Bioquímica

Informe de laboratorio
Práctica N. 6

1 IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Acho Orozco Brayan Giovanni1, Torres Marulanda Diego Fernando 2, Fitatá Castaño Joan Sebastián3
1. Resumen (summary).
La cromatografía en capa fina, es un método físico de identificación y separación de mezclas
complejas. Su aplicación se extiende en distintas ramas de la ciencia y en medicina. Es una técnica
basada en el principio de retención selectiva, donde se separan los distintos componentes de una
mezcla. Permitiendo determinar las propiedades de la sustancia evaluada. Específicamente, la
cromatografía en capa fina es la técnica más empleada. Comprende dos fases, la fase estacionaria
consiste de un gel de celulosa, sílica, óxido de aluminio, etc. La separación se efectúa dado las
distintas afinidades de adsorción de los componentes de la muestra hacia la superficie de la placa
cromatográfica o fase estacionaria. La fuerza con la que es adsorbido un componente dependerá
de la polaridad de los componentes, de la actividad del adsorbente que conforma la fase
estacionaria y de la polaridad de la fase móvil. El objetivo de esta práctica fue realizar el
aislamiento de distintos aminoácidos puros frente a una muestra proteica. Los resultados fueron
positivos, encontrando valores para cada aminoácido respecto a los valores teóricos esperados.
Adicionalmente una revelación con ninhidrina permitió ver el desplazamiento de las muestras. Las
diferentes longitudes de onda evidenciaron el movimiento de las muestras. Esta técnica
demuestra ser efectiva, de fácil aplicación y gran importancia en el campo de la salud. Ya que uno
de sus usos en bioquímica clínica es determinar aminoácidos o metabolitos de importancia
medicinal y farmacéutica.
Thin layer chromatography is a physical method of identification and separation of complex
mixtures. Its application extends to different branches of science and medicine. It is a technique
based on the principle of selective retention, where the different components of a mixture are
separated. Allowing to determine the properties of the evaluated substance. Specifically, thin layer
chromatography is the most widely used technique. It comprises two phases, the stationary phase
consists of a gel of cellulose, silica, aluminum oxide, etc. The separation is carried out given the
different adsorption affinities of the sample components towards the surface of the
chromatographic plate or stationary phase. The strength with which a component is adsorbed will
depend on the polarity of the components, the activity of the adsorbent that makes up the
stationary phase, and the polarity of the mobile phase. The objective of this practice was to isolate
different pure amino acids from a protein sample. The results were positive, finding values for
each amino acid with respect to the expected theoretical values. Additionally, a revelation with
ninhydrin allowed us to see the displacement of the samples. The different wavelengths evidenced
the movement of the samples. This technique proves to be effective, easy to apply and of great
importance in the field of health. Since one of its uses in clinical biochemistry is to determine
amino acids or metabolites of medicinal and pharmaceutical importance.
2. Palabras clave (keywords).
Cromatografía, identificación, medicina, polaridad, farmacéutica.
Chromatography, identification, medicine, polarity, pharmaceutical.

1 Estudiante de regencia de farmacia, código 136104604, email bgacho@[Link]

2 Estudiante de regencia de farmacia, código 136104603, email [Link]@[Link]
3 Estudiante de regencia de farmacia, código 136104601, email jsfitata@[Link]
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3. Objetivos.

 Separar e identificar los aminoácidos presentes en una muestra problema mediante el uso
de cromatografía en placa fina y/o papel.

 Caracterizar los productos obtenidos mediante la cromatografía.

4. Marco teórico.

Figura 1. Mapa conceptual sobre los aspectos relevantes de la cromatografía y cromatografía en

capa fina.
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Figura 2. Diagramas de flujo del retención (Figura. 4). Donde a distancia

procedimiento en laboratorio recorrida por la sustancia es dividida por la
5. Resultados. distancia recorrida por el eluyente.

5.1. Mediciones

Figura 3. Desplazamiento en cámara

cromatográfica. De izquierda a derecha los
puntos señalados corresponden a los
aminoácidos a) Alanina, b) Fenilalanina, c)
Figura 4. Relación esperada para el factor de
Arginina y d) Muestra problema (suplemento
retención en función de la polaridad.
dietario Ensure).
Aquellos aminoácidos más polares tendrán
Hay una relación directamente proporcional un mayor factor de retención. La unidad de
entre la polaridad y el orden de elusión, medida para esta ecuación es en
teóricamente la Figura 4 representa la forma centímetros.
correcta de interpretar los resultados. Esta
relación es medible a través del factor de
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Generalmente la placa cromatográfica posee por tres grupos metil y tres grupos amino. El
una menor polaridad que la solución, por último grupo amino perteneciente a la
este sencillo hecho, las muestras evaluadas cadena lateral no cuenta con los 3
que tengas una mayor polaridad o afinidad hidrógenos en sus enlaces. Estos grupos
con el eluyente, permanecerán más cerca de aminos, sumado al de su estructura básica
la base. Mientras que las soluciones menos por sus cargas, hacen que sea un aminoácido
polares, estarán más alejadas de la solución y positivo muy polar. Esto indica que los
ascenderán por la placa cromatográfica. resultados son concordantes con la teoría
(Carey, 2002).

Teniendo en cuenta la relación de longitud

recorrida por las muestras fijadas en la placa Tabla 1. Distribución de los aminoácidos en
cromatográfica se determinó su factor de placa cromatográfica.
retención (Rf) (Tabla. 1). Donde se obtuvo un
resultado coherente con las aproximaciones Aminoácido Distancia Rf
teóricas. Ya que, la alanina (Rf: 0,33) y Recorrida
fenilalanina (Rf:0,31) se encuentran dentro (cm)
de los aminoácidos pertenecientes al grupo
1, con características hidrofóbicas. Esto Alanina 2,1 0,33
implica un determinado coeficiente de
repelencia de las sustancias polares (Carey, Fenilalanina 2 0,3076
2002).
Arginina 3,1 0,4769
Los aminoácidos de este grupo poseen
grupos alifáticos o aromáticos y, por Ensure 3,7 0,5692
consiguiente, son hidrofóbicos. Dado que
estas cadenas son en su mayoría
hidrocarbonadas (Figura. 5), su reactividad
química es menor. Debido a su conformación
en medio acuoso, las proteínas disueltas se
pliegan en forma tridimensional que oculta
en su interior los residuos hidrofóbicos de los
aminoácidos de este grupo (Carey, 2002).
Respecto a la arginina (Rf: 0,47), fue el
aminoácido con un mayor factor de
retención.
El aminoácido arginina es de carácter básico,
se encuentra dentro del grupo IV, los cuales
poseen características de polares, son
hidrofílicos, ya que se encuentran en
constante contacto en solución acuosa. La Figura 5. Aminoácidos empleados para la
arginina en su estructura básica está determinación cromatográfica. De arriba
conformada por el grupo amino, el grupo hacia abajo a) Fenilalanina, b) Alanina, c)
carboxilo y el hidrógeno. En su cadena Arginina. Se observa la estructura química
radical, está compuesta casi estrictamente correspondiente, la cadena carbonada
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confiere características relacionadas con su reducción del reactivo (ninhidrina) a

polaridad. hidrindantina (Figura 7).
Alanina es un aminoácido no esencial de
carácter hidrofóbico. Es el aminoácido más
pequeño después de la glicina. El aminoácido
arginina también hace parte de los
aminoácidos no esenciales. Este aminoácido
se encuentra involucrado en muchas
actividades a nivel de las glándulas
endocrinas (Torres et al., 2017). Figura 7. Reacción esperada de la ninhidrina
Por otra parte, la fenilalanina es uno de los en presencia de aminoácidos, con grupo
aminoácidos esenciales. No puede ser amino libre.
sintetizado por el cuerpo y por ende debe ser
incluido a través de la dieta. La Arginina
posee un componente relacionado con la La mayor parte de las placas cromatográficas
síntesis de precursores medicinales (Mote et llevan un indicador fluorescente que permite
al., 2008. la visualización de los compuestos activos a
la luz ultravioleta (254 nm). El indicador
adsorbe la luz UV y emite luz visible. La
presencia de un compuesto activo en el UV
evita que el indicador adsorba la luz en la
zona en la que se encuentra el producto, y el
resultado es la visualización de una mancha
en la placa que indica la presencia de un
compuesto. En el caso de compuestos que
.
no adsorben luz UV, la visualización del
Figura 6. Placas cromatográficas en cámara cromatograma requiere utilizar un agente
de revelación. La figura 6a, está siendo revelador como la ninhidrina. Este tiene que
irradiada a una longitud de onda con un valor reaccionar con los productos adsorbidos
de 366 nm y la figura 6b, refleja la proporcionando compuestos coloreados
fluorescencia de las placas cromatográficas a (Carey, 2002).
una longitud de onda de 254 nm.

6. Análisis de resultados.
En todos los métodos colorimétricos, los
aminoácidos reaccionan con otro compuesto
Es conocido que la cromatografía en capa
formando derivados coloreados que se
fina (TLC) por sus siglas en inglés. Es un
pueden determinar por espectroscopia
procedimiento en el cual una fase móvil
visible. La reacción con la ninhidrina (hidrato
avanza a través de una fase estacionaria por
de tricetohidrindeno) reacciona con
capilaridad. En algunos casos con ayuda de la
aminoácidos que contengan el grupo amino
gravedad o de un potencial eléctrico, siendo
libre, dando lugar a la formación de
esta una división de la cromatografía plana
amoniaco y anhídrido carbónico, con
(Skoog D & et al., 2005). En la tabla 1, se
observan las distancias recorridas por los
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distintos aminoácidos en la capa estacionaria dar un compuesto de adición doble que

de sílica gel. Placa empleada para separar presenta coloración azul-púrpura. Con la
sustancias polares (alcoholes, aminas, ácidos excepción del aminoácido prolina, el cual da
carboxílicos). El proceso se da por medio de una coloración amarillenta, esto debido a
interacciones intermoleculares de tipo que el grupo amino de este aminoácido está
dipolo-dipolo (Solarez A, 2009). Se utilizó sustituido por una amina secundaria dada su
una mezcla de butanol, ácido acético y agua conformación estructural cíclica (Jorrín J.,
como eluyente. Se emplean generalmente Díaz N. & Barcena J., 2013).
disolventes con características de puntos de
ebullición y viscosidad, lo que les permite En la tabla 1, se observan los valores Rf
obtenidos, la alanina posee un valor
moverse con rapidez (Solarez A, 2009).
hidropático de 1.8, la fenilalanina un valor de
El Rf se puede explicar con base en la 2.8, la arginina un valor hidropático de -4.5.
competencia que se establece entre el soluto Por otra parte, la muestra problema no
a separar y la fase móvil por adsorberse a los cuenta con una estimación teórica para esta
centros activos polares de la fase característica de polaridad. En la figura 3, se
estacionaria. Así, las moléculas de soluto se observa la migración desde el punto de
encuentran adsorbidas en la fase fijación, la cual puede ser explicada por las
estacionaria y a medida que se produce la cadenas laterales de hidrocarburo presentes
elución van siendo desplazadas por la fase en cada aminoácido (Figura. 5). La alanina
móvil. La retención y selectividad en la contiene tres átomos de carbono, la
separación dependen de los valores fenilalanina como su nombre lo indica, es un
respectivos de las constantes de los grupo fenilo pegado a la alanina, la arginina
diferentes equilibrios químicos que tienen por su parte contiene un grupo guanidinio
lugar. Los cuales están dados en función de unido al esqueleto de cinco carbonos del
la polaridad (Carey, 2002). aminoácido. La arginina por su conformación
estructural, es el único aminoácido con la
Los solutos más polares quedarán más capacidad de ser precursor en la síntesis de
retenidos puesto que no se adsorben farmacóforos de importancia en química
firmemente a los centros activos de la fase medicinal.
estacionaria, mientras que los no polares se
eluyen con mayor facilidad. Las condiciones La sílica gel es un compuesto polar con un pH
cromatográficas tal como: adsorbente, de 4,5 aproximadamente. La mezcla
disolvente, tamaño de la cámara eluyente, que cumple su función
cromatográfica, temperatura entre otras transportadora posee tres sustancias polares
variables ambientales. Reúnen un conjunto (butanol, ácido acético y agua) con una
de elementos que dificultan la reproducción constante dieléctrica alta, aproximadamente
experimental teórica. 82, por estar en solución con el agua. Cabe
resaltar que son disolventes polares próticos.
Posteriormente se revelaron los aminoácidos Con una alta concentración de protones (H+),
con ninhidrina, la cual reacciona con ácidos y por lo tanto pueden formar puentes
aminoácidos que tengan el grupo amino de hidrógeno con los solutos (Meyyanathan,
libre, dando lugar a la formación de Ramasarma & Suresh, 2004). Al iluminar las
amoniaco y anhídrido carbónico, placas cromatográficas con luz ultravioleta
reduciéndose a hidrindantina. La (Figura. 6). Se observa una línea de puntos a
hidrindantina reacciona a su vez con el lo largo de la placa, lo cual sugiere varios
amoniaco y otra molécula de ninhidrina para
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aspectos: a). En primer lugar, que la muestra afinidad que tenga el compuesto con la fase
del soluto era una mezcla y uno una solución estacionaria y la fase móvil.
pura, b). Otra posible explicación es que,
durante la aplicación capilar del soluto se La muestra desconocida presenta un factor
de retención mayor a los aminoácidos. Su
contaminaron las muestras, c). Sucede en
algunos casos que el eluyente queda composición sugiere ser polar y con carga
positiva.
demasiado cerca de la aplicación capilar y se
mezclan los solutos, d). Otro aspecto
relevante fue el tiempo de exposición de las
muestras dentro de la placa, en la figura 5, se 8. Bibliografía.
observa la distancia recorrida por las
soluciones. Las cuales no alcanzan a llegar al Torres, D. G., González, M. F. C., Morales, R.
extremo superior de la placa cromatográfica, C., Rodríguez, M. B., & Arteaga, I. R. (2017).
e). Finalmente, la muestra evaluada Tejido adiposo como glándula endocrina.
correspondiente a la placa cromatográfica b Implicaciones fisiopatológicas. Revista de
de la figura 6. Refleja una mayor dispersión Enfermedades no Transmisibles Finlay, 7(1),
de puntos dado que es una mezcla de 131-151.
proteínas diseñada como suplemento
dietario. Meyyanathan, S. N., Ramasarma, G. V. S., &
Suresh, B. (2004). Análisis de la simvastatina
Dentro de las aplicaciones que tiene esta en preparaciones farmacéuticas mediante
técnica destaca, el reconocimiento de cromatografía de capa fina de alto
sustancias; particularmente metabolitos rendimiento. Ars Pharmaceutica (Internet),
importantes en la síntesis de medicamentos 45(2), 121-129.
(Ortiz & Sánchez, 2019). En recientes
publicaciones, Ramírez y colaboradores en el Ortiz Ascanio, E. A., & Sánchez, S. D. (2019).
2015, emplearon el método de Descripción del uso tradicional de plantas
cromatografía de capa fina, para la medicinales en el mercado del municipio de
identificación de metabolitos y sustancias de Sardinata, norte de Santander durante el
acción microbiana en plantas medicinales. primer semestre del 2019.
Finalmente, exámenes medicinales y
Ramírez Salcedo, H. E., Virgen-Calleros, G.,
toxicológicos utilizan las características del
Vargas-Radillo, J. D. J., Salcedo-Pérez, E., &
método cromatográfico, para lograr un
Barrientos-Ramírez, L. (2015). Actividad
aislamiento y purificación a partir de mezclas
antimicrobiana in vitro de extractos de hoja
complejas como son los preparados de
de Guazuma ulmifolia Lam. contra
cualquier material biológico (Viardell, 1970).
fitopatógenos. Revista mexicana de ciencias
forestales, 6(27), 114-124.
7. Conclusiones Carey, F. A. (2002). Química orgánica (No.
547 C188q Ej. 1). McGraw-Hill.
El eluente asciende por capilaridad en la Skoog D., West D., Holler F. & Crouch S.
(2005). Fundamentos de Química Analítica
cromatoplaca moviendo los distintos 8ª. Edición. México D.F.: Thompson.
compuestos presentes en la misma. Solares A. (2009). Cromatografía en
capafina. México D.F.: UNAM.
La movilidad de los compuestos en la
cromatoplaca se verá afectada por la
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Jorrín J., Díaz N. & Barcena J. (2013).

Separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina y detección
mediante reacción de ninhidrina. Rabanales:
Reverté
Vilardell, A. C. (1970). Estudio de los lípidos
humorales y tisulares mediante
cromatografía en capa fina: I. Métodos
cromatográficos. In Anales de medicina y
cirugía (pp. 247-258).