Determinación de la concentración de glucosa por un método enzimático

fotocolorimétrico

Carolay Carvajal1, Natali Martínez 1, Jesús Martínez1, Angie Ortega1, Jailyn Rodríguez1
Profesora: Dary luz Mendoza Meza
Laboratorio de Bioquímica, programa de Química
Universidad Del Atlántico,
Barranquilla 2022

RESUMEN
Este informe tiene como objetivo principal determinar la concentración de glucosa por medio de un método
enzimático fotocolorimétrico, para esta práctica se empleó un Espectrofotometro de uv-vis en una longitud de
onda de 500nm, se obtuvieron las diferentes absorbancias y concentraciones desconocida para las muestras.
Una vez que se calculó las concentraciones finales y teniendo los valores de absorbancia, se realizó una curva
de calibración de absorbancia Vs concentración de glucosa. A partir de la ecuación de la línea recta del
gráfico, se determinó la concentración de glucosa en dos muestras problemas que fueron dadas por el docente.
Se analizo el error entre el valor halla experimentalmente y el valor real.

Palabras claves: Fotocolorimetría, Glucosa, Matrices biológicas, Método enzimática, Quinonaimina.

ABSTRACT
The words:
Key main objective of this reportGlucose,
Photocolorimetry, is to determine the glucose
Biological concentration
matrices, Enzymatic by means Quinonaimine.
method, of a photocolorimetric
enzymatic method, for this practice a uv-vis spectrophotometer was used at a wavelength of 500nm, the
different absorbances and unknown concentrations for the samples were obtained. Once the final
concentrations were calculated and having the absorbance values,como
tejidos a calibration
forma de curve of absorbance
energía vs glucose
al combinarlo con el
1. INTRODUCCION
concentration was made. From the equation of the straight line de
oxígeno of lathe graph, theCuando
respiración. glucosecomemos
concentration was en
el azúcar
determined in two problem samples that were given la bysangre
the teacher. The error between the value found
se eleva, lo que se consume desaparece de la
experimentally and the real value was analyzed. sangre, para ello hay una hormona reguladora que es
La glucosa es la principal fuente de energía para
el metabolismo celular. Se obtiene la insulina producida por el páncreas (islotes
fundamentalmente a través de la alimentación, pancreáticos).
y se almacena principalmente en el hígado, el cual
tiene un papel primordial en el mantenimiento de Esta hormona hace que la glucosa de la sangre entre en
los niveles de glucosa en sangre (glucemia). los tejidos y sea utilizada en forma de glucógeno,
Para que esos niveles se mantengan y el aminoácidos, y ácidos grasos. Cuando la glucosa en
almacenamiento en el hígado sea adecuado, se sangre está muy baja, en condiciones normales por el
precisa la ayuda de la insulina, sustancia producida ayuno, se secreta otra hormona llamada glucagón
por el páncreas. que hace lo contrario y mantiene los niveles de
La glucosa es un azúcar que es utilizado por los glucosa en sangre. Cuando la insulina es insuficiente, la

1
glucosa se acumula en sangre, y si esta situación se patrón o estándar). Estos patrones de calibración se
mantiene, da lugar a una serie de complicaciones en miden en el instrumento analítico bajo las mismas
distintos órganos. Esta es la razón principal por la condiciones que las utilizadas posteriormente para los
que se produce aumento de glucosa en sangre, pero materiales de ensayo (es decir, los «desconocidos»). Una
hay otras enfermedades y alteraciones que también la vez establecida la gráfica de calibrado, puede obtenerse
Provocan. la concentración de analito por interpolación en
cualquier material de ensayo.[1]
Debido a su alta solubilidad se metaboliza
rápidamente proporcionando 4kcal/g al oxidarse Así vemos que las etapas o pasos que deben seguirse en
completamente hasta CO2 + H2O. Uno de los un análisis mediante recta de calibración son:
métodos para determinar cuantitativamente la
presencia de glucosa en diferentes matrices 1. Etapa de calibración:
biológicas es la reacción con las enzimas Glucosa
Oxidasa y Peroxidasa en presencia de un cromógeno. • Determinación del extremo superior del rango lineal.
[2] • Preparación de los patrones.
• Medición de la respuesta de los patrones.
• Estimación de los parámetros de la regresión.
• Cálculo de las cifras de mérito del método.

2. Etapa de predicción.
• Estimación de la concentración del analito en la
muestra de interés. Este procedimiento general plantea
varias cuestiones estadísticas importantes.

aspectos importantes en el trazado de las líneas de

calibrado
1. En primer lugar, resulta habitualmente esencial
que los patrones de calibrado cubran el intervalo
Figura #1. Reacción con las enzimas Glucosa completo de concentraciones requerido en subsiguientes
Oxidasa y Peroxidasa en presencia de un cromógeno. análisis. Con la importante excepción del método de las
adiciones estándar, que es tratado aparte en una sección
posterior, la concentración de los materiales de ensayo se
Métodos de calibración para la determinación de determina normalmente por interpolación y no por
azucares extrapolación.
2. Siempre el punto cero o valor de un blanco se
El método de calibración es un procedimiento debe incluir en la curva de calibrado. El blanco no
analítico muy utilizado en análisis cuantitativo en contiene ningún analito adicionado deliberadamente,
química analítica que implica la construcción de una pero contiene los mismos disolventes, reactivos, etc., que
“curva de calibración” para determinar la los otros materiales de ensayo, y está sujeto exactamente
concentración de una sustancia (analito) en una a la misma secuencia del procedimiento analítico. La
muestra problema. Una curva de calibración es la señal del instrumento dada por el blanco a veces no será
representación gráfica de una señal que se mide en cero. Esta señal está sometida a errores, como los demás
función de la concentración de un analito. puntos del gráfico calibrado, y no tiene sentido, en
Conociendo esta relación funcional, será posible principio, restar el valor del blanco de los otros valores
conocer la concentración en una muestra dada estándar antes de dibujar la curva de calibrado. Esto es
mediante la medida de esa señal.[1] debido a que, como vimos cuando estudiamos
Propagación de incertidumbres, cuando se restan dos
Gráficas de calibrado en análisis instrumental cantidades, la incertidumbre en el resultado final no
puede obtenerse por simple resta. La resta del valor del
El procedimiento habitual es el siguiente. El analista blanco de cualquier otra señal del instrumento antes de
toma una serie de materiales (normalmente al menos dibujar el gráfico proporciona una información
tres o cuatro, y posiblemente algunos más) de los que incorrecta de las incertidumbres del proceso de
se conoce la concentración de analito (disoluciones calibración.

2
 absortividad): Si se despeja de la ecuación de la ley de
3. Finalmente, se debe subrayar que la curva de Lambert-Beer.[1]
calibrado se establece siempre con la respuesta del
instrumento en el eje vertical (YY) y la concentración
del patrón sobre el eje horizontal (XX). Esto es
debido a que muchos de los procedimientos que se
describen en las secciones siguientes suponen que
todos los errores residen en los valores de YY y que
las concentraciones de los patrones (valores de XX)
se encuentran libres de error.[1]

Figura #2. Dibujo esquemático del espectrómetro

Fotocolorimetría

La Fotocolorimetría se fundamente en la mayor o menor

absorción de luz de acuerdo al mayor número de
moléculas en una solución, donde la tonalidad dependerá
de la capacidad de absorber un rayo de luz de
determinada longitud de onda. La fotocolorimetría
Ley de Lambert-Beer manipula las variables de este fenómeno controlando la
luz incidente proveniente de un foco luminoso y su
Es el resultado de la combinación de las leyes de pureza, de modo tal que sólo incida aquella luz que es
absorción de ambos e indica la relación directamente específicamente adsorbida por la partícula que deseamos
proporcional que existe la absorbancia de una analizar (analito).
muestra y su concentración, al ser constantes los
valores de trayecto óptico (b=1 cm), la longitud de Conociendo la longitud de onda óptima a la que
onda de la radiación incidente y absorbida, expresada absorben los analitos, o especies directamente
como absortividad molar con el coeficiente de relacionadas con ellos, se pueden realizar las pruebas
absortividad molar “ε” (épsilon). analíticas en los laboratorios clínicos aplicando las leyes
de espectrofotometría.

La relación de la longitud de onda con la frecuencia y

con la energía de radiación es inversa, por lo que las
radiaciones más energéticas, más penetrantes, son a su
Siendo: I0 e I = Intensidad de la radiación e vez las de mayor frecuencia y menor longitud de onda.
intensidad de la radiación final, después de haber La región visible del espectro luminoso es la zona de
travesado la cubeta de la muestra, respectivamente. A longitudes de onda con energía radiante capaz de ser
= Absorbancia, Medida de la absorción de la detectado por el ojo humano y va desde el violeta hasta
radiación. También se conoce como densidad óptica el rojo.
o extinción. Es una magnitud adimensional.
Generalmente los espectrofotómetros expresan la Las técnicas espectroscópicas se basan en la medida de
absorbancia hasta las milésimas. Suelen ser los efectos de la interacción de las radiaciones
magnitudes que oscilan entre 0 y 1, aunque en electromagnéticas con la materia. Al incidir sobre el
determinados análisis en los que se mide la variación material biológico con una intensidad inicial (I0), las
de absorbancia con el tiempo pueden obtener valores moléculas y/o átomos del mismo absorben parte de esa
superiores. B = Trayecto óptico, su valor está radiación (Ia), otra parte la dispersan (Id) y otra atraviesa
estandarizado en 1 cm. Es la longitud de la muestra la muestra (It). La cantidad de radiación absorbida se
que atraviesa la radiación cuando ésta se encuentra ajusta a leyes físicas concretas dependientes de las
depositada en una cubeta. Es una medida características tanto de la radiación como de la materia
estandarizada para todos los espectrofotómetros. (1 sobre la que se irradia.[1]
cm). C = Concentración de la sustancia (analito) de la
muestra. Suele expresarse en moles/L (con la
absortividad molar) o g/L (si se emplea la
3
 Método experimental

Parte #1
Figura#3. Espectro de radicación MUESTRA PATRON
en un matraz volumétrico 50 mL de una solución patrón
Inicio
Objetivos
 Aprender y conocer el fundamento del
método enzimático de determinación de
glucosa usando fotocolorimetría.
 Construir un grafico de calibración para
las diferentes concentraciones.
 Utilice la ecuación de regresión del a partir de esta solución patrón, se preparó en matraces vol
gráfico de calibración para calcular la
concentración de la muestra desconocida.
 Determinar la concentración de una
sustancia por la intensidad del color que
presenta utilizando la técnica de
fotocolorimetría.

con concentraciones de - 1000 mg/dl, 500 mg/dl ,250 mg/dl, 125 mg/d

2. MATERIALES Y METODO.
En tubos de ensayo se preparó 1 ml del reactivo enzimático con 10

Materiales

 Dos muestras en las que se quiere

determinar la concentración de glucosa.
 Reactivo D-glucosa anhidra.
 Agua destilada. luego se trasfirió 350 ul de cada reacción a los pocillos de una placa
 Reactivo enzimático marca Biosystem.
 Espectrofotometro UV/Vis.
 Balanza analítica.
 Pipetas volumétricas de 5 mL.
 Micropipeta de 1 mL y 10 uL.
 Puntas para micropipetas.
 Matraces aforados de 10 mL y 50 mL. Se leyeron las muestras en el espectrofotómetro en el rango de 300-7
 Beackers de 25 mL.
 Tubos de ensayo.
 Gradillas.
 Placas de microtitulación de 96 pozos.
 Pesa sustancia.

Fin
4
 Parte #2 [Link] y Discusión
Para realizar esta experiencia se tomó como muestra 0.5 ml de miel de abeja y jarabe de maple.
Inicio ABSORBANCIAS OBTENIDAS
Estan.1 Estan.2 Estan.3 Estan.4 Estan.5
2.84 0.817 0.289 0.35 0.197
2.451 1.227 0.28 0.428 0.199
2.091 0.739 0.197 0.472 0.197
promedio 2.461 0.9277 0.2553 0.4167 0.1977
Desviación 0.3746 0.2621 0.0507 0.0618 0.00115
Se realizo 4 muestras, un blanco en disolución acuosa, una muestra de jarabe de maple con 0.5 ml, una muestra de miel de abeja con 0,5 ml y una muestra de glucosa.
estándar

Solución patrón 2000mg/dl aforado con agua hasta 50ml

Concentración(mg/dl) Volumen utilizado (10ml) Absorbancia

promedio

Estándar 1 1000 5ml de sol. Patrón + 5ml agua 2,461

Estándar 2
Se aforo 50 ml de agua destilada para las muestras de miel de abeja y jarabe de maple. 500 5ml de estándar 1 + 5ml de agua 0,9277

Estándar 3 250 5ml de estándar 2 + 5ml de agua 0,2553

Estándar 4 125 5 ml de estándar 3 + 5ml de agua 0,4167

Estándar 5 62.5 5ml de estándar 4 + 5 ml de agua 0,1977

Luego se agregaron en cuatro tubos de ensayo 1 ml de cada una de las muestras, miel de abeja, jarabe de maple y glucosa, seguido se agregó 1 ml del reactivo enzimático y se colocaron
DETERMINACION DE CONCENTRACION DE GLUCOSA

3
2,5 y = 0.0024x - 0.0836
2 R² = 0.9491
1,5
A

1
0,5
0
Luego se agregan 4 pequeñas muestras de cada analito a las celdas para posteriormente colocarlo en el equipo UV visible y obtener los resultados.

020040060080010001200

Concentracion de glucosa

5
[Link] los cálculos para determinar el volumen
de transferencia en la actividad 2. ¿A qué se debe el cambio de coloración?
Volumen necesario para estándar 1. Cuando la glucosa (incolora) reacciona con el
reactivo enzimático, se observa que la enzima
𝑉2 𝐶2 (10𝑚𝑙) (1000𝑚𝑔) glucosa oxidasa que es una oxidorreductasa, cataliza
V1= = 𝑑𝑙
= 5ml
𝐶1 2000𝑚𝑔
la oxidación de la glucosa para formar peróxido de
( 𝑑𝑙 ) hidrógeno y lactona. Posterior a esto la producción
de 4-aminoantipirina al reaccionar con fenol en
presencia de peróxido da como resultado la quinona
Volumen necesario para estándar 2 imina que tiene una longitud de onda de
500𝑚𝑔 aproximadamente 505nm, en otras palabras,
𝑉2 𝐶2 (10𝑚𝑙) ( )
𝑑𝑙 podemos observarla con una coloración rosa intenso.
V=
1 = 1000𝑚𝑔 = 5ml
𝐶1
(
𝑑𝑙
)

Volumen necesario para estándar 3

250𝑚𝑔)
𝑉2 𝐶2 (10𝑚𝑙) ( 𝑑𝑙
V 1= = = 5ml
𝐶1 500𝑚𝑔
( 𝑑𝑙 )

Volumen necesario para estándar 4

125𝑚𝑔)
𝑉2 𝐶2 (10𝑚𝑙) ( 𝑑𝑙
V 1= = = 5ml
𝐶1 250𝑚𝑔
( 𝑑𝑙 )

[Link] el espectro de absorción del

Volumen necesario para estándar 5
blanco y una de las muestras de reacción
𝑉2 𝐶2 (10𝑚𝑙) (
62,5𝑚𝑔)
𝑑𝑙
de la glucosa con el reactivo enzimático.
V 1= = = 5ml
𝐶1 125𝑚𝑔
( 𝑑𝑙 )

2. ¿Cuál es el cambio de coloración de ocurre

después de la reacción de la glucosa con el
reactivo enzimático?

Las muestras pasan de estar incoloras a tener una

tonalidad rosa intenso que va disminuyendo al diluir
las muestras.
Figura#4. Espectro de absorción del blanco

6
 5. ¿Cuál es la concentración de glucosa en
las muestras problema? ¿Cuál es el error
del valor real vs el calculado
experimentalmente? ¿Explique a que se
debe el error?

1 2 3 4
Figura#5. Espectro de absorción del estándar 1 A 0,131 0,260 0,749 0,366
B 0,118 0,327 0,705 0,372
¿Cuál es la longitud de onda de máxima absorción C 0,090 0,325 0,697 0,371
del producto de la reacción? Promedio 0,113 0,304 0,717 0,3697
Abs-control 0,191 0,604 0,2567
R/ punto de absorción máximo 500nm Error

4. Presente el gráfico de calibración de la Una vez obtenidos los valores de absorbancia

concentración vs absorbancia de las diluciones de en el UV-Vis sacamos un promedio ya que a
glucosa. Recuerde incluir las barras de error de cada muestra se le realizaron 3 lecturas y
cada punto del gráfico. utilizando la ecuación de la recta (y =
0.0024x - 0.0836) encontrada en la parte #1
del experimento se pudo determinar las
concentraciones de las muestras problemas
ya que al encontrar la absorbancia podemos
despejar la variable x la cual es en la
ecuación la concentración.

De la ecuación de la recta y = 0.0024x -

0.0836
Despejamos x=(y+0.0836/0.0024) para poder
determinar las concentraciones de las
muestras problemas.

Tuvo 1: control (H2O)

¿Cuál es la fórmula de la línea de regresión?
Tuvo 2: jarabe Maple
Tuvo 3: Miel
𝒚 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟐𝟒𝒙 − 𝟎. 𝟎𝟖𝟑𝟔
Tuvo 4: Glucosa

¿Cuál es el coeficiente de correlación R2?

R=0.9491 Concentración tuvo 1 control.

0.113 +
𝑥= 0.0836 = 81.92
0.0024
Valor teorico − valor experimental valor
%E = terorico
7
× 100

8
Concentración tuvo 2 (jarabe de maple):
se debe multiplicar por 100 que es el factor El resultado anterior equivaldría a un 57,3%
de dilución utilizado y pasar las unidades a de glucosa en los 520g del frasco de miel
g/ml
Valor teorico − valor experimental
%E = × 100
0.191 + 0.0836 valor terorico
𝑥= = 114,4𝑚𝑔/𝑑𝑙 ∗ 100
0.0024
= 11440𝑚𝑔/𝑑𝑙
Concentración tuvo 4 (glucosa)
11440𝑚𝑔 1𝑔 1𝑑𝑙
∗ ∗ = 0,1144𝑔/𝑚𝑙 0.3697 + 0.0836
𝑑𝑙 1000𝑚𝑔 100𝑚𝑙 x= = 141,79
0.0024
Ahora procedemos hallar la concentración de
glucosa en el frasco utilizando el siguiente factor
de conversión. Valor teorico − valor experimental
%E = × 100
valor terorico
0,1144𝑔 460𝑔
∗ = 105.248𝑔/𝑚𝑙
𝑚𝑙 0,5𝑔

El resultado anterior equivaldría a un 22,88%

de glucosa en los 460g del frasco de jarabe
de maple.

Valor teorico − valor experimental

%E = × 100
valor terorico

Concentración tuvo 3 (miel): se debe

multiplicar por 100 que es el factor de
dilución utilizado

0.604 + 0.0836
𝑥= = 286,5𝑚𝑔/𝑑𝑙 ∗ 100
0.0024
= 28650𝑚𝑔/𝑑𝑙

28650𝑚𝑔 1𝑔 1𝑑𝑙
∗ ∗ = 0,2865𝑔/𝑚𝑙
𝑑𝑙 1000𝑚𝑔 100𝑚𝑙

Ahora procedemos hallar la concentración de

glucosa en el frasco utilizando el siguiente factor
de conversión.

0,2865𝑔 520𝑔
∗ = 297.96𝑔/𝑚𝑙
𝑚𝑙 0,5𝑔

9
6. Métodos no colorimétricos usados para
determinar la concentración de glucosa en
diferentes matrices biológicas
La determinación cuantitativa de glucosa en
sangre ha preocupado a muchos químicos Métodos enzimáticos: son los más utilizados,
clínicos desde hace muchos años. Por tratarse utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa
de un análisis rutinario, con frecuencia de oxidasa, hexoquinasa) a fin de aumentar la
informe urgente y ante la necesidad de ofrecer especificidad. Los dos métodos que vamos a
resultados exactos y precisos a través de citar se pueden utilizar para determinar la
procedimientos sencillos, rápidos y glucosa en muestras de suero, orina y líquido
económicos, nos dimos a la tarea de estudiar cefalorraquídeo.
el método de la O-toluidina, cuyas bondades
mencionadas en la literatura lo señalan como
Método de la hexoquinasa: Es el método de
método de elección para cualquier laboratorio.
referencia y consiste en dos reacciones
La utilización de la O-toluidina en la
acopladas.
determinación de aldosacáridos en un medio
de ácido acético, fue establecido como método
rutinario por Hultman, procedimiento que ha
sido modificado por varios autores y utilizado
en métodos manuales y automáticos. Se
fundamenta el procedimiento en una reacción
de condensación de la glucosa y aminas
aromáticas primarias en un medio de ácido
acético glacial, según la siguiente secuencia de
reacciones: En la primera reacción (específica), catalizada
por la enzima hexoquinasa, se fosforila la
glucosa formándose glucosa 6-fosfato. La
glucosa 6-fosfato, en una reacción posterior
(reacción indicadora), se transforma en 6-
fosfogluconato produciéndose NADPH (1 mol
por cada molécula de glucosa). La producción
El producto coloreado final es el resultado de de NADPH origina un aumento de
la reacción de la O-to1uidina con la glucosa, absorbancia a 340nm. El incremento de
formándose gIucosilamina y la absorbancia a esta longitud de onda será
correspondiente base de Schiff. Este producto directamente proporcional a la concentración
coloreado tiene un máximo de absorción de de glucosa.
625 a 635 nm (1), cuya densidad óptica se
incrementa proporcionalmente de acuerdo con
la ley de Beer-Lambert entre una amplia gama Método de la glucosa oxidasa: Al igual que el
de concentraciones (O a 500 mg/dl en nuestro anterior consiste en dos reacciones acopladas
laboratorio), sin embargo, se recomienda leer
el producto coloreado final entre 0.1 a 1.0 de
absorbancia.

1
En la primera reacción (reacción específica), [Link]
catalizada por la enzima glucosa oxidasa [1]- Del Valle Mendoza, J. & Cornejo
(GOD), se oxida la glucosa y se genera H2O2. Tapia, Á. (2014, 6 febrero). Bioquímica,
En la segunda reacción (reacción indicadora), Biología Cecular y Molecular II (ME67),
la enzima peroxidasa (POD) cataliza la
guía de prácticas, 2014-I. Universidad
descomposición del H2O2 lo que provoca
Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC).
oxidación de un cromógeno que pasa de su
forma reducida (incolora) a su forma oxidada [Link]
(coloreada). La aparición del cromógeno tstream/handle/10757/320255/LFCCSS-C-
oxidado se evalúa mediante un 01-
espectrofotómetro y será directamente F04+gu%EDa+de+practica+de+laboratori
proporcional a la concentración de glucosa en o+Bioquimica+Biologia+Celular+y+Mole
la muestra. Este método (GOD/POD) presenta cular+[Link];jsessionid=24F55AF188F332
como desventaja que muchos compuestos 2DA2CBA1684E0DCA31?sequence=1
presentes en el suero u orina (bilirrubina,
ácido ascórbico y ácido úrico) pueden ser
oxidados por el H2O2 producido en la [2]- Rosquete López, Dra. G., González
reacción catalizada por la enzima GOD y por Vidal, Dra. E., Londres Frómeta, Dr. D. &
tanto interfieren en el resultado (se da un Manzano Arroyo, Dr. V. (2006, 20
resultado superior al real). También se puede noviembre). Evaluation of glycemia by the
cuantificar la concentración de glucosa de la o-toluidine method. Scielo. Recuperado 22
muestra utilizando sólo la primera reacción y
de septiembre de 24d. C., de
evaluando la cantidad de oxígeno consumido
[Link]
mediante un electrodo de oxígeno (lo
estudiaremos más adelante). La cantidad de rttext&pid=S1025-
glucosa en la muestra es directamente 02552007000200005#:~:text=Los%20m%
proporcional a la cantidad de oxígeno C3%A9todos%20enzim%C3%A1ticos%2 C
consumido %20catalizan%20la,glucosa%20oxidasa
%20y%20la%20hexoquinasa

4. CONCLUSIÓN
[3]-Azúcar: Alimento para el cáncer. (2020,
Haciendo respectivo análisis sobre las 4febrero). Books on Demand.
muestras de jarabe de maple y miel. por
método enzimático fotocolorimétrico
obtuvimos que el jarabe de maple tiene un
22,88% de glucosa y la miel de abeja tiene
57,5% de glucosa. Los errores no se
pudieron realizar por la falta de valor
teórico para hacer la respectiva
comparación.