros o especies de bacterias

Apariencia en
Movilidad Crecimiento
la tinción de Catalasa Análisis de VP
(20 °C a 25 °C) a 37 °C
Gram
Listeria spp. Gpb/Gpcb + + + +
Gpbb grande /
portador de
Bacillus spp. a + V V +
esporas
(cultivo joven)
Carnobacterium spp. a Gpb – – – +
Staphylococcus spp. a Gpc + – V +
Streptococcus spp. a Gpc – – V +
– –
Lactobacillus spp. Gpb – +
(ocasionalmente +) (ocasionalmente +)
Brochotrix spp. Gpb + – + –
Kurthia spp. Gpb + + – +
Erysipelothrix spp. Gpb – – – +
–
Corynebacterium spp. Gpb + – +
(ocasionalmente +)
Enterococcus spp. a Gpc – – + +
Cellulosimicrobium funkei a Gpcb + + – +
+
Kocuria kristinae a Gpc + – +
(ocasionalmente –)
Marinilactibacillus
Gpb + + + +
physchrotolerans a,c
Rothia terrae a Gpc + – + +
a Crecimiento conocido en Agar de Listeria conforme a Ottaviani y Agosti y en otros medios cromogénicos y que en
ocasiones forman colonias de color azul o azulado.
b Bacillus oleronius muestra una reacción variable en la tinción de Gram; la mayor parte de las células aparecen como
Gram-negativas[23].
c La distinción entre M. physchrotolerans y Listeria spp. se puede ver facilitada por las características diferenciales de las
colonias en TSYEA (colonias lenticulares de color amarillento pálido, opacas, de 2 mm a 3 mm de diámetro tras 24 h de
incubación a 37 °C) [23].
Gpb: Bacilos positivos para la tinción de Gram.
Gpcb: Cocobacilos positivos para la tinción de Gram.
Gpc: Cocos o cocoides positivos para la tinción de Gram.
V: reacción variable.
NOTA 1 Algunas especies nuevas de Listeria que se han aislado recientemente pueden no corresponder a este esquema, en
especial en relación a la movilidad, el análisis de VP y el crecimiento a 37 °C (véase por ejemplo las referencias
[5],[10],[12],[14],[25],[26] y [27] de la bibliografía.
NOTA 2 Algunas cepas poco frecuentes de Listeria presentan una reacción lenta o negativa para la catalasa.

Anexo D (Informativo)

Reacciones de identificación de las especies de Listeria

Tabla D.1 – Principales análisis prescritos en este documento (véase 9.5)

Producción de ácido Análisis de CAMP

Especies PI-PLC -hemolisis L-
D-Xilosa Manitol S. aureus R. equi
Ramnosa
L. monocytogenes + (24 h) + + – – + –
L. innocua – – V – – – –
L. ivanovii + (24 h a + – + – – +
48 h)
L. seeligeri – (+) – + – (+) –
L. welshimeri – – V + – – –
L. grayi – – V – + – –
L. fleischmanii – – + + + – –
L. marthii – – – – + – –
L. rocourtiae – – + + + – –
L. weihenstephanensis – – + + – – –
PI-PLC: Fosfolipasa C de fosfatidil inositol.
V: reacción variable.
(+): reacción débil
+ : más del 90% de reacciones positivas.
–: ausencia de reacción.
NOTA 1 Existen cepas poco frecuentes de L. monocytogenes que no presentan actividad de -hemolisis ni reacción positiva
en el análisis de CAMP bajo las condiciones descritas en este documento.
NOTA 2 Algunas cepas de L. seeligeri pueden presentar los mismos resultados de hemolisis que L. monocytogenes.
NOTA 3 Se han aislado recientemente algunas especies nuevas de Listeria. Pueden requerirse análisis adicionales para su
correcta identificación [5],[10],[12],[14],[25],[26],[27].
NOTA 4 Algunas cepas atípicas de L. innocua presentaron características fenotípicas de L. monocytogenes y sólo se
pudieron distinguir por parte de un Laboratorio de Referencia[11].
NOTA 5 Existen cepas poco frecuentes de L. monocytogenes que no fermentan L-Ramnosa[15][18].

Tabla D.2 – Reacciones adicionales para la identificación de las especies de Listeriae

Análisis de CAMP
Movilidad Esculina -
Género y especie Catalasa PI-PLCa Manitol Rhodococcus Staphylococcus DIM a MAN DAR XYL RHA MDG RIB G1P TAG
(22 – 30) °C ( -glucosidasa) hemolisis
equi aureus
L. fleischmannii + – + – + – – – – – + + + + – – –
subesp. coloradensis
L. fleischmanii subesp. + – + – + – – – – – + + + + – – –
fleischmanii
L. grayi variante + + + – + – – – + + + – (–) Vb + – –
biológica grayi c
L. grayi variante + + + – + – – – + + + – + V + – –
biológica murrayi c
L. innocua + + + – – – – – + + + – V + – – –
L. ivanovii subesp. + + + + – + + – V – + + – + + V –
ivanovii (de 24 h
a 48 h)
L. ivanovii subesp. + + + + – + + – V – + + – + – V –
londoniensis (de 24 h
a 48 h)
L. marthii + + + – – – – – – + + – – + – – –
L. monocytogenes + + + + – + – + – + + – +d + – – –
(24 h) (de 24 h a
72 h)
L. rocourtiae + + + – + – – – – + – + + + + – –
débil
L. seeligeri + + + – – + – + + – + + – + – – –
L. weihenstephanensis + + + – – – – – – – + + + + + – –
débil
L. welshimeri + + + – – – – – (+) + + + V + – – +
a PI-PLC: Fosfolipasa C de fosfatidil inositol; DIM: D-arilamidasa; MAN: alfa-manosidasa; DAR: D-arabitol; XYL: D-xilosa; RHA: L-ramnosa; MDG: alfa-metil-D-glucósido; RIB: D-ribosa; G1P: Glucosa-1-fosfato;
TAG: D-tagatosa.
b V: variable; + o -: la mayor parte de las cepas son positivas o negativas; (+) o (–): 90% de reacciones positivas o negativas.
c La variante biológica grayi es negativa para nitrato y turanosa aunque la variante biológica murrayi es positiva para nitrato y turanosa.
d Existen cepas poco frecuentes negativas para ramnosa, que pertenecen al linaje IIIB/IIIC.
e Procedencia: Centro Nacional de Referencia/Centro Colaborador con la OMS para Listeria, Instituto Pasteur, París.

Anexo E (Informativo)

Medios de agar selectivos para Listeria

La detección de Listeria spp. se basa en la ruptura de conjugados de X- -D-glucósidos por acción de la

-D-glucosidasa, una enzima común a todas las Listeria spp. Sin embargo, la detección de L.
monocytogenes y de L. ivanovii patogénicas se basa en la detección de la actividad lecitinasa
(fosfolipasa C de fosfatidilcolina – PCPLC) y/o fosfolipasa C de fosfatidilinositol – (PIPLC).

Tabla E.1 – Medios de agar selectivos para Listeria no comerciales (recogidos

de la referencia [7] de la bibliografía)

Cloruro Polimixina (P) Sistema de

Acriflavina Otros Referencias
de litio o Colistina (C) indicador a
(g/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)
Medios de agar que no distinguen entre Listeria spp.
Medio Harlequin de listeria 15 C10 2,5 Fosfomicina 5, CHEg + Fe Smith et al.,
2000
Cefotetan 1,
Cicloheximida 200
Moxalactam con feniletanol y 5 0 0 Moxalactam 20, Henry Lee y McCain,
cloruro de litio (LPM) Lithium 1986
chloride phenylethanol Glicerina anhidra 10,
moxalactan Peniletanol 2500
Oxford 15 C20 5 Fosfomicina 10, Ae + Fe Curtis et al.,
1989
Cefotetan 2,
Cicloheximida 4009
Oxford modificado 12 C10 0 Ceftazidima 20 Ae + Fe Cook, 1998
(MOX)Modified Oxford
PALCAM 10 P10 5 Ceftazidima 30 Ae + Fe Van Netten et
Mann + PR al., 1989
Medios de agar que distinguen entre especies en base a la hemolisis
Medio de agar de hemolisis 10 P10 5 Ceftazidima 30 MUG Cox et al.,
reforzado (EHA)Enhanced Sangre de 1991 b
haemolysis agar oveja
Medio de agar de sangre para 10 P10 0 Ceftazidima 20 Sangre de Johansson,
Listeria monocytogenes oveja 1998
(LMBA)Listeria monocytogenes
blood agar
Medios de agar específicos para Listeria spp. patogénicas
Agar de Listeria conforme a 10 Polimixina B: Anfotericina B 10, Chrom Ottaviani et
Ottaviani y Agosti 76 700 U; en la PCPLC al., 1997
columna Otros, Ácido nalidíxico,
se añade: Ceftazidima 20
a Ae: esculina; CHEg: CHE-glucósido; Chrom: Sustrato cromogénico; Fe: sal de hierro; Henry: Medio de Henry (1993).
Indicador: Mann: Manitol; MUG: 4-metilumbeliferil-β-D-glucósido; PR: Rojo de fenol.

Anexo F (Informativo)

Resultados de los estudios interlaboratorios para

la detección de Listeria monocytogenes

F.1 Resultados de los estudios interlaboratorios

Se realizaron estudios interlaboratorios a nivel internacional en un total de 17 países. En los estudios
se utilizaron los siguientes tipos de alimentos: salmón ahumado en frío, muestras ambientales, ensala-
das listas para consumir, fórmulas alimenticias infantiles en polvo y queso. Cada una de las muestras
de los alimentos se analizó para dos niveles de contaminación más un control negativo. Las muestras
se contaminaron de manera artificial con L. monocytogenes y con L. innocua en el caso de las muestras
ambientales y del queso y con L. monocytogenes y con L. welshimeri en el caso del salmón ahumado en
frío que podría alterar la sensibilidad. En el caso de las muestras ambientales, se añadió una mezcla de
Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus y Pseudomanas fragi a cada muestra. Las muestras de
fórmulas alimenticias infantiles en polvo se contaminaron artificialmente sólo por adición de L.
monocytogenes.

El estudio se organizó en el año 2013 por parte del Laboratorio de Seguridad Alimentaria ANSES,
Maisons-Alfort, Francia con salmón ahumado en frío, muestras ambientales, ensaladas listas para
consumir y fórmulas alimenticias infantiles en polvo, y por parte de ACTALIA-CECALAIT, Poligny,
Francia en el caso de las muestras de queso, como parte del Mandato M381 de CEN procedente de la
Comisión Europea.

Los valores de las características de funcionamiento obtenidos a partir de los estudios interlabo-
ratorios se muestran, clasificados por tipo de muestra, en las tablas F.1 a F.5. Algunas condiciones de
conservación o la adición de una mezcla bacteriostática en determinadas matrices pueden haber
inducido unas condiciones de estrés en L. monocytogenes que puede explicar la observación de una
sensibilidad inferior que en otras matrices.

Los estudios interlaboratorios se realizaron con una duración de enriquecimiento primario de

24 h ± 2 h, pero esta duración se modificó posteriormente en el documento a 25 h ± 1 h. Esta
modificación no alteró las características de funcionamiento ya que se adoptó para permitir un
crecimiento superior de las bacterias objeto de estudio en el medio de enriquecimiento primario. El
número de laboratorios que realizó menos de 24 h en el enriquecimiento primario en cada uno de los
estudios fue: tres en el caso del salmón ahumado en frío, dos en el caso de las muestras ambientales,
cinco en el caso de las ensaladas listas para consumir, uno en el caso de las fórmulas alimenticias
infantiles en polvo y seis en el caso del queso.

Tabla F.1 – Resultados del análisis de los datos obtenidos en salmón ahumado en frío
Parámetro 0 CFU/25 g 8 CFU/25 g 74 CFU/25 g
(blanco) (nivel bajo de (nivel alto de
contaminación) contaminación)
Número de colaboradores participantes 15 15 15
Número de colaboradores mantenidos tras la evaluación de los datos 15 15 15
Número de muestras 120 120 120
Número de muestras mantenidas tras la evaluación de los datos 120 120 120
Sensibilidad, en % – 100 100
Especificidad, en % 100 – –

Tabla F.2 – Resultados del análisis de los datos obtenidos en muestras ambientales
(almohadillas de gasa sumergidas en diluyente)
Parámetro 0 11 100
CFU/almoha CFU/almohadilla CFU/almohadilla
dilla de gasa de gasa de gasa
(blanco) (nivel bajo de (nivel alto de
contaminación) contaminación)
Número de colaboradores participantes 15 15 15
Número de colaboradores mantenidos tras la evaluación de los datos 14a 14a 14a
Número de muestras 120 120 120
Número de muestras mantenidas tras la evaluación de los datos 112 112 112
Sensibilidad, en % – 99,1b 99,1b
Especificidad, en % 100 – –
a Se excluyó un laboratorio por haber recibido las muestras abiertas (problemas durante el transporte).
b Un laboratorio (diferente en el nivel alto y en el bajo) detectó L. monocytogenes en siete de las ocho muestras. De hecho,
se observaron colonias características de L. monocytogenes pero resultaron sobrecrecidas por L. innocua, lo cual impidió
el aislamiento y purificación para la confirmación adicional.

Tabla F.3 – Resultados del análisis de los datos obtenidos en ensaladas listas para consumir
(mezcla de espinacas frescas y lechuga iceberg)
Parámetro 0 CFU/25 g 9 CFU/25 g 90 CFU/25 g
(blanco) (nivel bajo de (nivel alto de
contaminación) contaminación)
Número de colaboradores participantes 16 16 16
Número de colaboradores mantenidos tras la evaluación de los datos 16 16 16
Número de muestras 128 128 128
Número de muestras mantenidas tras la evaluación de los datos 128 128 128
Sensibilidad, en % – 100 100
Especificidad, en % 97,6a – –
a Se obtuvieron tres valores falsos positivos en tres laboratorios diferentes (una muestra de las ocho). Las posibles razo-
nes pueden ser: (i) contaminación cruzada a nivel del organizador, (ii) contaminación cruzada a nivel del laboratorio
participante, (iii) contaminación muy baja y heterogénea de la matriz, que no se detectó en los análisis preliminares de
detección realizados tanto por parte del organizador como por el productor de las muestras, y que es poco probable que
afecte a la calidad de los resultados del estudio.

Tabla F.4 – Resultados del análisis de los datos obtenidos en fórmulas

alimenticias infantiles en polvo

Parámetro 0 CFU/25 g 11 CFU/25 g 91 CFU/25 g

(blanco) (nivel bajo de (nivel alto de
contaminación) contaminación)
Número de colaboradores participantes 16 16 16
Número de colaboradores mantenidos tras la evaluación de los datos 16 16 16
Número de muestras 128 128 128
Número de muestras mantenidas tras la evaluación de los datos 128 128 128
Sensibilidad, en % – 99,2a 100
Especificidad, en % 100 – –
a Un laboratorio detectó L. monocytogenes en siete de las ocho muestras.

Tabla F.5 – Resultados del análisis de los datos obtenidos en queso

(requesón de queso artificial)

Parámetro 0 7 78
CFU/almoha CFU/almohadilla CFU/almohadilla
dilla de gasa de gasa de gasa
(blanco) (nivel bajo de (nivel alto de
contaminación) contaminación)
Número de colaboradores participantes 15 15 15
Número de colaboradores mantenidos tras la evaluación de los datos 14a 14a 14a
Número de muestras 120 120 120
Número de muestras mantenidas tras la evaluación de los datos 112 112 112
Sensibilidad, en % – 91,1b 100
Especificidad, en % 100 – –
a Se excluyó un laboratorio por haber recibido las muestras demasiado tarde.
b Tres laboratorios detectaron L. monocytogenes en siete de las ocho muestras, y un laboratorio en una de las ocho
muestras.

F.2 Valores de LOD50 recogidos de la bibliografía

El LOD50 no se podía estimar en el marco del estudio interlaboratorios descrito en el capítulo F.1. Sin
embargo, en la tabla F.6 se muestran los valores medios de LOD50 procedentes de la Norma
ISO 11290-1:1996/Corr. 1:2004, disponibles a partir de los estudios de validación de AFNOR o de
métodos comerciales alternativos, conforme a la Norma ISO 16140:20032) para varias categorías de
alimentos o de muestras ambientales. Se considera que las modificaciones técnicas de este documento
no producen un impacto significativo sobre dichos valores en relación al LOD50.

2) Norma retirada.

Tabla F.6 – LOD50 (cfu/25 g o 25 ml)

Parámetro Productos cárnicos Marisco Productos Verduras Muestras

(n = 22) lácteos (n = 22) ambientales
Chicharrones Carne picada
(n = 23) (n = 22)
(n = 19) (n = 2)
Valor medio 0,6 1 0,5 0,6 0, 6 0,5
Desviación 0,2 0,9 0,2 0,2 0,2 0,1
estándar
Valores extremos de 0,2 a 1,0 de 0,4 a 1,7 de 0,1 a 1,3 de 0,3 a 1,2 de 0,1 a 0,9 de 0,3 a 0,8
NOTA Véase la referencia [20] de la bibliografía.

Tabla F.7 – Informes de validación de AFNOR que proporcionaron los valores de LOD50 [20]

Método propio Informe de Referencia de AFNOR (número de

certificado/fecha de publicación)
ALOA One DAy AES 10/3 – 09/00
20 de diciembre de 2012
ADIAFOOD Listeria monocytogenes AES 10/8 – 12/09
Agosto de 2010
Placa Transia Listeria monocytogenes TRA 02/11–03/08
2008 v01
Agar ChromIDTM Lmono BIO 12/31–05/11
Agar ChromIDTM de Ottaviani Agosti BIO 12/24–03/08,
9 de febrero de 2012
Vidas Listeria monocytogenes 2 (30 °C) BIO 12/09–07/02
2007 v01
Vidas Listeria monocytogenes 2 (37 °C) BIO 12/11–03/04
2013 v01
Vidas Listeria DUO BIO 12/18–03/06
2006 v01
Vidas Listeria monocytogenes Xpress BIO 12/27–02/10
2012 v01
Rapid L’mono (Detección) BRD 07/04–09/98
2010 v01
Check IQ Listeria monocytogenes II BRD 07/10 – 04/05
2013 v01
Detección AL/Agar BRD 07/16 – 01/09,
2013
CHROMagarTM Listeria CHR 21/1 – 12/01
7 de octubre de 2013
Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes EUR 15/03 −12/05
Febrero de 2010

Método propio Informe de Referencia de AFNOR (número de

certificado/fecha de publicación)
Accuprobe Listeria monocytogenes BIO 12/4 - 02/95
7 de febrero de 2011
MicroSEQ Listeria monocytogenes ABI 29/05–12/11
5 de diciembre de 2011
Listeria PrecisTM UNI 03/04–04/05
4 de febrero de 2013
Análisis de PCR SureTect de ThermoScientific UNI 03/08–11/13
28 de noviembre de 2013
BAX® Listeria mono 24E QUA 18/05 – 07/08
9 julio de 2012
GeneDisc Listeria monocytogenes GEN 25/08–07/10
31 de marzo de 2011
Agar Compass Listeria (Detección) BKR 23/02 – 11/02
28 de junio de 2013

Bibliografía

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Listeria monocytogenes Results of trials performed by a working group of the International
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D., RASOOLY A., CHIZHIKOV V., WIEDMANN M., FORTES E., DUVALL R.E., HITCHINS A.D. Natural atypical
Listeria innocua strains with Listeria monocytogenes pathogenicity island 1 genes. Appl. Environ.
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detection of Listeria in food. J. Appl. Microbiol. 2006, 101 pp. 711–717.

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monocytogenes in food. Food Microbiol. 2016, 60 pp. 131–136.

[22] JAGADEESAN B., BASTIC SCHMID V., KLIJN A., MC MAHON W. Validation of Test Portion Pooling for the
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[24] CARPENTIER, B & BARRE, L. Guidelines on Sampling the Food Processing Area and Equipment for
the Detection of Listeria monocytogenes. Listeria EURL, 2012.

[25] BARRE L., ANGELIDIS A.S., BOUSSAID D., DECOURSEULLES BRASSEUR E., MANSO E. GNANOU BESSE N.
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presence of new Listeria species. Int. J. Food Microbiol. 2016, 238 pp. 281–287.

[26] HENK C., WARCHOCKI S., EMILY M., ADAM F., CLYDE M., KEPHAR D AND WEIDMANN M. Five new species
of Listeria (L. floridensis sp. nov., L. aquatic sp. nov., L. cornellensis sp. nov., L. riparia sp. nov. and
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Syst. Evol. Microbiol. 2014, 64 pp. 1882–1889.

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[28] ISO 17468, Microbiology of the food chain. Technical requirements and guidance on establishment
or revision of a standardized reference method.

[29] GNANOU BESSE N., FAVRET S., DESREUMAUX J., DECOURSEULLES BRASSEUR E., KALMOKOFF M. Evaluation
of reduction of Fraser incubation by 24h in the EN ISO 11290 1 standard on detection and
diversity of Listeria species. Int. J. Food Microbiol. 2016, 224 pp. 16–21.

[30] ISO 16140:2003, 3) Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of
alternative methods.

3) Norma retirada.

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