Ensayo potencial

bioquímico metanogénico
Una metodología clave para conocer
la energía de las biomasas

Patricia Bres
María Eugenia Beily
Diana Crespo

INTA Ediciones
2022
 620.91 Bres, Patricia
B75 Ensayo potencial bioquímico metanogénico : una metodología clave para
conocer la energía de las biomasas / Patricia Bres, María Eugenia Beily,
Diana Crespo. – Buenos Aires : Ediciones INTA, 2022.
58 p. : il. (en PDF)

ISBN 978-987-679-321-6 (digital)

i. Beily, María Eugenia. ii. Crespo, Diana. iii. título

BIOMASA – METANO – BACTERIA METANOGENA – ENERGIA – BIOGAS – ANALISIS BIOQUIMICO

DD-INTA

Este documento es el resultado del financiamiento otorgado por el Estado Nacional, por lo tanto,
queda sujeto al cumplimiento de la Ley N°26.899.

Este documento ha sido elaborado a través de las adquisición de experiencias, capacitaciones y desa-
rrollos tecnológicos financiados por el Proyecto Específico “Tecnologías y Estrategias de Gestión de
Residuos y Efluentes en Sistemas Agropecuarios y Agroindustriales” (PNNAT 1128042) del Programa
Nacional de Recursos Naturales, Gestión Ambiental y Ecorregiones (cartera INTA 2013-2019), logrando
ser un producto finalizado para su publicación a través del Proyecto Estructural “Bioenergía generada en
origen como aporte al desarrollo territorial” (INTA PE-E7-I149-001) del Programa Nacional de Agroindus-
tria, Valor Agregado y Bioenergía (cartera INTA 2019-2023), y a través del proyecto Internacional H2020-
FERTIMANURE mediante fondos de la carta acuerdo CA INTA-FA (Fundación ArgenINTA), coordinado por
la Ing. Agr. Diana Crespo.
Se agradece al Dr. Mauricio Passeggi por su dedicación en la revisión de este trabajo, donde sus aportes y
contribuciones brindaron mejoras significativas a este manual técnico. Mauricio es investigador docente
de la Universidad de la Republica del Uruguay y tiene una amplia experiencia en investigación aplicada en la
ingeniería de reactores de procesos anaeróbicos. También los autores agradecen a todo el grupo BIOPROA
y en particular a la Dra Liliana Borzacconi, y Mauricio quienes siempre nos han asesorado, capacitado y
brindado un apoyo incondicional para el desarrollo metodológico de este ensayo, promoviendo nuestro
crecimiento profesional y del laboratorio en esta área temática.

Ilustraciones: Diana Stilinovic

Diseño y diagramación: Julia Gouffier
Revisor: Dr. Mauricio Passeggi. Universidad de la República del Uruguay. Facultad de Ingeniería. Insti-
tuto de Ingeniería Química. Área de Biotecnología de Procesos para el Ambiente (BIOPROA)

Este libro
cuenta con licencia::
 Autores

Patricia Alina Bres

Doctora en Ciencia y Tecnología, mención Química (UNSAM). Trabaja en el Instituto de
Microbiología y Zoología Agrícola (IMYZA) del Instituto Nacional de Tecnología Agro-
pecuaria (INTA) desde el año 2005. Desde el inicio en su carrera como investigadora
participó en proyectos nacionales e internacionales sobre la degradación anaeróbica de
residuos agropecuarios y agroindustriales. Su especialización es el análisis integral de
la tecnología anaeróbica, mediante la aplicación de herramientas y metodologías que
conduzcan a la optimización del proceso y a incrementar la eficiencia de los productos
transformados (biogás y digerido).

María Eugenia Beily

Licenciada en Ciencias Ambientales (USAL), Especialista y Magister en Gestión Am-
biental (ITBA). Ingresó en el año 2006 al Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola
(IMYZA) del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Desde el inicio de su
carrera como investigadora participa en proyectos nacionales e internacionales sobre
caracterización y tratamiento de efluentes y residuos agropecuarios y agroindustriales.
Se especializa en el análisis y tratamiento de efluentes porcinos, la aplicación de meto-
dologías para la optimización del proceso anaerobio y la evaluación y tratamiento de los
digeridos. Ha dirigido tesinas de grado y tesis de maestría en la temática y es titular de
la cátedra de procesos anaerobios de la Maestría en Ingeniería Sanitaria de la Facultad
de Ingeniería de la Universidad de Buenos Aires (FIUBA).

Diana Cristina Crespo

Ingeniera Agrónoma (FAUBA). Trabaja en el Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola
(IMYZA) del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) desde el año 1984 y es
profesional principal de CONICET. Creó la primera Biofábrica del país para la producción
industrial de insectos benéficos destinada al control de la plaga mosca doméstica. Se

3
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

especializó en tecnologías para el tratamiento de residuos y efluentes orgánicos median-

te el compostaje, la lombricultura y la digestión anaeróbica. Participó en el armado de 8
plantas de tratamiento de residuos sólidos municipales y dirigió la primera planta piloto de
digestión anaeróbica en el INTA para el tratamiento de los residuos orgánicos domésticos
generados dentro del predio. Crea en el año 2004 el Laboratorio de Transformación de los
Residuos (LTR) y es jefa de grupo. Desde sus inicios ha dirigido 10 proyectos nacionales y
6 internacionales. Dirigió más de 80 convenios, cartas acuerdo y CVT I&D con el sector pri-
vado, municipios y empresas. Ha ocupado cargos docentes de grado y posgrado en distin-
tas universidades y ha dictado cursos de grado y posgrado nacionales e internacionales.

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 Índice

Prólogo 8

FACTORES, CONDICIONES OPERATIVAS Y AMBIENTALES

1 DEL ENSAYO POTENCIAL BIOQUÍMICO METANOGÉNICO

Sustrato 10
Caracterización del sustrato 10
Preparación y almacenamiento 13
Concentración del sustrato 14
Resumen 15

Inóculo 15
Naturaleza y caracterización del inóculo 15
Preparación y almacenamiento 17
Concentración del inóculo 19
Resumen 19

Condiciones operativas 20
Agitación y temperatura 20
Blanco y control 21
Cámara de gas 22
Nutrientes 23
pH y alcalinidad 24

5
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Relación entre el sustrato y el inóculo 24

Condiciones anaeróbicas 25
Resumen 25

Condiciones experimentales 26
Métodos de medición del biogás 26
Método manométrico 27
Método volumétrico por desplazamiento 27
Método volumétrico por jeringa 28
Caudalímetro 29
Métodos de medición del metano 29
Resumen 29
Frecuencia de muestreo y duración del ensayo 32

Tipos de métodos para la determinación del PBM 33

Métodos experimentales convencionales 33
Métodos experimentales automáticos 33
Método predictivo por espectrofotometría 33
Métodos teóricos 34

Interpretación de los datos e informe 36

MODELO EXPERIMENTAL DEL ENSAYO DE POTENCIAL

2 BIOQUÍMICO METANOGÉNICO

Preparación y diseño experimental 39

Diseño de reactores 39

Disponibilidad del sustrato y del inóculo 43

Sustrato 43
Inóculo 43

Cálculos previos 44

6
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Procedimiento y seguimiento del ensayo 45

Procedimiento 45
Seguimiento del ensayo 46

Análisis y reporte de los resultados 47

Registro y análisis de datos. Cálculos 47
Validación del ensayo e informe de los resultados 51

Bibliografía 52

Abreviaturas 57

7
 Prólogo

A nivel mundial, el ensayo del Potencial Bioquímico Metanogénico (PBM) resulta ser
una herramienta clave para definir la factibilidad técnica de una planta de biogás, ya que
permite cuantificar la máxima producción de metano para un determinado residuo de in-
terés. A pesar de su importancia, existe una amplia variabilidad metodológica, que genera
incertidumbres y complejiza la comparación e interpretación de los resultados. En este
documento se volcó la información actualizada sobre los factores, condiciones operativas
y ambientales que influyen y deben ser consideradas durante el desarrollo del ensayo. Con-
siderando estos conceptos y en función a lo reportado por los más prestigiosos investi-
gadores que desarrollan este ensayo, el Laboratorio de Transformación de Residuos (LTR)
perteneciente al Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMYZA-INTA) generó un
diseño propio de reactores anaeróbicos y realizó el ajuste metodológico para este ensayo.
Actualmente se registran más de 30 ensayos realizados con diferentes tipos de biomasas,
sostenidos con reportes científicos, tesis de maestrías y doctorados, enmarcados en los
proyectos INTA (PNNAT 1128042 y PE-I149) y el proyecto internacional H2020-FERTIMA-
NURE (Carta Acuerdo INTA- Fundación ArgenINTA (FA), SA 27617).
Durante los últimos años se incrementaron las plantas de biogás en todo el país,
debido principalmente a la implementación del Plan RenovAR (Ministerio de Energía). El
crecimiento de esta tecnología generó un incremento en la demanda y el interés para la
puesta en valor de esta herramienta clave. Esto impulsó a este equipo de trabajo INTA a
generar un documento que contiene las consideraciones y recomendaciones que le ser-
virán al lector como una guía para poder cuantificar el PBM y para que, a futuro, las auto-
ridades regulatorias puedan normalizar y estandarizar esta metodología a nivel nacional.

Ing. Agr. Diana Crespo

Jefa de Grupo del LTR
Coord. P H2020-Fertimanure
(CA INTA-FA 27617)
IMyZA- CICVyA- CNIA- INTA

8
 1
Factores, condiciones operativas y ambientales
del ensayo Potencial Bioquímico Metanogénico

El potencial de producción de metano es comúnmente evaluado mediante un ensayo

llamado Potencial Bioquímico Metanogénico (PBM) o en inglés como Biochemical Me-
thane Potential (BMP). El PBM permite determinar la máxima cantidad de metano pro-
ducido por gramo de biomasa y la cinética de producción, bajo condiciones controladas
de laboratorio, en reactores en batch (Lesteur et al., 2010). El PBM se calcula como la
máxima cantidad de metano acumulada en el período ensayado, dividida por la cantidad
de masa de sustrato agregada, expresado comúnmente como mL de CH4/gDQO o gSV.
A partir de este mismo ensayo se puede determinar también la biodegradabilidad,
que es una medida de la fracción de la materia orgánica que puede transformarse en
biogás en un proceso de digestión anaeróbica. Se puede estimar como la fracción de
la Demanda Química de Oxígeno (DQO) de la muestra que es metanizada. También
se puede expresar la biodegradabilidad como la fracción de los sólidos volátiles (SV)
de la muestra que es gasificada (Labatut et al., 2011). Ambas expresiones adquieren
valores distintos, por lo que es imprescindible clarificar en cada caso si la biodegra-
dabilidad está expresada en términos de DQO o en términos de SV. Cada expresión de
biodegradabilidad tiene una utilidad distinta en el diseño y operación de las plantas de
digestión anaeróbica.
Este tipo de ensayo se lleva a cabo como factibilidad técnica y económica a priori
de la implementación de plantas de biogás, permitiendo estimar el balance energético,
condiciones operativas, el tamaño de los reactores y otros equipamientos (Holliger et al.,
2016). Dentro de sus múltiples aplicaciones, el ensayo de PBM comúnmente se utiliza
para: a- determinar la biodegradabilidad anaeróbica y la máxima producción de metano
(o potencial energético) de residuos orgánicos; b- evaluar el efecto de la codigestión de
diferentes sustratos y definir la relación óptima entre el sustrato y el cosustrato; c- deter-
minar la cinética de degradación, que mediante el uso de diferentes modelos matemá-
ticos, permite predecir el funcionamiento de digestores a escala real; d- determinar va-
riables de diseño y parámetros operativos para el escalamiento (scalling up); e- Evaluar
sustancias inhibitorias del proceso anaeróbico (Tabatabaei & Ghanavati, 2018).

9
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

El ensayo consiste en incubar una pequeña cantidad de residuo (sustrato) con un

inóculo anaeróbico y medir el volumen de biogás y metano generado en el tiempo. La
primera propuesta metodológica fue desarrollada por Owen et al. (1979) y desde enton-
ces fue una metodología ampliamente utilizada, incrementándose su aplicabilidad con
los años. En la actualidad existe un gran número de trabajos en la comunidad científica
que han desarrollado y adoptado este ensayo para determinar el potencial metanogéni-
co de diferentes sustratos. A pesar de que una gran masa de datos ha sido generada,
la comparación entre los datos de biodegradabilidad y rendimientos reportados resulta
difícil. Esto es debido a la gran variabilidad de equipamiento y a los diferentes protocolos
y condiciones ambientales que son utilizados. Existen protocolos estandarizados de en-
sayos de biodegradabilidad anaeróbica para compuestos químicos, plásticos y sustra-
tos orgánicos complejos como los son los residuos sólidos (normas ISO 15985 (2004),
ASTM D 5511 (1994), VDI 4630 (2016), DIN 38414 TL8 (1985), entre otros), que difieren
todos ellos, principalmente, en el diseño experimental. La relación entre el sustrato y el
inóculo (S/I), concentración y tipo de inóculo, volumen de espacio de cabeza (headspa-
ce), nutrientes, sistema de detección del metano, varían entre los diferentes ensayos
(Angelidaki et al., 2009; Holliger et al., 2016).
En consideración, se presenta una revisión sobre los factores y condiciones que afectan
al desarrollo de este ensayo y que deben ser considerados para protocolizar la metodología.

Sustrato
Caracterización del sustrato
El tratamiento biológico de residuos sólidos orgánicos es altamente complejo. La
productividad metanogénica depende de la naturaleza del residuo, donde carbohidratos,
proteínas y grasas tienen diferente potencial metanogénico (Tabatabaei & Ghanavati,
2018). Otra característica importante es el contenido de lignina, celulosa y hemicelulosa,
debido a que estos compuestos son de baja biodegradabilidad anaeróbica y por lo tanto
tienen menor aporte al potencial metanogénico del residuo.
Los complejos compuestos orgánicos mencionados, se encuentran acompañados
en los residuos por cantidades variables de agua. El porcentaje en peso de agua en el
residuo fresco, habitualmente referida como humedad del residuo, es una variable deter-
minante del rendimiento de metano por metro cúbico o por tonelada de residuo.
Existen diferentes tipos de biomasas que pueden ser usadas como materia prima
para la producción de biogás: residuos industriales (efluentes de la industria papelera,
frigoríficos y mataderos), residuos agrícolas y forestales (marlo, cachaza), residuos ur-
banos (lodos cloacales, aguas residuales y la fracción orgánica de los residuos sólidos
urbanos (FORSU)) y residuos ganaderos (estiércoles, purines, camas). Estas diversas
biomasas tienen potencialidades energéticas y difieren significativamente en sus carac-

10
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

terísticas, las cuales influirán en el proceso degradativo anaeróbico y, consecuentemen-

te, en la producción y rendimiento de biogás y metano. Incluso se encuentran diferencias
significativas entre distintos lotes de residuos del mismo tipo, pero con distintas condi-
ciones de generación.
El estiércol animal es una de las materias primas más utilizadas para la digestión
anaeróbica. Las producciones ganaderas intensivas generan grandes cantidades de es-
tiércoles, los cuales son sustratos que pueden ser tratados por la digestión anaeróbica.
El guano generado por las aves es una mezcla del estiércol sólido con la orina, sien-
do ambas deyecciones liberadas por el mismo conducto del animal. En los mamíferos
(vaca, caballo, oveja y cerdo), el estiércol sale del tracto digestivo al exterior, mientras
que la orina, sale por las vías urinarias. El purín es la mezcla de estiércol y orina, donde
estas deyecciones caen en fosas comunes de recolección. La composición química, físi-
ca y microbiológica varía marcadamente en función de la especie (mono o poligástricos)
y la dieta consumida por el animal (Jingura & Kamusoko, 2017). El estiércol puede ser
rico en fibras, lignocelulosa, polisacáridos, proteínas y otros biomateriales.
En la Tabla 1 se muestra una comparación porcentual del contenido de proteínas,
fibras y lignocelulosas en distintos estiércoles animales y en sus diferentes sistemas y
etapas de producción.

Tabla 1
Composición de proteínas, fibras y lignocelulosa en estiércoles de animales
(% en peso seco)
  Proteína Fibra total Hemicelulosa Celulosa Lignina
Estiércol vacuno        
Tambo 18.1 52.6 12.2 27.4 13.0
De carne 12.1 51.5 17.4 21.9 12.2
Feedlot 17.0 41.7 21.4 14.2 6.1
Estiércol de cerdo
Maternidad 25.1 39.2 21.9 13.2 4.1
Recría 22.7 40.8 20.5 13.9 6.4
Terminación 22.0 39.1 20.4 13.3 5.4
Estiércol avícola          
Iniciación 39.8 31.7 18.3 8.5 4.9
Recría 48.4 36.4 21.5 7.7 7.2
Postura
31.6 34.5 20.2 12.0 2.3
(17-40 semanas)
Post-muda
28 31.2 16.4 10.7 4.1
(desplumaje)
Fuente: Jingura & Kamusoko (2017).

11
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Como puede observarse las concentraciones de estos compuestos pueden variar,

dependiendo principalmente, de la especie animal, el manejo y el sistema de produc-
ción en sus diferentes etapas. La composición del estiércol afecta de forma directa a la
producción de biogás y metano debido a la variabilidad que puede existir en cuanto a la
composición de compuestos de mayor o menor degradación biológica.
Otra materia prima ampliamente utilizada para la digestión anaeróbica es la fracción
orgánica de los residuos sólidos urbanos (FORSU). La FORSU representa en promedio
un 54 % del total en América Latina, donde la fracción predominante son los residuos
alimenticios, básicamente restos de comida y residuos de procesamiento de alimentos
(frutas, vegetales, huesos, grasas, aceites) (Graziani, 2018; Ye et al., 2015). Debido a su
composición, los residuos de alimentos tienen un alto potencial metanogénico (Strong
et al., 2016).
Numerosos cultivos han demostrado tener altos potenciales de producción de bio-
gás. Algunos cultivos de cereales, forraje y pasturas perennes, y otros cultivos no alimen-
ticios, muchas veces se utilizan como cosustratos para incrementar el rendimiento de
biogás (Braun et al., 2008; Corno et al., 2014; Jingura & Kamusoko, 2017; Navarro-Pineda
et al., 2016). Los residuos de varios cultivos (residuos agrícolas) como el algodón, maíz
y arroz han mostrado también tener un potencial bioquímico metanogénico y una bio-
degradabilidad inversamente proporcional a su contenido de lignina. Por ello, puede ser
conveniente pretratar los materiales con alto contenido de lignocelulosa para incremen-
tar el rendimiento de la producción de biogás.
Los lodos provenientes de las plantas de tratamiento de aguas residuales son otras
de las materias primas utilizadas para la generación de energía. Éstos son producidos
en grandes cantidades y representan un problema para su manejo y disposición final.
Comúnmente, son tratados por digestión anaeróbica debido a su alta biodegradabilidad.
Además de la composición química del sustrato (carbohidratos, proteínas, lípidos,
celulosa, hemicelulosa), otras características pueden afectar el potencial rendimiento de
biogás y metano, como ser presencia de metales pesados y otras sustancias inhibitorias
del proceso. En efecto, la caracterización del sustrato es muy importante porque permite
estimar su potencial teórico, ajustar variables operativas del ensayo y prever posibles
efectos inhibitorios.
El contenido de la materia orgánica del sustrato puede expresarse técnicamente por
los parámetros sólidos volátiles (SV) y demanda química de oxígeno (DQO). En general,
cuando la materia prima es líquida o semilíquida se utiliza la DQO y cuando es sólida se
utiliza el parámetro SV.
La producción de metano está directamente relacionada con la degradación de los
SV (Moody et al., 2009). El rendimiento de metano se incrementa cuanto mayor es el
contenido de SV y menor es el contenido de lignina (Gao et al., 2012; Liu et al., 2015).

12
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

La DQO es el equivalente de oxígeno, correspondiente a la cantidad de un oxidante

químico fuerte, que es demandado para la oxidación del contenido de materia orgánica
de una muestra (APHA, 1992). El rendimiento de metano teórico puede ser calculado
desde la DQO del sustrato.
La relación entre el carbono y el nitrógeno (C/N) en el sustrato es una variable impor-
tante para determinar, ya que puede afectar el desarrollo de las bacterias metanogéni-
cas. El rango óptimo de C/N es entre 20 y 30 (Tabatabaei & Ghanavati, 2018). Una baja
relación C/N implica que la materia prima es rica en proteína, resultando en altas con-
centraciones de amoníaco acuoso, el cual puede causar una inhibición a las metanogé-
nicas. Una alta relación C/N puede resultar en una deficiencia en nitrógeno, el cual puede
limitar el crecimiento de la biomasa microbiana y reducir la capacidad buffer del siste-
ma, conduciendo al desequilibrio del proceso degradativo anaeróbico y a su colapso.
La disponibilidad de nutrientes y micronutrientes es clave para el desarrollo de la pobla-
ción microbiana y en particular de la población metanogénica (Romero- Güiza et al., 2016). El
nitrógeno, fósforo y azufre son los elementos constitutivos más importantes de la biomasa
microbiana y por lo tanto deben estar disponibles para su desarrollo. No menos importante,
es la disponibilidad de micronutrientes tales como hierro, níquel, molibdeno y cobalto, entre
otros, ya que son elementos esenciales para la síntesis de enzimas específicas de la pobla-
ción metanogénica. Generalmente, pero no siempre, los residuos complejos contienen estos
micronutrientes en concentraciones suficientes para el desarrollo de los microorganismos.
Las materias primas pueden contener sustancias inhibitorias para la digestión anae-
róbica. Los inhibidores principales son el nitrógeno amoniacal (N-NH3), el sulfuro de hi-
drógeno (H2S) y los metales pesados. El N-NH3 libre es el principal inhibidor del proceso
que afecta a las metanogénicas. El sulfato es usado como aceptor de electrones de las
bacterias sulfato reductoras y debido a que la reducción de sulfato es energéticamente
más favorable que la producción de metano, las bacterias sulfato reductoras compiten
con las metanogénicas por sustratos. Además, el sulfato es convertido a sulfuro de hi-
drógeno, el cual es tóxico para las metanogénicas (Shayegan et al., 2005). Sustancias tó-
xicas tales como productos agroquímicos, desinfectantes y antibióticos podrían causar
efectos inhibitorios, debido a la presencia de altas concentraciones de metales pesados
o compuestos orgánicos (Jingura & Kamusoko, 2017).
Otro análisis que se utiliza para la caracterización de los residuos es la determina-
ción de la composición elemental del residuo: contenido de carbono (C), oxígeno (O),
hidrógeno (H), nitrógeno (N) y azufre (S). Esta información puede ser utilizada para esti-
mar el potencial bioquímico metanogénico teórico (Angelidaki et al., 2011).

Preparación y almacenamiento
La preparación del sustrato debe ser mínima para evitar cualquier tipo de alteración
de sus propiedades.

13
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

El tamaño del material puede afectar la cinética y la velocidad de producción del

biogás, debido a que influye en la superficie del sustrato disponible para la acción de los
microorganismos hidrolíticos, responsables de la solubilización del sustrato. Por eso,
el tamaño de la muestra es un parámetro muy importante que afecta, principalmente,
la velocidad de producción más que la determinación del máximo potencial de biogás.
Si bien esta variable no afecta directamente a la máxima producción de biogás o
metano, es importante asegurar un tamaño de partícula pequeño para una mayor homo-
geneidad del sustrato y una mayor reproducibilidad del ensayo de PBM (Angelidaki et
al., 2009). Además, los compuestos complejos con alta masa molecular necesitan ser
hidrolizados para una mayor accesibilidad. El ataque enzimático en la etapa hidrolítica
se ve favorecido cuanto mayor área superficial tenga la partícula (Lesteur et al., 2010)
Holliger et al. (2016) recomienda que las partículas tengan menos de 10 mm (como
diámetro o longitud). Sin embargo, a los efectos del ensayo del PBM el máximo tamaño
debe asegurar la representatividad de la muestra, la cual se manifestará en la reproduci-
bilidad de los resultados. Por lo tanto, el tamaño de partícula máximo dependerá en cada
caso de la heterogeneidad del residuo y del volumen de la muestra a procesar. Si no es
posible lograr una reproducibilidad aceptable con la muestra sin procesar, esta deberá
triturarse hasta obtener un tamaño de partícula máxima que garantice la reproducibili-
dad del muestreo, y por lo tanto resultados reproducibles.
El ensayo debería describir en detalle los pretratamientos o los pasos de preparación
de la muestra, como así también el tamaño del sustrato que se utilizará en el ensayo.
El sustrato debería ser utilizado lo más fresco posible. Si no será evaluado dentro de las
24 horas, puede ser almacenado a 4 °C por un tiempo no mayor a 5 días. Se recomienda
que se incremente de forma gradual la temperatura hasta alcanzar la temperatura ambien-
tal en la muestra, a priori de ser utilizada en el ensayo de PBM (Holliger et al., 2016).

Concentración del sustrato

La concentración del sustrato es uno de los parámetros más importantes para el
diseño de un ensayo de PBM. Algunos ensayos de PBM establecen una concentración
de sustrato entre el 2 y el 10 % de sólidos totales (ST) en el reactor para asegurar una
adecuada transferencia de masa (Raposo et al., 2012; V.D.I., 2006).
Un estudio realizado por Raposo et al. (2006) que evaluó diferentes concentracio-
nes de sustrato (maíz, a 5-15 gSV/L), mostró que el máximo potencial de metano se
logró con la concentración de 15 gSV/L. En esa misma línea de investigación, Wang et
al. (2015) sugirieron que existe una correlación entre la concentración del sustrato y el
potencial de metano en ensayos de PBM. Estos autores observaron que el PBM puede
ser subestimado si se usan concentraciones de sustrato bajas, recomendando que, para
obtener resultados más precisos, la concentración del sustrato debe mantenerse alta y

14
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

evitarse la dilución cuando la concentración es inferior a 10 g VS/L. Bajas concentracio-

nes de sustrato, están asociadas a una baja actividad metabólica de los microorganis-
mos y, consecuentemente, a bajas cantidades de biogás. Por el contrario, altas concen-
traciones de sustrato pueden conducir a situaciones de sobrecarga, debido a que los
compuestos intermedios como los ácidos grasos volátiles (AGV) pueden acumularse y
conducir a una inhibición en el proceso (Tanimu et al., 2014).
La mayoría de los ensayos de PBM son llevados a cabo fijando la relación entre el
sustrato y el inóculo (S/I), por lo que la cantidad de sustrato a agregar dependerá de esta
relación más que de la concentración.

Resumen
En el Diagrama 1, se muestra un resumen de todo lo expuesto anteriormente, relaciona-
do al sustrato: sus características, preparación y almacenamiento y sobre su concentración.

Diagrama 1
Resumen sobre la caracterización, la preparación, el almacenamiento
y la concentración del sustrato en un ensayo PBM

CARACTERIZACIÓN
• Materia seca o sólidos totales y contenido de humedad
• Sólidos volátiles, contenido de materia orgánica y de carbono
• Demanda Química de Oxígeno (DQO)
• Sustancias orgánicas (lípidos, proteínas, carbohidratos, lignina)
• Análisis elemental: carbono (C), oxígeno (O), hidrógeno (H), nitrógeno (N) y azufre (S)
• Nutrientes: fósforo magnesio y potasio
• Micronutrientes: hierro, níquel, molibdeno, cobalto, etc.

PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO
• Trituración y molienda para alcalzar un tamaño <10mm
• Almacenamiento del sustrato: a 4°C, no superior a 5 días

CANTIDAD O CONCENTRACIÓN
• < 10% de ST dentro del reactor
• Entre 10 y 15 gSV/L
• La cantidad de sustrato a agregar puede depender de la relación sustrato/inóculo

Inóculo
Naturaleza y caracterización del inóculo

La naturaleza del inóculo es una variable que puede afectar la determinación del
PBM. Los lodos anaeróbicos de plantas de tratamiento de aguas residuales son los

15
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

más recomendados y reportados como fuente de inóculo para este ensayo. También
pueden utilizarse los lodos de plantas de tratamiento de residuos agroindustriales y de
estiércoles (Angelidaki et al., 2011; Filer et al., 2019; Holliger et al., 2016; Raposo et al.,
2012). Sin embargo, se recomienda que el inóculo provenga de una planta de biogás
que procesa similares sustratos al residuo a evaluar (V.D.I., 2006). Si el residuo a eva-
luar es estiércol vacuno, entonces el inóculo deberá proceder de un reactor anaeróbico
que trate efluentes o estiércoles vacunos. De Vrieze et al. (2015) mostraron que los
lodos granulares maximizan el valor del PBM debido a que presentan mayor abundan-
cia metanogénica y una alta capacidad amortiguadora comparado con otros inóculos.
Los más utilizados son los lodos granulares provenientes de plantas de tratamiento de
cervecería (Koch et al., 2017).
Una forma de asegurar la actividad de las bacterias metanogénicas en el inóculo
es midiendo la actividad metanogénica específica (AME). Se considera una actividad
aceptable para un ensayo de PBM, utilizando acetato como sustrato patrón, superior a
0,1 gDQO/gSSV.d para lodos granulares. Si se utilizan lodos de tipo floculento o suspen-
didos, la actividad puede ser más baja (Angelidaki et al., 2009; Holliger et al., 2016).
Además de conocer su capacidad de producción, el inóculo debe ser caracteri-
zado en términos de biomasa la cual se determina mediante los análisis de SV o
sólidos suspendidos volátiles (SSV). La diferencia entre SV y SSV corresponde a
los SV disueltos, que pueden ser despreciables si se trata de un inóculo de alta con-
centración, como habitualmente ocurre. Si no fueran despreciables los SV disueltos,
sería más adecuada para la caracterización, la determinación de SSV mediante cen-
trifugación o filtrado.
El valor de SV no representa sólo el contenido de microorganismos, ya que no per-
mite diferenciar entre la biomasa microbiana y el material orgánico particulado en el
reactor. En especial, esto es evidente en los lodos provenientes de estiércoles, donde
el contenido de SV podría estar representado, en su mayor parte, por residuos lignoce-
lulolíticos recalcitrantes y no por biomasa microbiana activa, mientras que en los lodos
granulares, los SV consisten en la biomasa microbiana. Por otro lado, ambas metodo-
logías (SSV o SV) no permiten distinguir entre la biomasa viva o muerta (Angelidaki et
al., 2009; Raposo et al., 2012).
Para que un inóculo sea considerado de buena calidad y pueda utilizarse en un ensa-
yo de PBM, se recomienda los siguientes valores de parámetros operacionales (Tabla 2).
Además, existen disponibles diferentes metodologías avanzadas que permiten eva-
luar los consorcios microbianos en los inóculos anaeróbicos: hibridación fluorescente in
situ (FISH, por sus siglas en inglés), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante
(DGGE, por sus siglas en inglés), reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas
en inglés), entre las más importantes (Khan et al., 2018).

16
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Tabla 2
Características recomendadas del inóculo
Parámetro Unidad Rango recomendado
Actividad (AME) gDQO/gSSV.d >0,1
pH upH 7-8,5
AGV gCH3COOH/L <1
N-NH4 gN-NH4/L <2,5
Alcalinidad gCaCO3/L >1,5
Concentración gSV/L 15-20
Holliger et al., 2016

Preparación y almacenamiento
El inóculo debe ser utilizado lo antes posible luego del muestreo para evitar alterar
sus propiedades. Sin embargo, algunos inóculos pueden requerir una preparación previa,
como ser tamizado, dilución o preincubación. El tamizado por malla de 1-5 mm se reco-
mienda cuando existen ciertos materiales más gruesos e inertes. La dilución del inóculo
sólo deberá realizarse cuando el contenido de SV es muy alto, superior a 100 g/L.
La preincubación permite “desgasificar” el inóculo, eliminando la materia orgánica
biodegradable residual que pudiera existir (Angelidaki et al., 2009). Se recomienda
que la preincubación del inóculo se realice a la misma temperatura del ensayo de
PBM por un período no mayor a 4 días, debido a que un tiempo mayor de preincuba-
ción puede afectar la tasa inicial de producción de metano y desestimar el valor del
PBM, principalmente cuando las relaciones S/I de trabajo son bajas (Elbeshbishy et
al., 2012; Koch et al., 2019).
Elbeshbishy et al. (2012) estudió el efecto de la preincubación, utilizando inóculos
preincubados y no incubados. La preincubación de inóculos hasta que la tasa diaria es
inferior al 1 % de metano acumulado, produce la estabilización completa del inóculo, redu-
ciéndose significativamente las concentraciones de la biomasa activa (patogénica y no
patogénica). En este caso, cuando se adiciona el sustrato soluble y particulado al estudio
de PBM, las tasas de biodegradación al inicio del ensayo serán muy diferentes entre un
inóculo preincubado y uno sin incubación. Esto se debe a que durante la preincubación
los microorganismos que degradan los sustratos solubles (principalmente las acetogéni-
cas y metanogénicas) proliferarán, mientras que los otros grupos que hidrolizan y absor-
ben sustratos particulados se descomponen, afectando el equilibrio del consorcio micro-
biano. Sin embargo, cuando se realiza la adición de sustratos particulados y solubles en
los lodos no incubados, todos los grupos de microorganismos funcionan simultáneamen-
te como un digestor, aprovechando las sinergias entre los distintos grupos microbianos
para mantener el consorcio en equilibrio. Elbeshbishy y colaboradores concluyen que la

17
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

preincubación no presenta ventajas frente a correr un blanco (inóculo solamente) en el

ensayo. Por otro lado, la preincubación del inóculo puede incrementar las concentracio-
nes de amonio entre un 30-40 % más que el inoculo sin incubación previa.
El tiempo y temperatura de almacenamiento del inóculo también puede afectar los
resultados del ensayo PBM. Koch et al. (2019) evaluaron un inóculo fresco (dentro de
la hora de recolección) y el mismo inóculo almacenado durante 2 semanas a 4 °C y a
38 °C (temperatura de trabajo del ensayo de PBM). Los resultados mostraron que las
condiciones de almacenamiento tuvieron un impacto menor sobre las curvas del PBM
del sustrato. Sin embargo, sugirieron que mayores temperaturas y tiempos de almacena-
miento podrían tener un comportamiento diferente. Li et al. (2014) también estudiaron el
efecto del almacenamiento en el inóculo, utilizando diferentes sustratos. Sus resultados
demostraron que el inóculo fresco tuvo el mayor rendimiento de metano (498,3 mL/
gSV) y biodegradabilidad (87,7 %) con residuos de comida, comparado con el inóculo
almacenado a 2 meses (425 mL/gSV y 74,8 %) y 4 meses (394,6 mL/gSV y 69,4 %) a
temperatura ambiente. Hagen et al. (2015) almacenaron el inóculo a 20 °C por 11 meses
y encontraron una pérdida significativa de la performance con la celulosa.
Astals et al. (2020) estudiaron el impacto del efecto de la temperatura y tiempos de
almacenamiento en la actividad metanogénica especifica (AME) del inóculo. Se demos-
tró que la actividad puede disminuir con el tiempo independientemente de las condicio-
nes de almacenaje (temperatura, humedad, etc.). Sin embargo, la velocidad con la cual
la actividad decreció fue dependiente de la temperatura, siendo más baja a temperaturas
menores (4 °C). Los inóculos almacenados a 4 °C y a temperatura ambiente (22 °C)
mantuvieron la actividad metanogénica cercana a la de un inóculo fresco por un lapso
de hasta 14 días de almacenaje, mientras que el inóculo almacenado a 37 °C mostró un
significativo decaimiento en la actividad luego de los 7 días de almacenamiento.
Con estos antecedentes científicos, se recomienda almacenar el inóculo a la misma
temperatura que se realizará el ensayo o a temperatura ambiente (20-25 °C) por períodos
cortos, preferentemente no superiores a 5 días (Holliger et al., 2016). Por otro lado, el
inóculo podría conservarse a temperaturas bajas (4 °C) también por períodos cortos, no
superiores a 14 días para evitar una disminución de su actividad metanogénica.
En el Diagrama 2, se muestra un resumen de las diferentes recomendaciones y opcio-
nes para el preparación y almacenamiento del inóculo.
La segunda opción sería la más recomendable, cuando se sospecha que el inóculo
puede contener materia orgánica residual. Las recomendaciones sobre el período de
almacenamiento a 20-25 °C o a la misma temperatura del ensayo pueden ser variables
entre los diferentes autores.
La incubación previa del inóculo con el sustrato conduce a la inducción de vías me-
tabólicas para la degradación, a un incremento de la afinidad por el sustrato y a un incre-
mento en la cantidad de microorganismos degradadores específicos de ese sustrato.

18
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Diagrama 2
Opciones de acondicionamiento y almacenamiento del inóculo, ordenadas en orden
de preferencias

INÓCULO FRESCO
(dentro de las horas ENSAYO
de recolección)

INÓCULO FRESCO PREINCUBACIÓN

(dento de las horas (<4 días a la T ENSAYO
de recolección) del ensayo)

INÓCULO FRESCO ALMACENAMIENTO PREINCUBACIÓN

(dento de las horas DEL INÓCULO (<4 días a la T ENSAYO
de recolección) (<14 días; a 4°C) del ensayo)
ALMACENAMIENTO
INÓCULO FRESCO DEL INÓCULO
(dento de las horas (por períodos cortos; ENSAYO
de recolección) a 20-25°C)

Si bien la idea de adaptación/aclimatación es extensamente aceptada en la comuni-

dad científica, existen pocos antecedentes en el uso de inóculos adaptados, utilizándo-
se comúnmente inóculos no adaptados en el ensayo de PBM (Raposo et al., 2011). Un
estudio realizado por Bres P.A. (2019), comparó el rendimiento de metano en un ensayo
de PBM, utilizando un inóculo adaptado al sustrato guano (AME= 0,05 gDQO/gSSV.d) y
otro inóculo del tipo granular, sin adaptación al sustrato y con mayor actividad (AME=
0,13 gDQO/gSSV.d). Los resultados mostraron que el inóculo granular obtuvo un mayor
rendimiento de biogás y metano comparado con el inóculo adaptado al sustrato. Para
un ensayo de PBM, donde se optimizan las condiciones, es recomendable utilizar lodos
con alta actividad y del tipo granular.

Concentración del inóculo

La naturaleza (origen) y la concentración del inóculo son los factores que más
difieren en la protocolización de los ensayos de PBM. Normalmente, cuanto mayor
sea la concentración del inóculo, mayor será la conversión anaeróbica del sustrato
y más rápido finalizará el ensayo de PBM, ya que afecta la tasa de biodegradación
(Raposo et al., 2011).
Existen diversas concentraciones de inóculo e incluso diferentes formas de expre-
sión reportadas. Puede encontrarse como porcentaje de volumen con rango desde 10
a 80 %. Sin embargo, la forma de expresión más significativa es como SV o SSV, ya que
representa el contenido de biomasa en el lodo. Se reportan rangos entre 1 a 37 gSV/L
(Raposo et al., 2011; Cárdenas Cleves et al., 2016), entre 15 a 20 gSV/L (V.D.I., 2006) y
entre 2 a 8 gSSV/L (Rozzi & Remigi, 2004).

19
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

La relación S/I es uno de los parámetros más importantes en el ensayo de PBM. A

pesar de ello, muchos investigadores no reportan este valor en el diseño experimental.
Esta variable puede encontrarse expresada de diferentes formas como: gSV/gSV, gSV/
gSSV o gSV/gDQO; incluso esta relación puede utilizarse en el orden inverso como inó-
culo/sustrato (I/S).

Resumen
En el Diagrama 3, se muestra un resumen de todo lo expuesto anteriormente, rela-
cionado al inóculo: su caracterización, preparación, almacenamiento y concentración.

Diagrama 3
Resumen sobre la caracterización, la preparación, almacenamiento
y la concentración del inóculo en un ensayo PBM

CARACTERIZACIÓN
• Materia seca o sólidos totales
• Sólidos volátiles, contenido de materia orgánica y de carbono
• Sólidos suspendidos volátiles
• Actividad Metanogénica Específica (AME)
• Criterios de calidad del inóculo: pH, AGV, alcalinidad y N-NH4 (Tabla 2)

PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO
• Tamizado y dilución en caso de ser necesario
• Preincubación < a 4 días
• Inóculo sin almacenamiento preferentemente, lo más fresco posible (ver diagrama 2)

CANTIDAD O CONCENTRACIÓN
• Se reportan diferentes concentraciones (2-8 gSSV/L o 1-37 gSV/L)
• Tener en cuenta la relación sustrato/inóculo

Condiciones operativas
Agitación y temperatura
La agitación del medio facilita el contacto entre los microorganismos y el sustrato,
previniendo la acumulación de metabolitos intermedios (como lo son los AGV) y garan-
tizando las condiciones de homogeneidad en el sistema. La agitación puede realizarse
en forma continua o intermitente, según el tipo de sistema de agitación: mediante el
movimiento del reactor (manual, orbital o axial) o mediante el movimiento de un agitador
interno. En este último caso, la agitación puede ser unidireccional o bidireccional (por
ejemplo, equipo automático para el ensayo de PBM modelo AMPTS).

20
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Souto et al. (2010) estudiaron la influencia del tipo de agitación y demostraron que la
agitación manual intermitente tuvo similares rendimientos en un ensayo de AME, com-
parado con la agitación orbital continua y que, la agitación axial debería ser evitada cuan-
do se utilizan volúmenes pequeños de frascos, para evitar la ruptura de los agregados
microbianos (flóculos).
Un estudio realizado recientemente (Wang et al., 2017) demostró que el tipo y veloci-
dad de mezclado óptimo puede depender del tipo de muestra y la viscosidad generada en
el líquido del digestor. Para muestras con mayor viscosidad (lodos de aguas residuales), la
agitación continua unidireccional y bidireccional a 160 rpm, permitió la mayor producción
de metano. Sin embargo, la remoción de la materia orgánica no fue afectada, por lo que
la agitación podría estar relacionada a la liberación de burbujas de gases atrapadas en el
líquido. Para las muestras que no presentan una alta viscosidad (cuando el contenido del
digestor está lo bastante diluido o el sustrato es fácilmente degradado), el mezclado con
agitación manual, una vez al día, podría ser suficiente para el ensayo de PBM.
Cuando la intensidad de mezclado es baja, puede verse limitada la transferencia de masa,
mientras que, cuando ésta es alta, los agregados microbianos pueden romperse. En ambas
situaciones, puede reflejarse una disminución del valor de la producción de metano en el en-
sayo de PBM. Antecedentes científicos mostraron que las velocidades de 360 rpm, 400 rpm
y 700 rpm provocaron una disminución en la producción de metano (Cho et al., 2005; Souto
et al., 2010). La intensidad de mezclado más utilizada y reportada varía entre 150 y 200 rpm.
Con respecto a la temperatura, esta variable influye en la tasa de crecimiento, el me-
tabolismo y la dinámica poblacional de los microorganismos dentro del reactor anaeró-
bico. Además, afecta factores tales como la tasa de transferencia del gas y las caracte-
rísticas de sedimentación de los lodos biológicos (Filer et al., 2019).
El ensayo de PBM se realiza a 30-35 °C, debido a que las condiciones mesofílicas son
favorables para el desarrollo de los microorganismos metanogénicos. Las temperaturas
termófilas (45-60 °C) en este tipo de ensayos son poco usuales, ya que la operación en
este rango de temperatura implica mayores requerimientos energéticos y mayor sen-
sibilidad a las sustancias tóxicas como el amonio y los ácidos grasos de cadena larga
(Fernández Rodríguez et al., 2012; Raposo et al., 2011). Es conveniente que la tempera-
tura utilizada durante el ensayo sea la misma que la temperatura de origen del inóculo.
Por otro lado, la temperatura de incubación debería estar bajo condiciones ambientales
controladas, con variaciones máximas de ± 2 °C (Holliger et al., 2016).

Blanco y control
Deberá incluirse un blanco y un control en el ensayo de PBM. El blanco consiste en
incubar el inóculo sin el agregado de sustrato y el control consiste en incubar el inócu-
lo con un sustrato estándar, el cual se conoce su rendimiento teórico. Tanto el control

21
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

como el blanco son expuestos bajo las mismas condiciones ambientales y operativas
que se desarrollará el ensayo.
El blanco se utiliza para considerar la materia orgánica residual que puede contener
el inóculo, por lo que la producción de metano generada por el inóculo al final del ensayo
debe ser restada de la producción de metano generada por el sustrato (Angelidaki et al.,
2009; Filer et al., 2019).
Cuando la producción total de metano del blanco contribuye más del 20 % de la pro-
ducción total de metano del sustrato de análisis, se recomienda realizar la preincubación
del inóculo y repetir el ensayo (Holliger et al., 2016).
El control evalúa la precisión del ensayo de PBM y permite validar el procedimiento de
medición del gas. La celulosa y la gelatina son los sustratos estándares más utilizados
como control. La celulosa es recomendada para los residuos agrícolas, agroindustriales,
agropecuarios y municipales, mientras que, la gelatina es recomendada para residuos cár-
nicos, pescados y otros residuos similares (Angelidaki et al., 2009). Cuando la celulosa es
digerida debe producir un mínimo del 80 % del máximo rendimiento teórico de metano (V.D.I.
4630; 2006). Según Holliger et al. (2016), el rendimiento de metano experimental del control
debe estar comprendido entre el 85 % y el 100 % del valor teórico (celulosa: 352 - 414 LCH4/
kgSV, en condiciones estándares 0 ºC y 1 atm). Si bien los controles son necesarios porque
verifican la precisión de la metodología, es poco usual su reporte en los trabajos científicos
(Raposo et al., 2012). En la Tabla 3 se muestran los rendimientos de los sustratos estándares
más utilizados como control y sus respectivos rendimientos teóricos de metano.

Tabla 3
Rendimiento teórico de metano para los diferentes sustratos
Sustrato control RTM (mLCH4/gSV) Sustrato de análisis
Celulosa 414 Residuos agrícolas, agroindustriales y
municipales
Gelatina 433 Residuos cárnicos, pescados
Referencia. RTM: rendimiento teórico de metano

Generalmente, para el control se utiliza la misma relación S/I que aquella para la
muestra de interés. El interlaboratorio coordinado por Raposo et al. (2011) mostró que,
tomando los 13 de 16 laboratorios participantes, el promedio del rendimiento de metano
para la celulosa fue de 350 LCH4/kgSV, con una alta precisión y un 85 % de rendimiento
de metano con respecto al teórico (relación entre el valor experimental y el teórico).

Cámara de gas
El volumen de la cámara de gas o espacio de cabeza (headspace) puede afectar el
rendimiento de biogás y metano en un ensayo de PBM (Figura 1).

22
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Figura 1 Cuando se utiliza el método manométrico, el

headspace influirá en la presión generada por el
Volumen de cámara de gas o
espacio de cabeza (headspace) gas, en la duración del ensayo y en la frecuencia
de muestreo del gas. Se reportan diferentes pro-
porciones de headspace, respecto al volumen total
del reactor, siendo entre el 20 % y el 60 %, los volú-
menes del headspace más utilizados. Si bien esta
headspace variable es de gran importancia para el ensayo de
PBM, muchos autores no la reportan en su diseño
experimental (Raposo et al., 2012).
inóculo +
sustrato Algunos trabajos han estudiado la influencia
de la sobrepresión en el headspace sobre el rendi-
miento de biogás y metano. La presión generada
Reactor por el gas dependerá de diversas variables como
ser el volumen del headspace, frecuencia de medi-
ción, frecuencia de liberación del gas acumulado y tamaño de la botella de incubación,
entre otras. Himanshu et al. (2017) evaluaron la influencia en la frecuencia de medición
y liberación de la presión (diaria, cada tres días, semanalmente y luego de los 35 días
de incubación) en diferentes volúmenes de headspace (50 mL (42 %), 90 mL (56 %) and
180 mL (72 %)). Se evidenció un impacto negativo en el rendimiento de biogás, debido
a la sobrepresión en el headspace, atribuyéndole este fenómeno a la solubilización en
el medio del CO2, al incrementarse la presión en el headspace. De acuerdo con la ley
de Henry, cuando la presión parcial del CO2 se incrementa en el headspace, se produce
una mayor disolución de ese gas en el medio líquido, conduciendo a una disminución
de la presión en el momento de su determinación. Asimismo, un incremento de la
concentración de CO2 en el medio líquido, conlleva a una reducción del pH, provocando
una perturbación en la actividad de algunos microorganismos. Por otro lado, un incre-
mento del volumen del headspace puede conducir a un incremento del rendimiento de
metano. Similares resultados fueron encontrados Yilmaz (2015) quien evaluó el efecto
de la presión para diferentes headspace (80 %, 60 %, 40 % y 20 %) sobre la producción
de biogás en un ensayo de PBM con glucosa como sustrato. Este trabajo mostró que
la producción de biogás se ve favorecida cuanto menor es la presión en el headspace
(mayor volumen del headspace).

Nutrientes
La operación de plantas de biogás requiere de concentraciones balanceadas de
C:N:P:S (~ [Link]), de macronutrientes como potasio (K), sodio (Na), magnesio (Mg)
y calcio (Ca), de micronutrientes como hierro (Fe), manganesio (Mn), selenio (Se), alu-
minio (Al), níquel (Ni), cobalto (Co), boro (B), cobre (Cu), molibdeno (Mo) y Cinc (Zn) y de

23
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

complejos vitamínicos (biotina, ácido fólico, riboflavina, tiamina, nicotinida) para favore-
cer el crecimiento y desarrollo de los microorganismos (Filer et al., 2019).
En un ensayo de PBM, la falta de estos nutrientes puede causar efectos inhibitorios
(Angelidaki et al., 2009). Las soluciones de nutrientes más utilizadas son descriptas por
Rozzi y Remigi (2004), Owen et al. (1979) y Angelidaki et al. (2009).
Además de los nutrientes, se requiere el agregado de soluciones amortiguadoras (bu-
ffers) como los carbonatos y fosfatos y un agente reductor, como lo es el sulfuro de sodio.
También puede incluirse en el medio nutritivo la resarzurina que es un agente indicador de
óxido-reducción. En algunos casos, por ejemplo, cuando se utilizan como inóculo los lodos
de aguas residuales, el suministro de nutrientes podría evitarse, debido a que intrínseca-
mente estos lodos son ricos en dichos elementos (Aquino et al., 2007; Filer et al, 2019).

pH y alcalinidad
Para el ensayo de PBM el pH debe estar cercano a la neutralidad, a fin de garantizar
la actividad metabólica de los microorganismos anaeróbicos. Un pH bajo puede con-
ducir a una acumulación de los AGV y un pH alto a concentraciones altas de nitrógeno
amoniacal libre. En ambos casos, el proceso de degradación se ve afectado debido a la
inhibición de las bacterias metanogénicas. Por eso, antes del inicio del ensayo, la mez-
cla deberá ser ajustada hasta pH neutro mediante el agregado de soluciones alcalinas
o acidificantes, dependiendo el caso. Para que el sistema tenga la suficiente capacidad
buffer y garantizar la neutralización de los AGV, el inóculo debe contener al menos 1,5
g CaCO3/L, y así asegurar las condiciones óptimas de desarrollo de las bacterias y del
proceso degradativo (Angelidaki et al., 2009; Hollliger et al., 2016).

Relación entre el sustrato y el inóculo

La mineralización de un residuo sólido a través del proceso de digestión anaeró-
bica requiere de la acción coordinada de diferentes grupos de bacterias, como así
también de prevenir la acumulación de metabolitos intermediarios y productos que
son potencialmente inhibidores del proceso (AGV y N-NH3). En efecto, el balance entre
los microorganismos y el sustrato asegura la eficiente biodegradabilidad anaeróbica.
Si la carga de sustrato es demasiado baja, los microorganismos exhibirán una baja
actividad metabólica y, consecuentemente, se reflejará baja producción de biogás. Si
la carga de sustrato es demasiado alta, la medición del biogás será más confiable pero
puede resultar en una inhibición de la producción de biogás por acumulación de poten-
ciales inhibidores (Angelidaki and Sanders, 2004; Raposo et al., 2011). Por eso, uno de
los parámetros claves es encontrar la mejor relación entre el sustrato y el inóculo que
mantenga el equilibrio en el sistema.

24
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

En teoría, el rendimiento de metano no debería ser afectado por esta relación, ya que
solo influye en la cinética del proceso (Lesteur et al., 2010). Sin embargo, se ha demos-
trado que esta relación puede afectar, tanto la tasa como el grado de la degradación
anaeróbica (Holliger et al., 2016; Raposo et al., 2011).
Comúnmente, se utilizan las relaciones S/I entre 0,25 y 1 (como gSV/gSV), recomen-
dándose una mayor cantidad de inóculo que de sustrato para minimizar los posibles pro-
blemas de inhibición o acidificación en el sistema (Holliger et al., 2016). Esta relación no
debería estandarizarse, ya que depende del tipo de sustrato y de las características del
inóculo. Deberá evaluarse cada caso en particular, dado que cada combinación sustra-
to-inóculo tiene una relación óptima, considerando su potencial producción de los AGV
y su capacidad de amortiguamiento (Elbeshbishy et al., 2012; Lesteur et al., 2010). Para
sustratos desconocidos o que se sospecha una inhibición del proceso, se recomienda
utilizar relaciones S/I bajas, entre 0,25 a 0,35 (Holliger et al., 2016).

Condiciones anaeróbicas
El volumen del headspace es burbujeado para desplazar el aire presente y asegurar
las condiciones anaeróbicas antes de cerrar el reactor (Cárdenas Cleves et al., 2016),
aunque no hay consenso sobre el flujo de gases y la duración de este procedimiento.
Los gases más utilizados para hacer este barrido son el nitrógeno molecular (N2), el
dióxido de carbono (CO2), Helio (He) y sus combinaciones como ser N2: CO2 (70:30 % o
80:20 % v/v). Koch et al. (2015) encontraron que el barrido del headspace con la mez-
cla de gas (80 % de N2 y 20 % de CO2) produce un incremento del 20 % en la producción
de metano comparado con el barrido con N2 puro. Sin embargo, se requieren mayores
estudios para determinar el efecto del CO2 en la mezcla del gas sobre la formación del
metano en el ensayo de PBM.
Para asegurar las condiciones anaeróbicas durante todo el período del ensayo se
recomienda realizar una prueba de estanqueidad. Un método sencillo pero eficaz es
generar una sobrepresión en el headspace y luego sumergir el reactor en un recipiente
con agua. Si el reactor tiene fugas se observarán burbujas de gas en el agua. Si el re-
actor no tiene fugas, significa que superó la prueba de estanqueidad y podrá utilizarse
para el ensayo.

Resumen
En el Diagrama 4, se muestra un resumen de todo lo expuesto anteriormente, relacio-
nado a las condiciones operativas del ensayo PBM.

25
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Diagrama 4
Resumen sobre los parámetros y factores operativos
que pueden influir en el ensayo de PBM

AGITACIÓN Y TEMPERATURA
• Puede ser manual, orbital o axial; intermitente o continua
• Velocidad de agitación recomendada <160 rpm, aunque dependerá del tipo de sustrato
• Temperatura: mesofílica preferentemente

BLANCO Y CONTROL
• Blanco: inóculo sin el agregado de sustrato
• Control: celulosa y/o gelatina. El PBM debe estar entre el 80-100 % del PBM teórico

HEADSPACE
• Dependerá del sistema de medición, pero entre 20-60 % del volumen total es lo más utilizado

NUTRIENTES
• Recomendado para asegurar el crecimiento y el desarrollo de los microorganismos. Existen
varios formulados de nutrientes

PH Y ALCALINIDAD
• Ajustar a pH 7, antes de iniciar el ensayo
• Alcalinidad > 1,5 g CaCO3/L, sino agregar

RELACIÓN SUSTRATO/INÓCULO (S/I)

• S/I entre 0,25 y 1 (recomendadas). Sin embargo, si se sospecha presencia de inhibidores
incluir al menos dos relaciones S/I más bajas
• Dependerá de cada sustrato e inóculo a utilizar. Se recomienda probar al menos 2 relaciones de S/I

CONDICIONES ANAERÓBICAS
• Pasar una corriente de gas (N2; He, N2:CO2) para desplazar el aire en el headspace
• Realizar una prueba de estanqueidad

Condiciones experimentales
Métodos de medición del biogás
El ensayo de PBM es llevado a cabo en reactores que aseguren la hermeticidad del
sistema durante todo el período del ensayo. La bibliografía reporta diferentes metodolo-
gías e instrumentos que permiten cuantificar el volumen de metano y biogás generado
para el desarrollo de este ensayo. En general, según la forma de medición, pueden clasifi-

26
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

carse en método manométrico, por jeringa o por desplazamiento del líquido. La elección
del método define el diseño del sistema de reactor a utilizar.

Método manométrico
Se basa en la medición de la presión ejercida por el volumen de biogás acumulado
en el headspace del reactor. La medición de la presión se realiza acoplando un sensor
(membrana transductora de presión), el cual detecta la presión ejercida y la traduce en
unidades de presión (bar, atm). Esto se realiza con un equipo medidor de presión llama-
do transductor o manómetro. El volumen de biogás generado es calculado a través de
la sobrepresión medida por el transductor, utilizando la ley de gases ideales donde el
volumen en el headspace y la temperatura son constantes y conocidos (Figura 2 a). Una
vez medida la presión se recomienda ventear y liberar el gas acumulado para reducir
la presión hasta alcanzar la presión atmosférica dentro del reactor. Luego, el sistema
queda listo para una próxima medición de biogás. Según Holliger et al. (2016) la presión
en el headspace no debe ser superior a 3 bares para evitar elevadas concentraciones de
CO2 disuelto y la ruptura del reactor. Se debe evitar sobrepresiones altas, ya que afecta
a la disolución del CO2 y el pH en el medio, así como también el crecimiento bacteriano
(Himanshu et al., 2017; Yilmaz, 2015).

Figura 2
Sistemas de medición de biogás (manométrico y por desplazamiento)
basados en el protocolo VDI 4630 (2006)

Manómetro biogás biogás

digital

0.8 inóculo + inóculo +

sustrato sustrato

Reactor Reactor

a Método manométrico b Método volumétrico

por desplazamiento

Existen pocos estudios que evalúen el efecto de la sobrepresión en los microorganis-

mos anaeróbicos o en el proceso degradativo. Valero et al. (2016) estudiaron el efecto de la
acumulación de la presión en el headspace y encontraron que cuando las presiones fueron
superiores a 0,6 bares la producción de metano fue afectada para el sustrato de residuos
de café molido; pero cuando las presiones estuvieron entre 0,6 y 1 bar no se observaron

27
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

estos efectos para los sustratos de estiércol de tambo y el residuo de cáscara de cacao.
El efecto de la sobrepresión puede depender del tipo de sustrato en un ensayo de PBM.

Método volumétrico por desplazamiento

El biogás producido puede desplazar una solución contenida en un sistema colector
externo al reactor. Se llena el colector con una solución barredora y se invierte en un reci-
piente reservorio. El biogás pasa a través de la solución y el volumen desplazado es igual
al volumen de biogás generado. La solución barredora puede ser agua de red, aceite, agua
acidificada y agua carbonatada (Figura 2 b). La desventaja que presenta este método es la
posible disolución del CO2 en la solución barredora, conduciendo a una subestimación del
biogás generado (Filer et al., 2019). La solubilidad del CO2 en agua a 25ºC es 25 veces más
alta comparada con el CH4 bajo las mismas condiciones de pH y presión (Strömberg et al.,
2014). Su solubilidad puede reducirse decreciendo el pH o incrementando la salinidad en
la solución barredora (Strömberg et al., 2014; Zaman, 2010). Por otro lado, además de ajus-
tar el volumen de biogás generado en condiciones estándares de presión y temperatura, es
necesario considerar el contenido de vapor de agua y corregir por la presión hidrostática
sobre el gas, cuando se utiliza este método (Filer et al., 2019; Strömberg et al., 2014). Esta
técnica es sencilla y de bajo costo para su implementación en el laboratorio, pero presenta
como desventaja la posibilidad de tener fugas del biogás mediante el sistema de cone-
xión y medición (agujas, mangueras). Debe considerarse el uso de jeringas esmeriladas y
mangueras impermeables para gases, a fin de asegurar la hermeticidad del sistema y las
condiciones anaeróbicas (Aquino et al., 2007).

Figura 3
Método volumétrico por jeringa

Método volumétrico de Consiste en conectar una jeringa invertida en

medición de biogás por jeringa la tapa del reactor (Figura 3). La presión generada
en la headspace desplazará el émbolo de la jeringa,
equilibrando la presión interna del reactor hasta al-
canzar la presión atmosférica (Zaman, 2010).
biogás
La medida del desplazamiento del émbolo de
la jeringa es igual al volumen de biogás generado.
Es un método relativamente sencillo, en el cual se
minimiza las presiones altas dentro del reactor, evi-
biogás
tándose la solubilización del CO2. La desventaja es
inóculo + que el error humano puede ser importante debido
sustrato
a que es una operación manual. Por otro lado, para
realizar la medición, es necesario retirar el reactor
Reactor de la incubación, donde el cambio de la tempera-

28
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

tura podría influir significativamente en la medición del biogás (Filer et al., 2019). Otro
problema de este método es que no puede haber pérdidas entre la pared de la jeringa y
el émbolo, pero tampoco fricción, porque ésta impediría el desplazamiento del émbolo
generando una presión superior a la atmosférica en el reactor.

Caudalímetro
Figura 4 El caudalímetro es un equipo que permite medir
Medición de biogás por el volumen del gas con alta precisión (Figura 4). Los
conexión a un caudalímetro caudalímetros utilizados para el ensayo de PBM,
deben ser capaces de medir caudales de flujo ul-
trabajos, medir en forma continua y liberar el gas
para evitar las sobrepresiones en el headspace. El
dispositivo de medición funciona de acuerdo con
Caudalímetro
biogás el principio de desplazamiento de líquido y flotabili-
130 dad. Se genera un pulso digital cuando un volumen
inóculo +
sustrato definido de gas fluye a través del dispositivo. Luego,
por un sistema de adquisición de datos integrado
se registra y se muestra el resultado. Existen en el
Reactor
mercado los modelos MilliGascounters RITTER (de
origen alemán) y el µFlow Bioprocess Control (de origen sueco), entre otros, que están
diseñados para medir biogás y metano.

Métodos de medición del metano

La producción de metano es uno de los indicadores más sensibles que está relacio-
nado directamente con la degradación de la materia orgánica. Los valores típicos del por-
centaje de metano en el biogás se encuentran entre el 60 % y el 75 %. Un desequilibrio
entre las etapas de la degradación conduce a una reducción del porcentaje de CH4 y a un
incremento del porcentaje de CO2 (Tabatabaei & Ghanavati, 2018).
Existen diferentes métodos para medir el metano. La cromatografía gaseosa permite
la identificación y cuantificación del CH4 y CO2 con mayor resolución y sensibilidad compa-
rada con otros métodos, generando resultados altamente fiables (Strömberg et al., 2014).
Otra alternativa para medir CH4 es mediante la adsorción del CO2 con solución alca-
lina. Se utiliza un tubo graduado con una solución ácida (0,5 M HCl) que es invertido y
sumergido en un recipiente con la misma solución. El tubo graduado se conecta desde
la parte inferior con el headspace del reactor mediante una manguera (Figura 5 a y b).
El biogás producido fluirá hacia el tubo graduado y desplazará el líquido. El volumen de
líquido desplazado representa el volumen de biogás producido (Figura 5 c). Una vez
medido el biogás, se adiciona una solución básica (NaOH, KOH, LiOH) en el recipiente

29
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

para lograr un pH > 9, y la captura del CO2. El volumen del líquido desplazado en el tubo
representa el volumen de CH4 generado (Figura 5 d). La diferencia entre el volumen de
biogás y el volumen de CH4 representa el volumen de CO2 producido, considerando que
la producción de H2S es despreciable en el biogás (Pham et al., 2013).

Figura 5
Métodos e instrumentos usados para medir el volumen de metano basado sobre el
método volumétrico por adsorción del CO2

Adaptado de: Tabatabaei & Ghanavati, 2018

inóculo +
sustrato

Sol. Ácida (pH<2) Sol. Ácida (pH<2) Reactor

a Tubo graduado lleno con b Conexión del reactor al

una solución ácida, invertido tubo graduado
en un contenedor con la
misma solución

CH4

Biogás

Base

Sol. Ácida (pH<2) Sol. Base (pH>9)

c El líquido desplazado del d Adición de una solución base al

tubo representa el volumen contenedor. El espacio ocupado
de biogás acumulado por el gas en el tubo graduado
en el reactor representa el volumen de metano
contenido en el biogás

En este método, el barrido del aire en el headpace debe realizarse con una mezcla de
N2: CO2, donde el % de CO2 sea igual al biogás producido (entre 30-40 %). De este modo
el N2 que será transferido al tubo graduado, compensará al volumen de CH4 en el heads-
pace al final del ensayo.

30
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Figura 6 Otro método volumétrico para medir el

CH4 es haciendo pasar el biogás por una
Método volumétrico de
medición del metano por jeringa solución alcalina contenida en un recipiente.
Se conecta la jeringa en el headspace del re-
cipiente, causando la despresurización del
sistema (método volumétrico por jeringa).
CH4
El volumen desplazado por el émbolo de la
jeringa representa el volumen de metano
producido (Figura 6).
Algunos sistemas de reactores miden
biogás
el metano producido por el método ma-
nométrico. Para ello, acoplan en el heads-
inóculo + Sol. alcalina
sustrato (NaOH) pace del reactor un sistema adsorbedor
de CO2, el cual utiliza una base (NaOH o
Reactor LiOH) en estado sólido (perlas, polvo). De
esta forma, la presión medida por el trans-
ductor de presión representa el volumen de metano acumulado en el headspace (méto-
do manométrico por captura del CO2 con álcali solido).
Actualmente, ha tomado gran importancia el método de la densidad para medir me-
tano, conocido como GD-BMP (gas density- biochemical methane potential) debido a su
practicidad y su bajo costo de medición. Este método requiere conocer dos variables: la
pérdida de masa de los reactores y el volumen de biogás producido durante cada evento
de muestreo a lo largo del ensayo PBM. Con estas mediciones, es posible determinar la
densidad del biogás y, a partir de ello, la composición del biogás. Justesen et al. (2019)
demostraron mediante una serie de cálculos la relación entre la composición y la densi-
dad del biogás, el cual es el resultado de la diferencia de las masas molares entre el CH4
y el CO2. Mediante la estimación basada en la densidad de la fracción molar del CH4 y
medición del volumen (o masa) del biogás, el cálculo de la producción de CH4 resulta ser
simple. De esta forma, el método GD elimina la necesidad de la cromatografía gaseosa u
otros análisis que son altamente costosos para la determinación del PBM.

Resumen
En resumen, existen diferentes alternativas para medir el biogás y metano, con una
gran variedad de combinaciones posibles. En el Diagrama 5 se muestran los métodos
más utilizados para medir el biogás y el metano.

31
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Diagrama 5
Métodos de medición de biogás y metano

MÉTODOS DE MEDICIÓN DE BIOGÁS

Volumétrico por
Manométrico Volumétrico por jeringa
desplazamiento

Cromatografía gaseosa Cromatografía gaseosa Volumétrico por

(CG). Recolección de (CG). Conexión de adsorción del CO2
muestra con bolsa o la jeringa con el biogás
jeringa. Conexión al al CG
MÉTODOS DE MEDICIÓN DE METANO

CG por jeringa o por Volumétrico por jeringa.

muestreador de gases Conexión de jeringa en
Volumétrico por
recipiente con solución
desplazamiento con
alcalina
Volumétrico por solución alcalina
desplazamiento con
solución alcalina Método de densidad (GD)
por diferencias de masas
Manométrico por captura y volumen de biogás
del CO2 con un álcali
(sólido)

Método de densidad (GD)

por diferencias de masas
y volumen de biogás

Frecuencia de muestreo y duración del ensayo

En cuanto a la frecuencia de muestreo, se recomienda realizar una medición diaria
durante la primera semana, si se desea conocer la cinética de producción. Luego, se
puede ir reduciendo la frecuencia de muestreo a dos veces o una vez por semana. La
frecuencia de muestreo dependerá del tipo de método de medición de biogás y metano
utilizado. Si el método es manométrico, la frecuencia dependerá de la presión generada
en el headspace (Holliger et al., 2016).
En cuanto al tiempo de incubación, no está fijado, ya que depende de la biodegrada-
bilidad del sustrato, pero comúnmente la duración es de 30 a 60 días. La degradación
completa de la materia orgánica biodegradable se lleva a cabo en 30 días. Sin embargo,
para compuestos de lenta degradación puede prolongarse hasta 50 días dependiendo
de la calidad del inóculo, de la naturaleza del sustrato y de la relación S/I (Raposo et al.,
2012; Tabatabaei & Ghanavati, 2018).
El ensayo finaliza cuando la producción de metano diaria durante tres días consecuti-
vos sea menor al 1 % del volumen total de metano acumulado (Filer et al., 2019; Holliger

32
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

et al., 2016; V.D.I., 2006). Es importante que el tiempo de incubación sea idéntico para el
blanco (inóculo solamente) y para el inóculo + sustrato para luego realizar el cálculo de
BMP (Hafner et al., 2020).

Tipos de métodos para la determinación del PBM

Métodos experimentales convencionales
La configuración del reactor dependerá del sistema de medición de biogás y metano
seleccionado. Los métodos experimentales más utilizados son el método V.D.I. 4630
(2006), el método de Møller et al. (2004) y el método de Hansen et al. (2004), los cuales
consideran las variables operacionales y los métodos de medición de biogás y metano
descriptos anteriormente.

Métodos experimentales automáticos

Existen en el mercado equipos automáticos que permiten determinar el PBM experimen-
talmente. Los instrumentos automatizados han tomado una gran popularidad en los últi-
mos años, debido a que permiten determinar la biodegradabilidad anaeróbica, midiendo y
registrando automáticamente y en tiempo real la producción de biogás y metano (Badshah
et al., 2012; Himanshu et al., 2017; Koch et al., 2017; Li et al., 2017; Wang et al., 2017). Estos
equipos minimizan los errores humanos y el tiempo de trabajo, tienen una gran precisión
analítica y la interpretación de los datos es estandarizada (Strömberg et al., 2014).
Uno de los equipos existentes en el mercado, se basa en la medición del caudal de
biogás por el método volumétrico, mientras que la cantidad de metano es determinado
por el método de desplazamiento con solución alcalina. Los datos son registrados me-
diante un software que traduce la señal y la expresa como NmLCH4/gSV (273K, 101.325
kPa, condiciones secas).
Otro de los equipos automáticos, utiliza un caudalímetro automático y un sensor de
metano en cada reactor, permitiendo contabilizar el volumen de biogás y metano genera-
do, respectivamente. Los cálculos de biogás y metano producido son acordes a la norma
V.D.I. 4630 (2006).
También existen equipos automáticos que utilizan el método manométrico para la
determinación del metano. Cada reactor tiene un capuchón en el headspace que contie-
ne un álcali en estado sólido para capturar el CO2. La presión acumulada en el headspace
es medida por un sensor de presión y se traduce como volumen de CH4 producido.

Método predictivo por espectrofotometría

Este método es predictivo y se basa en un método analítico no destructivo. La espec-
trofotometría es la ciencia que estudia la interacción entre la energía fotónica y la materia,

33
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

la cual se mide mediante la absorbancia, trasmitancia, difusión o fluorescencia de radia-

ción en el rango del ultravioleta, visible e infrarrojo (IR). Las técnicas espectroscópicas
incluyen la espectroscopía atómica, la cual mide sustancias en la fase gaseosa luego de
la volatilización y la espectroscopía molecular, la cual mide directamente las sustancias
en la fase líquida (Jingura & Kamusoko, 2017; Lesteur et al., 2010). Los métodos de es-
pectroscopía IR contienen información sobre la estructura de los componentes disueltos
e identifican los componentes por comparación con un espectro de referencia; puede usar
los instrumentos de IR cercano (NIR) y la espectroscopía IR de transformada de Fourier
(FTIR). Estos métodos pueden monitorear hidrocarburos aromáticos, alinfáticos y clora-
dos (Jingura & Kamusoko, 2017).

Métodos teóricos
El potencial metanogénico teórico puede ser determinado conociendo la composi-
ción elemental, la composición química o la DQO de la muestra. Estos métodos teóricos
asumen que el sustrato es completamente degradado y que es despreciable el uso del
sustrato por los microorganismos como fuente de energía (Jingura & Kamusoko, 2017).
Son predictivos (valor teórico) y deberan ser ajustados con el ensayo experimental del
PBM (Nielfa et al., 2015).
El PBM teórico (PBMT) basado en la composición elemental (C, H, O, S y N) de una
muestra puede ser calculado mediante la ecuación Symons and Buswell (1933):

(
CnHaOb + n - a - b
4 2
) H O ( n2 - a8 + b4 ) CO + ( n2 + a8 - b4 ) CH
2 2 4

(a/2 + a/8 - b/4) x 22,4

PBMT =
(12n + a + 16b)

Cuando las proteínas están presentes en el sustrato, el NH3 es liberado y debe ser
considerado para calcular el PBMT, acorde a la ecuación de Boyle (Nielfa et al., 2015;
Raposo et al., 2011; Tabatabaei & Ghanavati, 2018):

(
CnHaObNc + n -
a b 3c
- +
4 2 4
)
H2O

(2 8 4 8
)
4 (
2 8 4 8 2 )
n + a - b - 3c CH + n - a + b + 3c CO + cNH
3

(n/2 + a/8 - b/4 - 3c/8) x 22,4

PBMT =
(12n + a + 16b + 14c)

Otra forma de determinar el PBMT es mediante la composición química de la mues-

tra, determinando el porcentaje de proteínas, carbohidratos, lípidos y AGV y conside-
rando los PBMT de estos componentes. En la Tabla 4, se muestran los PBMT de los
sustratos más comunes.

34
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Tabla 4
Rendimientos teóricos de los sustratos comunmente utilizados
Sustrato Composición PBMT (mLCH4/gSV)
Carbohidratos (C6H10O5)n 415
Proteínas C5H7NO2 496
Lípidos C57H10406 1014
Etanol C2H6O 730
Acetato C2H4O2 373
Propionato C3H6O2 530
El PBMT está expresado en condiciones normales (1 atm, 273 K)

El PBMT de la muestra sustrato se calcula mediante la siguiente ecuación (Jingura &

Kamusoko, 2017; Tabatabaei & Ghanavati, 2018):

PBMT=415 (% carbohidratos)+496 (% proteinas)+1014 (% lípidos)+370 (% AGV)

Por último, el PBMT puede ser calculado conociendo la concentración de la DQO de

la muestra. Este método asume que 1 mol de CH4 requiere 2 moles de O2 para oxidar el
C a CO2 con producción simultanea de un mol de H2O. Cada g de CH4 equivale a 4 g de
DQO (Jingura & Kamusoko, 2017):

fuente de carbono →CH4 + C2

CH4 + 2CO2 →CO2 + H2O

El volumen de CH4 producido teóricamente en condiciones estándares de presión

y temperatura (1 atm, 273 K) por cada g de DQO puede ser calculado, a través de la si-
guiente expresión (Tabatabaei & Ghanavati, 2018):

nCH4 x R x T
V (mLCH4) =
P
DQO (g)
nCH4 =
g )
64 ( mol

Por lo tanto:
1 g DQO=350 mLCH4 (1 atm, 273 K)

Donde:
R = la constante de los gases ideales (82,0576 [Link]/mol.K)
T = la temperatura (K)
P= la presión atmosferica (atm)
Conociendo la masa de DQO y de SV agregados al reactor puede calcularse el PBMT
(mL CH4/gSV) de la muestra utilizando esta equivalencia.

35
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Si bien el PBMT da una idea de la calidad del sustrato y su potencial producción de

metano, en PBM o rendimiento de metano obtenido experimentalmente siempre será
inferior debido a numerosos factores (Angelidaki & Sanders, 2004):
• Una fracción del sustrato es utilizado para síntesis de la biomasa, entre un 5 a 10 %
de la materia orgánica degradada.
• Una fracción de la materia orgánica se perderá en el efluente en un tiempo de
retención finita.
• La lignina no es degradada anaeróbicamente.
• Frecuentemente, una parte del material es inaccesible debido a las uniones entre
partículas o a la estructura de la materia orgánica.
• Limitaciones de otros nutrientes.

Interpretación de los datos e informe

El volumen de metano producido es expresado en condiciones estándares de presión
y temperatura (1,013 bar y 273 K), para facilitar la comparación de los resultados con lo
reportado por la bibliografía (Holliger et al., 2016; Strömberg et al., 2014).
Las curvas de producción de metano, se realizan calculando en cada intervalo de
tiempo medido, la producción de metano específica (PME), término que se utiliza para
referirse al rendimiento CH4 de un sustrato determinado. Las curvas de PME muestran
el rendimiento de metano acumulado a lo largo del tiempo, reflejando la cinética de de-
gradación del sustrato. Estas curvas se incluyen en el informe de PBM. El SME y el PBM
presentan las mismas unidades, expresadas como mLCH4/gDQO o gSV del sustrato
agregado (Hafner et al., 2020).
Además, a través de este ensayo puede determinarse la biodegradabilidad anaeróbi-
ca del residuo, ya que el PBM implica la degradación de la materia orgánica por microor-
ganismos bajo condiciones anaeróbicas. Cuando la producción de biogás y metano es
alta, menos materia orgánica remanente queda por degradar, indicando una alta biode-
gradabilidad anaeróbica (Lesteur et al., 2010). Existen varias formas propuestas para
relacionar el PBM con la biodegradabilidad. Algunos consideran el índice de biodegra-
dabilidad, como la remoción de materia orgánica (calculada a través de la remoción de
SV). Otros lo relacionan con el PBMT, calculado en base a la composición elemental, la
composición química o la DQO de la muestra.
El índice de biodegradabilidad (IB) puede ser calculado como la relación del PBM
experimental (PBMe) y el teórico (PBMT):
PBMe x 100
IB (%) =
PBMT

36
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Donde, el PBMe es el potencial bioquímico metanogénico medido experimentalmen-

te, expresado como mLCH4/gSV.
En la Tabla 5 se muestra la información que debe detallarse en un informe del ensayo
de PBM, según las recomendaciones de Angelidaki et al. (2009):

Tabla 5
Recomendaciones sobre la información que debe ser reportada
en un informe de ensayo PBM
 Características del ensayo Descripción
Duración Indicar fecha de inicio y finalización del ensayo
Sustrato estándar utilizado y sus características
Control
fisicoquímicas
Sustrato Características fisicoquímicas
Origen, actividad (AME) y sus características
Inóculo
fisicoquímicas
Temperatura de incubación; tipo y velocidad
Condiciones operativas de agitación; réplicas; volumen de headspace;
volumen del líquido; relación S/I.
Producción de metano; gráficos; Relación entre el
Resultados del blanco y el control rendimiento de metano experimental y el teórico
(en %) para el control
Producción de metano por triplicado de la muestra,
su promedio relativo y desvíos estándares;
Resultados de la muestra gráficos; rendimiento de metano expresado como
mLCH4/ gDQO o gSV de la muestra en condiciones
normales; índice de biodegradabilidad (opcional)

37
 2
Modelo experimental del ensayo de potencial
bioquímico metanogénico

Existe una gran variedad de alternativas para realizar este ensayo. Las normativas y
guías establecidas por diferentes regiones y países difieren en sus metodologías, resul-
tando difícil la elección de aquella más adecuada para realizar el ensayo de PBM.
La propuesta metodológica y diseño experimental aquí presentado, fue realizado
ajustando las variables principales que afectan el proceso anaeróbico en función a lo
más aceptado por la comunidad científica, y adecuando las condiciones operativas y de
diseño según la disponibilidad y accesibilidad de equipamiento del laboratorio.
Resulta indispensable, antes de iniciar el ensayo, fijar algunas condiciones operativas
establecidas tales como: sustrato patrón (control), el blanco, los volúmenes (efectivo y
del headspace) y la relación S/I. En la Tabla 6 se detallan estas variables principales y
una descripción en cada caso.

Tabla 6
Principales variables operativas que requieren ser consideradas
antes del inicio del ensayo
Condiciones operativas Descripción
Siguiendo las recomendaciones, en cada ensayo debe
Blanco y control considerarse un blanco (inóculo solo) y un control
(sustrato patrón).
40 % de volumen del headspace. Se fijó este
porcentaje en función a la frecuencia de muestreo
Headspace
que generalmente se realiza y debido a que es el más
reportado.
S/I= 0,5. Se incorpora una relación más baja (S/I= 0,25)
Relación S/I y una más alta (S/I= 1) si se sospecha presencia de
inhibidores o se desconoce el tipo sustrato.

38
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

En el Diagrama 6, se muestra un esquema descriptivo de los pasos a seguir para la

realización del ensayo, y los materiales, equipos y condiciones operativas que deben ser
considerados desde el inicio hasta la finalización del ensayo.

Diagrama 6
Pasos que seguir para la realización del ensayo

PREPARACIÓN Y DISEÑO Diseño de reactores; método de medición de biogás y metano.

EXPERIMENTAL Sistema de calefacción y de agitación.

DISPONIBILIDAD DE Recolección, conservación, preincubación del inóculo,

SUSTRATO E INÓCULO caracterización fisicoquímica del sustrato e inóculo.

Volumen del headspace y de trabajo (líquido).

CÁLCULOS PREVIOS
Masa de sustrato, inóculo y medio nutritivo.

PROCEDIMIENTO Y Pasos a seguir para iniciar el ensayo

SEGUIMIENTO DEL ENSAYO Seguimiento (frecuencia de medición; finalización)

ANÁLISIS E INFORME Producción y rendimiento de biogás y metano,

DE LOS RESULTADOS el PBM, IB, gráficos.

Preparación y diseño experimental

Diseño de reactores
Varios aspectos y factores determinan el diseño de reactor a implementar, como ser
el método de medición de biogás y metano, el volumen, el tipo de material, la agitación,
la temperatura, entre otros. Esta gran diversidad de factores y aspectos que son consi-
derados a la hora de diseñar el reactor, conduce a la generación de una gran variedad de
modelos y diseños de reactores. Pero, independientemente de su diseño, el reactor debe
cumplir con las condiciones de estanqueidad y anaerobiosis durante todo el período que
se lleva a cabo el ensayo de PBM.
El modelo de reactor que se presenta fue diseñado para medir el biogás por método
manométrico y su composición (CH4, CO2) por cromatografía gaseosa. El reactor con-
siste en una botella de vidrio borosilicato trasparente que contiene inercia química entre
el medio y el vidrio, de 560 mL de capacidad y resistente a altas temperaturas (hasta
140 ºC) y presiones (hasta 1,5 bar de presión manométrica). Cada tapa de reactor es de
material polipropileno, con un orring interno para favorecer el cierre hermético. La tapa
posee en el centro una llave de acero inoxidable con válvula esférica de ¼ pulgadas,
acoplada a un conector neumático con orring interno (Figura 7 a). La cuantificación del

39
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

biogás se realiza conectando una manguera neumática del mismo diámetro a un trans-
ductor de presión y conectando el otro extremo de la manguera al conector neumático
ubicado en el centro de la tapa del reactor. La válvula se abre y el biogás acumulado
en el headspace es medido mediante el transductor de presión (Figura 7 b). Se cierra
la válvula para conservar el biogás acumulado en la headspace y luego determinar su
composición por cromatografía gaseosa (Figura 7 c). Una vez realizada la medición, el
reactor es despresurizado hasta alcanzar la presión atmosférica en su interior, se cierra
la válvula y el reactor queda listo para la próxima medición.

Figura 7
Sistema de reactor utilizado para los ensayos de PBM

a Reactor con tapa b Apertura de la válvula y c Medición del CH4 por

rotomoldeada de medición del biogás por cromatografía, utilizando el
polipropileno y llave transductor de presión muestreador para gases
esférica

También, el ensayo de PBM se lleva a cabo en los reactores mostrados en la Figura 8,

los cuales contienen (a diferencia del diseño anterior), un muestreador del líquido. Este
tipo de reactores son utilizados cuando se requiere monitorear la evolución del proceso
anaeróbico a través de los parámetros como AGV o alcalinidad o bien cuando se desea
estudiar el comportamiento de compuestos inhibitorios.
El ensayo se realiza por triplicado, por el cual debe considerarse que por muestra a
analizar se requieren 9 reactores (muestra, control y blanco).
Cada reactor fue diseñado para utilizar el método manométrico para medir el biogás
y el metano por el método de cromatografía gaseosa, por el cual debe considerarse con-
tar con un transductor de presión y un cromatógrafo de gases.

40
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

La agitación de los reactores se realiza de forma axial con un agitador magnético

diseñado con 6 puertos, y con velocidad regulada a 100 rpm (Figura 9 a). También el
Laboratorio cuenta con un sistema de agitación orbital de 9 puertos, que trabaja a una
velocidad de 100 y 200 rpm. El sistema de calefacción es a través de una incubadora,
regulada para trabajar en condiciones mesofílicas, a 35 °C ± 1 °C (Figura 9 b).

Figura 8 Figura 9

Reactor con muestreador de la fase líquida Condiciones operativas del ensayo

a Reactores anaeróbicos en
2 agitador magnético con 6 puertos

a Reactor anaeróbico b Reactor anaeróbico

1. Válvula esférica conectado a
conectada al muestreador la jeringa para
2. Válvula esférica muestrear la fase
conectada al headspace liquida b Reactores anaeróbicos en
3. Tubo muestreador incubadora regulada a 35 °C

En la Tabla 7 se resume los principales equipos y materiales que se necesitan para

llevar a cabo este modelo de metodología.

Asimismo, debe prepararse el medio nutritivo antes de iniciar el ensayo (Tabla 8).
Si bien existen varios formulados, en esta metodología se seleccionó el medio nutritivo
descripto por Angelidaki et al. (2009).

41
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Tabla 7
Descripción de los principales materiales, instrumentos
y reactivos para realizar el ensayo de PBM
Balanza hasta 5 kg Para pesar los reactores y su contenido

9 reactores con sus respectivas tapas por muestra a

Reactores
analizar (muestra + control + blanco)

Para realizar la prueba de estanqueidad y el barrido del O2

Cilindro con gas N2
en el headspace

Transductor de presión Para medir el biogás

Incubadora Para trabajar en condiciones mesofílicas (35 °C)

Agitador Para realizar el mezclado

Cromatógrafo de gases Para cuantificar la composición del biogás

Peachímetro Para la medición del pH en la mezcla, sustrato e inóculo.

Celulosa microcristalina,
Sustrato estándar (control)
p.a.

Para asegurar las condiciones reductoras en el medio. La

Sulfuro de sodio
concentración final debe ser 0,1 g/L en el reactor. Preparar en
(Na2S.7H2O)
el momento. No se conserva. (Valcke & Verstraete, 1983).

Tabla 8
Solución stock de macro y micronutrientes
Macronutrientes Concentración (g/L) Micronutrientes Concentración (g/L)
Sc 1= NH4Cl 17 FeCl2. 4H2O 2,0
Sc 2= K2HPO4 3,70 H3BO3 0,05
Sc 3= MgSO4 0,56 ZnSO4.H2O 0,07
Sc4= CaCl2.2H2O 0,80 CuCl2.2H2O 0,04
MnCl2.4H2O 0,05
(NH4)6Mo7O2.4H2O 0,05
CoCl2.6H2O 0,05
NiCl2. 6H2O 0,09
EDTA 0,50
HCl 36 % 1 ml/L
Na2SeO3 0,07
Resazurina 0,50
Preparación del medio nutritivo: En un matraz de 1000 mL, agregar 950 mL de agua aproximadamente, adicionarle 10
mL de cada solución de macronutrientes Sc 1, 2, 3 y 4, respetando ese orden. Luego se adiciona 1 mL de la solución de
micronutrientes. Llevar a 1 L. La mezcla es gasificada con una corriente de gas N2 durante 10-15 min. Se recomienda
almacenar las soluciones de macro y micronutrientes en heladera hasta 6 meses (Angelidaki et al., 2009).

42
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Disponibilidad del sustrato y del inóculo

Sustrato
Algunas recomendaciones deben ser consideradas sobre el muestreo y la prepara-
ción del sustrato en el ensayo de PBM:
• La muestra debe ser lo más representativa posible al sustrato que será tratado
por la digestión anaeróbica en una planta a escala real.
• La muestra debe ser lo más homogénea posible. Puede utilizarse un sistema de
agitación para tomar la muestra (por ejemplo, para efluente de cerdos).
• Pretratamiento: puede requerirse una trituración previa de la muestra antes de su
utilización como sustrato (por ejemplo, para la FORSU), para maximizar el contac-
to entre el sustrato y los microorganismos y para una mayor representatividad y
homogeneidad en el reactor.
En cuanto a la caracterización inicial del sustrato, es recomendable incluir los pará-
metros pH, ST; SV y DQO. Con el contenido de ST puede calcularse también el contenido
de humedad de la muestra; con el contenido de SV (materia orgánica de la muestra)
puede estimarse el carbono orgánico total a través del factor de conversión de 1,8 gSV/
gC (Iglesias Jiménez & Pérez García, 1992).
Se recomienda la determinación de la composición elemental de la muestra (C, H, N,
S, O). Esto permitirá calcular el PBM teórico de la muestra con mayor precisión. También
el PBM teórico puede calcularse a través de la DQO. Sin embargo, la determinación de
esta variable, principalmente cuando se trabaje con sustratos sólidos o que presentan
una alta heterogeneidad y donde el valor de la DQO es muy alto, puede resultar técnica-
mente erróneo, debido a la baja representatividad de la alícuota y a las diluciones altas
que deben realizarse para la técnica. Para obtener un valor de DQO representativo de la
muestra, se recomienda hacer esta técnica por sextuplicado.
Por otro lado, si se sospecha la presencia de algún inhibidor en la muestra (N-NH3 o
alto contenido de metales pesados) deberá incluirse esta variable en su caracterización.
Una vez homogenizada la muestra y triturada (en caso de ser necesario) se fracciona
en tres réplicas (A, B, C) para realizar las determinaciones analíticas y llevar a cabo el
ensayo; las muestras se deben conservar en la heladera (4 °C) hasta su uso.
Por último, para realizar el control deberá conocerse el contenido de SV del sustrato
estándar (celulosa, gelatina). Este valor se utilizará para calcular la cantidad de masa a
agregar al sistema, para mantener una relación de S/I=0,5 gSV/gSV.

Inóculo
Generalmente, se utiliza un inóculo fresco, proveniente de una planta de biogás en
funcionamiento. Se prefieren los lodos granulares que poseen mayor actividad. Para

43
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

la caracterización, se recomienda determinar los siguientes parámetros: pH, Alcalini-

dad, AGV, N-NH3, ST, SV, SST, SSV y principalmente la actividad metanogénica especí-
fica (AME). Los valores obtenidos son comparados con los valores referenciados por
Holliger et al. (2016); de no cumplir con alguno de estos valores referenciados, deberá
seleccionarse otro inóculo para la realización del ensayo. En la práctica, una forma de
estimar la calidad del inóculo es conocer las condiciones de funcionamiento del reactor
de origen, donde su calidad será la adecuada para el ensayo si proviene de un reactor
que trabaja eficientemente.
El inóculo es desgasificado previamente al inicio del ensayo. Se coloca el inóculo en
un frasco de dos litros de vidrio con un headspace del 40 %, aproximadamente. Luego
se cierra con la tapa de polipropileno especial, con la válvula abierta para que ventee el
biogás residual y se lo lleva a la incubadora a 35 °C (la misma temperatura de trabajo del
ensayo), durante no más de 4 días.

Cálculos previos
El volumen de headspace (Vh), el volumen total de líquido (Vf), la masa de sustrato
(Ms) y la masa de inóculo (Min) a agregar en cada reactor, deben conocerse a priori de
arrancar el ensayo. Estos valores se calculan según las siguientes expresiones:

Vt x 40
Vh (mL) =
100

Vf (mL) = Vt - Vh

A x Vf
Vin (mL)=
B

Donde:
Vh= volumen del headspace (mL)
Vt= volumen total del reactor (mL)
Vf= volumen final del líquido en el reactor (mL)
Vin= volumen de inóculo agregado al reactor (mL)
A= concentración del inóculo en el reactor (15 gSV/L)
B = concentración del inóculo (gSV/L)
Como la carga del reactor se realizará por pesaje, el Vin deberá pasarse a masa de
inóculo (Min) conociendo su densidad:
Min (g) = d x Vin

44
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Donde:
d= densidad del inóculo (g/mL)

A través de la relación S/I (gSV/gSV) establecida y conociendo la masa de inóculo

(Min), se calcula la masa de sustrato (Ms) según:

Min x C x S/I
Ms (g) =
D

Donde:
MS= masa de sustrato agregada al reactor (g)
S/I = relación sustrato/inóculo fijada. Recomendada: S/I= 0,5 (gSV/gSV).
C= concentración del inóculo (= B, pero expresado como gSV/g)
D= concentración del sustrato (gSV/g)
Todos estos resultados deben ser registrados en una planilla, ya que es indispensa-
ble conocerlos para llevar a cabo el ensayo.

Procedimiento y seguimiento del ensayo

Procedimiento
1. Pesar el reactor y tararlo
2. Agregar la masa de inóculo al reactor (Min en g)1.
3. Agregar la masa de sustrato al reactor (Ms en g)1.
4. Agregar medio nutritivo hasta un poco menos (10 ml) que el Vf, considerando que
la densidad de la mezcla es igual a 1.
5. Medir el pH de la mezcla y ajustar a pH neutro en el caso que sea necesario. Re-
gistrar su valor.
6. Una vez neutralizada la mezcla, completar con el medio nutritivo hasta Vf.
7. Agregar la solución reductora de Na2S para que quede 0,1 g/L dentro del reactor.
Cerrar el reactor inmediatamente.
8. Realizar el barrido del O2 con el N2. Para ello, conectar la manguera desde el ci-
lindro de N2 a la válvula de la tapa del reactor. Abrir la válvula del tubo de N2 (re-

1
Las masas de inóculo y de sustrato a agregar en cada reactor deben ser homogéneas y representativas.
Si los lodos son granulares, los cuales sedimentan rápidamente, pueden tomarse con una pipeta Pasteur
plástica con punta cortada manteniendo en agitación el inóculo o agitando con la misma pipeta Pasteur.
Si la masa de sustrato es líquida (por ejemplo, efluentes agropecuarios o agroindustriales) considerar
también esta recomendación para la toma de la muestra.

45
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

gulada a 25 psi de salida) y del reactor para permitir el paso del N2 por 1 minuto,
aproximadamente. Cerrar ambas válvulas, conectar el reactor al transductor de
presión y medir la presión. Se toma como referencia lograr medir entre 0,80 y
0,90 bar dentro del reactor. Si no se alcanzó la presión de referencia, repetir este
procedimiento pasando nuevamente más N2 2.
9. Realizar la prueba de hermeticidad. Sumergir en agua el reactor sometido a pre-
sión (paso anterior) y observar que no se liberen burbujas en la tapa del reactor. Si
se observan burbujas es porque el reactor tiene pérdidas, no pasando la prueba de
hermeticidad. Abrir la válvula del reactor y liberar el gas hasta alcanzar la presión
atmosférica. Si pasó la prueba de hermeticidad, repetir tres veces más el barrido
del O2 con N2 (punto anterior) para asegurar el desplazamiento completo del O2.
10. Cerrar la válvula del reactor, y llevarlo a incubadora a una temperatura de 35 °C.
Registrar la hora de inicio de incubación.
11. Agitar los reactores 2 veces al día durante 20 minutos.
12. Preparar el blanco siguiendo el mismo procedimiento, pero sin el agregado de
sustrato (punto 2).
13. Preparar el control siguiendo el mismo procedimiento, pero agregando como sus-
trato la celulosa microcristalina sólida en la misma relación que la usada para el
sustrato (relación de 0,5 gSV/gSV).
14. Preparar una cuarta réplica, siguiendo el mismo procedimiento para el sustrato, el
control y el blanco. Esta cuarta réplica será utilizada para la caracterización inicial
de la mezcla líquida3.

Seguimiento del ensayo

15. Medición del volumen del gas: conectar con una manguera neumática el trans-
ductor con la válvula de la tapa del reactor. Abrir la válvula, medir y registrar la pre-
sión, como así también la fecha, la hora y la temperatura de incubación. Cerrar la
válvula del reactor, asegurando que no existan pérdidas del gas en el headspace.

2
Ajustar el procedimiento de barrido del O2 con N2 en función al equipamiento y condiciones con que se
cuenta. El tiempo de barrido con N2, su caudal de salida y el procedimiento descripto aquí fueron ajustados
en función a este diseño de reactor, teniendo en cuenta la resistencia del material y asegurando no superar
la presión máxima que soporta, por lo que deberán ser considerados solo como una recomendación.
3
El contenido de CH4 y CO2 en el biogás fue determinado por cromatografía de gases con equipo Hewlett
Packard 5890 GC System siguiendo la norma ASTM D 1945-14 (2014). Se utilizó la columna de tamiz
molecular con malla 80/100 empacada en tubo de acero inoxidable y granulometría13 X y una columna
de Porapack N malla 80/100 empacada en un tubo de acero inoxidable. Como gas de transporte se utilizó
gas Helio grado cromatográfico 99.998 % de pureza a un caudal de 80 mL/min. La temperatura del horno
de columnas fue de 90 °C, la del inyector de 130 °C, la del detector de 250 °C y donde se alojan las válvu-
las y el lazo de muestra de 130 °C. El detector utilizado es un monofilamento de conductividad térmica
(TCD). El tiempo total de análisis es de unos 6 minutos. El gas patrón utilizado para la calibración está
compuesto por 47,4 % CH4, 8,60% de N2, 35,00 % de CO2, 2,00 % de O2, 2,99 % de H2 y 4,01 % de CO, con
nivel de confianza del 95 % (cilindro N° 155032, grupo Linde Gas S.A.).

46
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

La primera medición deberá realizarse dentro de las primeras 24 h.

16. Medición del CH4 y CO2: conectar el reactor con el muestreador para gases del
cromatógrafo. Abrir la válvula del reactor para que el gas en el headspace pase
por la columna cromatográfica4. Despresurizar el reactor hasta presión atmosfé-
rica, así el sistema queda listo para una próxima medición.
17. Frecuencia de muestreo: dependerá de la presión en el headspace5.
18. Finalización del ensayo: cuando la producción de biogás diaria es menor al 1 % del
total generado.
19. Caracterización inicial y final de la mezcla dentro del reactor. Se recomienda medir pH,
SV y/o DQO. Si se sospecha algún inhibidor como N-NH3 incorporarlo en el análisis.

Análisis y reporte de los resultados

Registro y análisis de datos. Cálculos
Mediante la Ley de Gases Ideales y, bajo condiciones estándares de presión y tempe-
ratura (273 K y 1,013 bar), el volumen de CH4 en el tiempo t (VCH4 t) se calcula, según las
siguientes ecuaciones:

(P - PVH20) x Vh x 273 K XCH4 t

VCH4 t (mL) = x
1,013 bar x (T + 273 K) 100

PVH20 (bar)= 0,61094e(17,625xT/(243,04+T)) x 0,01

Donde:
VCH4 t= es el volumen de metano en el headspace calculado con la concentración de
metano y la presión medida (P) en el tiempo t (mL).
P = incremento de la presión (bar).
PVH20= es la presión de vapor, calculada con la ecuación de Magnus (Alduchov & Eskri-
dge, 1996). Como la ecuación esta expresada en KPa, se multiplica por 0,01 para pasar
a bares.
Vh= volumen del headspace (mL)
T= temperatura de incubación (ºC)

4
Otra forma diferente es considerar 100 mL adicionales de volumen final en el reactor, y antes de cerrarlo,
se toma esta alícuota en forma homogénea para la caracterización inicial de cada réplica. La toma de
muestra debe ser lo más representativa y homogénea posible. Para ello, colocar el reactor en agitación
axial y utilizar una pipeta Pasteur plástica con punta redondeada para su recolección.
5
Para obtener un resultado cromatográfico fiable, se requiere un valor mínimo de presión de 0,10 bar para
realizar una barrida segura por la columna cromatográfica y un valor máximo de 1 bar para evitar posibles
fugas, ruptura del recipiente por sobrepresión y minimizar la solubilidad de los gases (CH4 y CO2) en el líquido.

47
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

XCH4 t= concentración de metano medida en el tiempo t, normalizada y expresada

como fracción en volumen (%).
Se incluye la presión de vapor, suponiendo que para el biogás es la presión de vapor
de saturación, porque se espera que el biogás esté cerca del equilibrio en la fase acuosa
(Hafner et al., 2020).
Inmediatamente luego de la despresurización o postventeo se asume que el sistema
alcanza la presión atmosférica (1,013 bares), que el cambio de la temperatura es despre-
ciable y que la composición del biogás es la misma que antes del venteo (Hafner et al.,
2020). Este estado será el inicial (t-1) para la próxima medición.
El volumen de metano producido en un intervalo de tiempo (VCH4), se calcula como
la diferencia entre el volumen de metano medido en el tiempo t (VCH4 t), y el volumen de
metano postventeo de la medición anterior VCH4 (t-1).

VCH4 (mL) = VCH4 t (mL) - VCH4 (t-1)(mL)

(1,013 bar x PVH20) x Vh x 273 K X

VCH4 (t-1)(mL) = x CH4 (t-1)
1,013 bar x (T + 273 K) 100

Donde:
VCH4 (t-1) = es el volumen de metano en el headspace luego del postventeo hasta la
presión atmosférica de la medición anterior, t-1 (mL).
XCH4 (t-1) = concentración de metano medida en el último tiempo de muestreo, t-1, nor-
malizada y expresada como fracción en volumen (%).
Para calcular el volumen de dióxido de carbono (VCO2), se utilizan las mismas ecua-
ciones descriptas anteriormente, pero reemplazando la concentración de metano por la
concentración de CO2.
El volumen de biogás (Vbiogás) producido se calcula según:
Vbiogás (mL) = VCH4 + VCO2

A continuación, se explican los cálculos para la determinación de la producción de

metano específica y del potencial bioquímico metanogénico, basados en la metodología
descripta por (Hafner et al., 2020).
Para construir la curva de la producción de metano específica (PME) del sustrato,
debe considerarse la resta de la producción de metano especifica del blanco.
El rendimiento de metano del inóculo (blanco) de la réplica j se calcula como:

RCH4 b, j, t (mLCH
g
) = VCH M
4 4 ac, b, j, t

in

48
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Donde:
RCH4 b, j, t= el rendimiento de metano del inóculo para la réplica j en el tiempo t (mLCH4/g).
VCH4 ac, b, j, t = volumen de metano acumulado del blanco para la réplica j en el tiempo
t (mL).
Min= masa de inóculo agregada al inicio del ensayo en la réplica j (g).
El rendimiento de metano del blanco promedio en el tiempo t (RCH4 b, t) se calcula
promediando los valores de VCH4 ac, b, j, t obtenidos en cada réplica j.
La producción neta de CH4 para el sustrato en el tiempo t (VCH4 ) para cada
s, n, t, neta

réplica n se calcula como:

VCH4 s, n, t, neta (mL) = VCH4 ac, s, n, t - RCH4 b, t x Min

Donde:
VCH4 ac, s, n, t = volumen de metano acumulado del sustrato + inóculo para la réplica n
en el tiempo t (mL).
La producción de metano específica del sustrato para cada réplica n en el tiempo t
(PMEn,t) se calcula como:

PMEn, t (mLCH
gSV
) = VCHM
4 4 s, n, t, neta

s, sv

Donde:
Ms, sv= masa de sustrato agregada al inicio del ensayo, expresada como sólidos volá-
tiles (gSV).
La curva de PME del sustrato para cada réplica se construye considerando la suma
de cada PME obtenido en el tiempo t (PMEn, t). También puede graficarse la curva de PME
promedio del sustrato considerando el promedio de los valores obtenidos para cada
réplica en el tiempo t (PMEt).
El Potencial Bioquímico Metanogénico (PBM) del sustrato para cada réplica es el
máximo valor acumulado de la PME en la duración total del ensayo (tf):

PBMn (mLCH
gSV
) = PBE4
ac, n, tf

Donde:
PBM= potencial bioquímico metanogénico del sustrato para la réplica n (mLCH4/gSV)
PBMac, n, tf = la producción de metano específica del sustrato para la réplica n, acumu-
lada durante todo el ensayo (mLCH4/gSV)
Ms, sv= masa de sustrato agregada al inicio del ensayo, expresada como sólidos volá-
tiles (gSV).

49
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

El índice de biodegradabilidad (IB) del sustrato para la réplica n se calcula conside-

rando que por cada g de DQO de sustrato agregado al sistema se transforman 350 mL
de CH4 en condiciones estándares (Lesteur et al., 2010):

x x 100
IB (%) = PBM Ms, sv
350 x DQO

Donde:
PBM = potencial bioquímico metanogénico del sustrato (mLCH4/gSV).
DQO = masa del sustrato agregada al inicio del ensayo, expresada como g de DQO.
350 = es el factor de conversión, que considera que 1 g DQO= 350 mL de CH4.
El promedio del IB del sustrato se calcula considerando el valor obtenido de IB para
cada réplica.

Validación del ensayo e informe de los resultados

El ensayo debe cumplir con ciertos criterios de control de calidad para que pueda ser
validado e informado (Holliger et al., 2016). El ensayo deberá ser rechazado si:
• El desvío estándar relativo del blanco y del control es > 5 %
• El PBM del control es < 85 % o > 100 % comparado con el PBM teórico.
• El desvío estándar relativo de la muestra es > 5 %
Koch et al. (2019) recomienda tener en cuenta los siguientes criterios para que la
curva de rendimiento de metano sea aceptable:
• Incremento monótono de la producción de metano sin pendiente negativa.
• La parte mas empinada de la curva debe estar al inicio de la incubación con una
fase de retardo o lag muy corta (no mas de unos pocos días), alcanzando una
fase estacionaria con una producción de metano mínima.
• Ausencia de ondulaciones en la curva (Figura 10).
• Una progresión similar al comportamiento cinético de los modelos de primer or-
den y tipo Monod. Una fase de retardo extensa con la aplicación del modelo de
Gompertz o modelos similares es un fuerte indicador de errores en el diseño y
ejecución del experimento.
Cumpliendo con estos criterios de calidad, se podrá elevar el informe con los resul-
tados. El informe debe ser lo más completo posible, indicando no solo los resultados
obtenidos sino también las condiciones y diseño experimental del ensayo, ya que pue-
den ser factores influyentes en el resultado. La duración, las características del sustrato,
inóculo y control, las condiciones operativas (temperatura, agitación, volumen efectivo,
volumen del headspace, relación S/I), los resultados obtenidos del blanco y del control, y
los resultados de la muestra de análisis (el PBM, el rendimiento de biogás y sus respec-

50
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

tivos gráficos, % de CH4 y CO2 y el IB) no deben faltar en el reporte de los resultados de
un ensayo de PBM.

Figura 10
Curvas de rendimiento de metano
Rendimiento de metano (mL CH4/gSV)

Tiempo (días)

La línea llena representa la curva normal y la línea punteada representa una curva con comportamiento ondulado que
corresponde a un uso inapropiado de relación SI.

51
 Bibliografía

Alduchov, O. A., & Eskridge, R. E. (1996). Improved Magnus form approximation of sat-
uration vapor pressure. Journal of Applied Meteorology and Climatology, 35(4), 601–609.
Angelidaki and Sanders. (2004). Assesment of the anaerobic biodegradabilty of mac-
ropollutants. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 3, 117–129.
Angelidaki, I, Alves, M., Bolzonella, D., Borzacconi, L., Campos, J. L., Guwy, A. J., Kalyu-
zhnyi, S., Jenicek, P., & Lier, J. B. Van. (2009). Defining the biomethane potential (BMP) of
solid organic wastes and energy crops : a proposed protocol for batch assays. 927–934.
[Link]
Angelidaki, Irini, Karakashev, D., Batstone, D. J., Plugge, C. M., & Stams, A. J. M. (2011).
Biomethanation and its potential. In Methods in Enzymology (1st ed., Vol. 494). Elsevier
Inc. [Link]
APHA. (1992). Metodos normalizados para el análisis de aguas potables y residuales
(17th edn.). American Public Health Association.
Aquino, S. F., Chernicharo, C. A., Foresti, E., & Dos Santos, Maria L. F. Monteggia, L.
O. (2007). Methodologies for determining the Specific Methanogenic Activity (SMA ) in
Anaerobic Sludges. Eng. Sanit. Ambient, 12(2), 192–201.
Astals, S., Koch, K., Weinrich, S., Hafner, S. D., Tait, S., & Peces, M. (2020). Impact of
storage conditions on the methanogenic activity of anaerobic digestion inocula. Water
(Switzerland), 12(5), 1–12. [Link]
Badshah, M., Lam, D. M., Liu, J., & Mattiasson, B. (2012). Use of an automatic meth-
ane potential test system for evaluating the biomethane potential of sugarcane bagasse
after different treatments. Bioresource Technology, 114, 262–269.
Braun, R., Weiland, P., & Wellinger, A. (2008). Biogas from energy crop digestion. IEA
Bioenergy Task, 37, 1–20.
Cárdenas Cleves, L. M., Parra Orobio, B. A., Torres Lozada, P., & Vásquez Franco, C.
H. (2016). Perspectivas del ensayo de Potencial Bioquímico de Metano - PBM para el
control del proceso de digestión anaerobia de residuos. Revista Investigación, Optimiza-
ción y Nuevos Procesos En Ingeniería, 29(1), 95–108. [Link]
v29n1-2016008

52
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Cho, Y., Young, J., & Moon, H. (2005). Factors affecting measurement of specific
methanogenic activity. Water Science and Technology, 52(1–2), 435–440. [Link]
org/[Link]
De Vrieze, J., Raport, L., Willems, B., Verbrugge, S., Volcke, E., Meers, E., Angenent, L.
T., Boon, N., Vrieze, J. De, Raport, L., Willems, B., Verbrugge, S., Volcke, E., Meers, E., An-
genent, L. T., & Boon, N. (2015). Inoculum selection influences the biochemical methane
potential of agro-industrial substrates. Microbial Biotechnology, 8(5), 776–786. https://
[Link]/10.1111/1751-7915.12268
Elbeshbishy, E., Nakhla, G., & Hafez, H. (2012). Biochemical methane potential
(BMP) of food waste and primary sludge: Influence of inoculum pre-incubation and
inoculum source. Bioresource Technology, 110, 18–25. [Link]
biortech.2012.01.025
Fernández Rodríguez, J., Pérez, M., & Romero, L. I. (2012). Mesophilic anaerobic di-
gestion of the organic fraction of municipal solid waste: Optimisation of the semicontin-
uous process. Chemical Engineering Journal, 193–194, 10–15. [Link]
cej.2012.04.018
Filer, J., Ding, H. H., & Chang, S. (2019). Biochemical methane potential (BMP) assay
method for anaerobic digestion reasearch. Water, 11(5), 921.
Gao, R., Yuan, X., Zhu, W., Wang, X., Chen, S., Cheng, X., & Cui, Z. (2012). Methane yield
through anaerobic digestion for various maize varieties in China. Bioresource Technolo-
gy, 118, 611–614.
Graziani, P. (2018). Economía circular e innovación tecnológica en residuos sólidos.
Oportunidades en América Latina (CAF (ed.); CAF). [Link].
Hafner, S D, Astals, S., Buffiere, P., Løjborg, N., Holliger, C., Koch, K., & Weinrich, S.
(2020). Calculation of methane production from manometric measurements. Standard
BMP methods document. Https://[Link]/En/BMP.
Hafner, Sasha D., Astals, S. D., Holliger, C., Koch, K., & Weinrich, S. (2020). Calculation
of Biochemical Methane Potential (BMP). Standard BMP methods. Https://[Link]/
En/BMP.
Hansen, T. L., Schmidt, J. E., Angelidaki, I., Marca, E., Jansen, J. L. C., Mosbæk, H.,
& Christensen, T. H. (2004). Method for determination of methane potentials of solid
organic waste. Waste Management, 24(4), 393–400. [Link]
man.2003.09.009
Himanshu, H., Voelklein, M. A., Murphy, J. D., Grant, J., & O’Kiely, P. (2017). Factors
controlling headspace pressure in a manual manometric BMP method can be used to
produce a methane output comparable to AMPTS. Bioresource Technology, 238, 633–
642. [Link]

53
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Holliger, C., Alves, M., Andrade, D., Angelidaki, I., Astals, S., Baier, U., Bougrier, C.,
Buffière, P., Carballa, M., de Wilde, V., Ebertseder, F., Fernández, B., Ficara, E., Fotidis, I.,
Frigon, J.-C., de Laclos, H. F., Ghasimi, D. S. M., Hack, G., Hartel, M., … Wierinck, I. (2016).
Towards a standardization of biomethane potential tests. Water Science and Technology,
74(11), 2515–2522. [Link]
Iglesias Jiménez, E., & Pérez García, V. (1992). Relationships between organic carbon
and total organic matter in municipal solid wastes and city refuse composts. Bioresource
Technology, 41(3), 265–272. [Link]
Jingura, R. M., & Kamusoko, R. (2017). Methods for determination of biomethane
potential of feedstocks: A review. Biofuel Research Journal, 4(2), 573–586. [Link]
org/10.18331/BRJ2017.4.2.3
Justesen, C. G., Astals, S., Mortensen, J. R., Thorsen, R., Koch, K., Weinrich, S., Triolo,
J. M., & Hafner, S. D. (2019). Development and validation of a low-cost gas density meth-
od for measuring biochemical methane potential (BMP). Water (Switzerland), 11(12).
[Link]
Khan, M. A., Patel, P. G., Ganesh, A. G., Rais, N., Faheem, S. M., & Khan, S. T. (2018).
Assessing Methanogenic Archaeal Community in Full Scale Anaerobic Sludge Digester
Systems in Dubai, United Arab Emirates. The Open Microbiology Journal, 12(1), 123–134.
[Link]
Koch, K., Bajón Fernández, Y., & Drewes, J. E. (2015). Influence of headspace flush-
ing on methane production in Biochemical Methane Potential (BMP) tests. Bioresource
Technology, 186(February), 173–178. [Link]
Koch, K., Hafner, S. D., Weinrich, S., & Astals, S. (2019). Identification of Critical Prob-
lems in Biochemical Methane Potential (BMP) Tests From Methane Production Curves.
Frontiers in Environmental Science, 7(November), 1–8. [Link]
vs.2019.00178
Koch, K., Lippert, T., & Drewes, J. E. (2017). The role of inoculum’s origin on the meth-
ane yield of different substrates in biochemical methane potential (BMP) tests. Biore-
source Technology, 243, 457–463. [Link]
Lesteur, M., Bellon-Maurel, V., Gonzalez, C., Latrille, E., Roger, J. M., Junqua, G., & Stey-
er, J. P. (2010). Alternative methods for determining anaerobic biodegradability: A review.
Process Biochemistry, 45(4), 431–440. [Link]
Li, C., Nges, I. A., Lu, W., & Wang, H. (2017). Assessment of the degradation efficiency
of full-scale biogas plants: A comparative study of degradation indicators. Bioresource
Technology, 244, 304–312. [Link]
Li, L., He, Q., Wei, Y., He, Q., & Peng, X. (2014). Early warning indicators for monitoring
the process failure of anaerobic digestion system of food waste. Bioresource Technolo-
gy, 171, 491–494. [Link]

54
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Møller, H. B., Sommer, S. G., & Ahring, B. K. (2004). Methane productivity of manure,
straw and solid fractions of manure. Biomass and Bioenergy, 26(5), 485–495. [Link]
org/10.1016/[Link].2003.08.008
Moody, L., Burns, R., Wu-Haan, W., Spajic, R., & Spajić, R. (2009). Use of biochemical
methane potential (BMP) assays for predicting and enhancing anaerobic digester perfor-
mance. Proceedings of The 4th International and 44th Croatian Symposium of Agriculture,
930–934. [Link]
Nielfa, A., Cano, R., & Fdz-Polanco, M. (2015). Theoretical methane production gener-
ated by the co-digestion of organic fraction municipal solid waste and biological sludge.
Biotechnology Reports, 5(1), 14–21. [Link]
Owen, W. F., Stuckev, D. C., Healv, J. B., Young, L. Y., & Mccagrv, P. L. (1979). Bioassay
for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity. 13(5).
Raposo, F., Banks, C. J., Siegert, I., Heaven, S., & Borja, R. (2006). Influence of inoculum
to substrate ratio on the biochemical methane potential of maize in batch tests. Process
Biochemistry, 41(6), 1444–1450. [Link]
Raposo, F., De La Rubia, M. A., Fernández-Cegrí, V., & Borja, R. (2012). Anaerobic
digestion of solid organic substrates in batch mode: An overview relating to methane
yields and experimental procedures. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 16(1),
861–877. [Link]
Raposo, F., Fernández-Cegrí, V., de la Rubia, M. A., Borja, R., Béline, F., Cavinato, C., Demirer,
G., Fernández, B., Fernández-Polanco, M., Frigon, J. C., Ganesh, R., Kaparaju, P., Koubova, J.,
Méndez, R., Menin, G., Peene, A., Scherer, P., Torrijos, M., Uellendahl, H., … de Wilde, V. (2011).
Biochemical methane potential (BMP) of solid organic substrates: Evaluation of anaerobic
biodegradability using data from an international interlaboratory study. Journal of Chemical
Technology and Biotechnology, 86(8), 1088–1098. [Link]
Rozzi, A., & Remigi, E. (2004). Methods of assessing microbial activity and inhibition
under anaerobic conditions, a literature review. 93–115. [Link]
004-5762-z
Shayegan, J., Ghavipanjeh, F., & Mirjafari, P. (2005). The effect of influent COD and up-
ward flow velocity on the behaviour of sulphate-reducing bacteria. Process Biochemistry,
40(7), 2305–2310. [Link]
Souto, T. F., Aquino, S. F., Silva, S. Q., & Chernicharo, C. A. L. (2010). Influence of in-
cubation conditions on the specific methanogenic activity test. Biodegradation, 21(3),
411–424. [Link]
Strömberg, S., Nistor, M., & Liu, J. (2014). Towards eliminating systematic errors
caused by the experimental conditions in Biochemical Methane Potential (BMP) tests.
Waste Management, 34, 1939–1948. [Link]

55
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

Strong, P. J., Kalyuzhnaya, M., Silverman, J., & Clarke, W. P. (2016). A methano-
troph-based biorefinery: potential scenarios for generating multiple products from a sin-
gle fermentation. Bioresource Technology, 215, 314–323.
Symons, G. E., & Buswell, A. M. (1933). The methane fermentation of carbohydrates1,
2. Journal of the American Chemical Society, 55(5), 2028–2036.
Tabatabaei, M., & Ghanavati, H. (2018). [Link], process and opera-
tion. In Biofuel and biorefinery technologies (p. 471). Springer International Publishing
AG. [Link]
Tanimu, M. I., Ghazi, T. I. M., Harun, M. R., & Idris, A. (2014). Effect of Feed Loading
on Biogas Methane Production in Batch Mesophilic Anaerobic Digesters Treating Food
Waste. In International Journal of Chemical and Environmental Engineering (Vol. 5, Issue 1).
V.D.I. (2006). VDI 4630. Fermentation of organic materials. Characterization of the sub-
strate, sampling, collection of material data, fermentation tests. ICS 13.030.30; 27.190
Valero, D., Montes, J. A., Rico, J. L., & Rico, C. (2016). Influence of headspace pressure
on methane production in Biochemical Methane Potential (BMP) tests. Waste Manage-
ment, 48, 193–198. [Link]
Wang, B., Björn, A., Strömberg, S., Nges, I. A., Nistor, M., & Liu, J. (2017). Evaluating the
influences of mixing strategies on the Biochemical Methane Potential test. Journal of En-
vironmental Management, 185, 54–59. [Link]
Wang, B., Strömberg, S., Li, C., Nges, I. A., Nistor, M., Deng, L., & Liu, J. (2015). Ef-
fects of substrate concentration on methane potential and degradation kinetics in batch
anaerobic digestion. Bioresource Technology, 194, 240–246. [Link]
biortech.2015.07.034
Ye, Y., Zamalloa, C., Lin, H., Yan, M., Schmidt, D., & Hu, B. (2015). Evaluation of anaer-
obic co-digestion of dairy manure with food wastes via bio-methane potential assay and
CSTR reactor. Journal of Environmental Science and Health, Part B, 50(3), 217–227.
Yilmaz, V. (2015). A straightforward method: Biochemical methane potential assay.
International Conference Renewable Energy Research and Applications (ICRERA 2015),
148–150.
Zaman, N. Q. (2010). the Applicability of Batch Tests To Assess Biomethanation Potential
of Organic Waste and Assess Scale Up To Continuous Reactor Systems. PhD Thesis, 293.

56
 Abreviaturas

AGV: Ácidos grasos volátiles

AME: Actividad metanogénica específica
APHA: American Public Health Association
ASTM: American Society for Testing and Materials
C:N:P:S: Relación entre Carbono: Nitrógeno: Fósforo: Azufre
C/N: Relación entre el carbono y el nitrógeno
CaCO3: Carbonato de calcio
CH4: Metano
CO2: Dióxido de carbono
DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DIN: Deutsches Institut für Normung
DQO: Demanda química de oxígeno
FISH: Fluorescence In Situ Hybridization
FORSU: Fracción orgánica de residuos sólidos urbanos
FTIR: Infrarrojo de transformada de Fourier
H2S: Acido sulfúrico
IB: Índice de biodegradabilidad
IR: Infrarrojo
ISO: International Organization for Standardization
KOH: Hidróxido de potasio
LiOH: Hidróxido de litio
N-NH3: Nitrógeno amoniacal
NaOH: Hidróxido de sodio
NIR: Infrarrojo cercano

57
 Ensayo potencial bioquímico metanogénico

PBM: Potencial bioquímico metanogénico

PBMe: Potencial bioquímico metanogénico experimental
PBMT: Potencial bioquímico metanogénico teórico
PCR: polymerase chain reaction
RPM: Revoluciones por minuto
S/I: Relación entre el sustrato y el inóculo
SSV: Sólidos suspendidos volátiles
ST: Sólidos totales
SV: Sólidos volátiles
VDI: Verein Deutscher Ingenieure

58