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Manual  Analítico  Bacteriológico  (BAM)

Capítulo  10:  Detección  de  Listeria  
monocytogenes  en  alimentos  y
Muestras  ambientales  y  enumeración  de  Listeria  
monocytogenes  en  alimentos

Autores:  Anthony  D.  Hitchins  (retirado)  y  Karen  Jinneman  y  Yi  Chen

abril  2022

https://www.fda.gov/food/laboratory­methods­food/bacteriological­analytical­manual­bam
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Tabla  de  contenido

Revisión  histórica ................................................ .................................................... ..........................  3
Introducción................................................. .................................................... ....................................  4

A.  Equipos  y  materiales .................................................. .................................................... ............  4

B.  Medios  y  reactivos ............................................... .................................................... .....................  5
C.  Cultivos  de  control .................................................. .................................................... .........................  6

D.  Preparación  de  la  muestra .............................................. .................................................... .....................  7
E.  Procedimiento  de  enriquecimiento .............................................. .................................................... ..........  8

F.  Metodologías  de  detección  alternativas ............................................... .............................................  8
G.  Procedimiento  de  aislamiento .............................................. .................................................... ....................  11

H.  Procedimiento  de  identificación ............................................. .................................................... ..........  12

I.  Subtipificación  de  aislamientos  de  L.  monocytogenes  (obligatorio) ....................................... ..........................  17

J.  Enumeración  (obligatorio) ............................................... .................................................... ...............  18
Referencias.................................................. .................................................... ....................................  20

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Revisión  histórica
•  Abril  de  2022:  Sección  E.2  corrección  de  las  cantidades  de  aditivos,  Sección  J.  aclaración  sobre  la  
enumeración  de  preparaciones  de  homogeneizados  •  Febrero  de  2022:  Sección  E.2,  corrección  de  las  
cantidades  de  aditivos;  Sección  J,  aclaración  sobre  la  enumeración  de  preparaciones  de  homogeneizados;  edición  
de  otras  secciones.  •  Marzo  2017:  Adición  de  la  matriz  muestral  para  muestras  ambientales.  •  Enero  de  2016:  
instrucciones  más  específicas  de  preparación  de  muestras  y  configuración  analítica  para

detección  cualitativa  o  enumeración  cuantitativa.  •  Enero  
2016:  Reorganización  y  edición  de  todas  las  secciones.  •  febrero  de  2013:  
actualización  de  la  Tabla  1;  actualización  para  BAM  Media  M52:  Caldo  de  
enriquecimiento  para  Listeria  tamponado  (BLEB)  en  la  sección  Medios.
•  Noviembre  de  2011:  Adición  de  confirmación  por  PCR  para  Listeria
monocytogenes  y  Listeria  spp.  aislamientos  distintos  de  L.  grayi.
•  Abril  de  2011:  Se  agregó  la  Sección  E.  Diagrama  que  describe  el  sistema  óptico  Henry  para  el  examen  de  colonias;  
se  actualizaron  las  referencias  para  la  evaluación  de  riesgos  y  orientación  de  Listeria  monocytogenes .

•  Agosto  de  2002:  Sección  J.  Enumeración:  Se  agregaron  instrucciones  para  resultados  positivos  en  todos  los  MPN.
tubos

•  Abril  de  2001:  Sección  H.  Prueba  CAMP:  se  actualizó  la  dirección  de  ATCC  y  se  agregó  un  enlace  a  su
Página  web.

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Introducción

El  género  Listeria  contiene  6  especies:  L.  monocytogenes,  L.  innocua,  L.  seeligeri,  L.  welshimeri,  L.  ivanovii  y  L.  
grayi  (Cuadro  1).  L.  grayi  (28,  40)  y  L.  ivanovii  (13,  27)  contienen  cada  una  dos  subespecies,  que  no  es  necesario  especificar  
en  este  análisis.  Una  revisión  taxonómica  del  género  realizada  por  Rocourt  (41)  en  1999  actualizó  las  revisiones  anteriores  (11,  
43).  En  los  últimos  años,  se  propusieron  muchas  especies  nuevas.  Sin  embargo,  estas  nuevas  especies  no  son  ampliamente  
adoptadas  y  el  número  de  cepas  tipo  para  las  nuevas  especies  propuestas  es  muy  limitado.  L.  ivanovii  y  L.  monocytogenes  son  
patógenos  para  ratones  y  otros  animales.  Sin  embargo,  solo  L.  monocytogenes  se  asocia  comúnmente  con  la  listeriosis  humana.  
La  infección  asociada  a  listeriosis  por  L.  ivanovii,  e  incluso  por  L.  seeligeri,  es  extremadamente  rara  en  humanos.  La  aparición  
universal  de  L.  monocytogenes  en  los  alimentos  (42)  y  el  riesgo  de  contraer  listeriosis  transmitida  por  los  alimentos  (47,48)  se  han  
revisado  exhaustivamente  recientemente.  Este  capítulo  describe  la  detección  y  enumeración  de  L.  monocytogenes  en  los  
alimentos  y  la  detección  en  el  entorno  de  procesamiento  de  alimentos.

Esta  metodología  estándar  y  las  metodologías  rápidas  alternativas  están  destinadas  a  la  detección  y  el  aislamiento  de  L.  
monocytogenes  a  partir  de  alimentos  y  muestras  ambientales.  El  tamaño  de  la  muestra  analítica  para  alimentos  es  generalmente  
de  25  g,  y  puede  ser  de  unidades  individuales  o  como  parte  de  una  muestra  compuesta.

Alternativamente,  los  kits  de  prueba  rápida  con  sus  respectivos  medios  de  enriquecimiento  aprobados  como  métodos  oficiales  de  
análisis  (OMA)  de  la  AOAC  se  pueden  usar  condicionalmente  para  detectar  la  presencia  de  contaminantes  de  Listeria .  Los  
aislados  putativos  de  Listeria  en  agares  selectivos  a  partir  de  enriquecimientos  estándar  o  de  cribado  positivo  se  purifican  en  
agares  no  selectivos  y  se  confirman  mediante  pruebas  de  identificación  convencionales  o  mediante  una  batería  de  dichas  pruebas  
en  forma  de  kit.  Los  aislamientos  pueden  confirmarse  rápidamente  como  L.  monocytogenes  (o  no)  mediante  el  uso  de  kits  de  
prueba  específicos  o  procedimientos  de  PCR.  En  general,  se  espera  la  subtipificación  de  los  aislamientos  de  L.  monocytogenes ,  
que  incluye  la  tipificación  serológica  y  la  secuenciación  del  genoma  completo.  Las  pruebas  opcionales  de  patogenicidad  de  los  
aislamientos  de  L.  monocytogenes  se  describen  en  la  Sección  H.

La  enumeración  de  L.  monocytogenes  en  muestras  de  alimentos  positivas  se  realiza  en  la  muestra  de  reserva  mediante  el  
recuento  de  colonias  en  agares  selectivos  diferenciales  de  L.  monocytogenes  junto  con  la  enumeración  de  NMP  usando  
enriquecimiento  selectivo  en  caldo  de  enriquecimiento  de  Listeria  tamponado  con  posterior  cultivo  en  placas  en  agares  selectivos  
diferenciales  de  L.  monocytogenes  como  se  describe  a  continuación. .

A.  Equipos  y  Materiales
La  FDA  no  respalda  específicamente  ninguno  de  los  productos  comerciales  enumerados.  Es  posible  que  haya  productos  
equivalentes  disponibles.

1.  Hisopo  estéril:  Lo  siguiente  o  equivalente:

a.  3M™  Swab­sampler  en  10  ml  de  caldo  neutralizante  D/E  (n.°  de  catálogo
RS96010DE,  www.mmm.com)  (Poliéster).

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b.  Hisopo  de  algodón  seco  Puritan®  (n.°  de  catálogo  25­806  1PC,  25­806  
2PC,  www.puritanmedproducts.com)  (Algodón).
C.  Muestreador  de  hisopo  PUR­Blue™  de  World  Bioproducts  con  (n.º  de  catálogo  BLU­10DE)  o
sin  (catálogo  #  BLU­DRY,  www.worldbioproducts.com)  10  ml  de  caldo  neutralizante  D/E  (Poliuretano).

d.  Transportador  de  hisopos  secos  Healthlink®  (n.º  de  catálogo  4159BX,  www.hardydiagnostics.com)
(Poliéster).

2.  Esponja  estéril:  Lo  siguiente  o  equivalente:

a.  Muestreador  de  esponja  EZ  Reach™  de  World  Bioproducts  con  (n.º  de  catálogo  EZ­10DE­PUR)  o
sin  (catálogo  #  EZ­DRY­PUR,  www.worldbioproducts.com)  10  ml  de  caldo  neutralizante  D/E  (Poliuretano).  
b.  Sonda  de  esponja  seca  Whirl­Pak®  de  Nasco  (n.º  de  catálogo  B01475WA,  www.enasco.com)

(Celulosa).
C.  3M™  Sponge­sticks  con  (catálogo  #  SSL10DE,  www.mmm.com)  o  sin  (catálogo#
SSL100)  10  ml  Caldo  neutralizante  D/E  (Celulosa).

Si  están  disponibles,  se  pueden  obtener  muestreadores  secos  y  añadir  caldo  neutralizante  D/E  más  tarde,  o  
se  pueden  obtener  muestreadores  prehumedecidos.  No  recomendamos  menos  de  10  ml  de  caldo  neutralizante  D/
E  debido  a  la  posible  presencia  de  residuos  de  desinfectante  en  las  superficies  ambientales.

3.  Balanza  para  pesar  muestras  hasta  0,1  g

4.  Incubadoras,  30,  35  y  37  °C

5.  Baño  de  agua,  80  ±  2°C

6.  Microscopio  de  contraste  de  fase  con  objetivo  de  fase  de  inmersión  en  aceite  (100×)

7.  Motor  de  batidora  y  jarras  o  Stomacher  y  bolsas

8.  Mezclador  de  vórtice

B.  Medios  y  reactivos

La  FDA  no  respalda  específicamente  ninguno  de  los  productos  comerciales  enumerados.  Es  posible  que  haya  productos  
equivalentes  disponibles.

1.  Caldo  de  enriquecimiento  para  Listeria  tamponado  (BLEB)  (M52)
2.  Monoclorhidrato  de  acriflavina  3.  Ácido  
nalidíxico  (sal  de  sodio)
4.  Cicloheximida  5.  
Natamicina  (pimaricina)
6.  Caldo  neutralizante  Dey/Engley  (D/E)  (M193)
7.  Medio  Oxford  (OXA)  (M118)
8.  Polimixina  acriflavina  litio  cloruro  ceftazidima  esculina  manitol  (PALCAM)
(M118a)

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9.  Agar  Oxford  MOX  modificado  (M103a)
10.  Agar  de  cloruro  de  litio­feniletanol­moxalactama  (LPM)  (M81)  con  esculina  añadida  y
hierro  (M82)
11.  R&F®  Listeria  monocytogenes  Chromogenic  Plating  Medium  (R&F  Laboratories,
Downers  Grove,  IL)  (M17a)
12.  Agar  Listeria  según  Ottaviani  y  Agosti  (M10a)
13.  Agar  cromogénico  para  Listeria  Oxoid™  (Oxoid  Ltd.,  Basingstoke,  Inglaterra)  (M40b)
14.  Rapid'L.mono™  (Bio­Rad  Laboratories  Inc.)  (M131a)
15.  Listeria  CHROMagar™  (CHROMagar,  París,  Francia)  (M40a)
16.  Agar  tripticasa  de  soja  con  extracto  de  levadura  al  0,6  %  (TSAye)  (M153)
17.  Agar  sangre  de  carnero  (M135)
18.  Solución  de  peróxido  de  hidrógeno  al  3%  para  prueba  de  catalasa  (R12)
19.  Kit  de  tinción  de  

Gram  20.  Medio  de  prueba  de  motilidad  (MTM,  Difco™)  (M103)
21.  Caldo  de  soja  tripticasa  con  extracto  de  levadura  al  0,6  %  (TSBye)  (M157)
22.  Base  de  caldo  de  fermentación  de  carbohidratos  púrpura  (M130),  que  contienen  soluciones  al  0,5%  de
dextrosa,  esculina,  maltosa,  ramnosa,  manitol  y  xilosa  23.  Solución  salina  
fisiológica,  0,85%  (R63)
24.  Tampón  de  anticuerpos  fluorescentes  (FA)  (Difco™)
25.  Sueros  de  tipificación  de  Listeria  tipo  1  (n.º  de  catálogo  Difco™  223031)  y  tipo  4  (n.º  de  catálogo  Difco™
223041)
26.  Juego  de  antisueros  para  Listeria  (catálogo  Denka  Seiken™  n.°  294616)
27.  Opcional:  medio  de  reducción  de  nitrato  (M108)  y  reactivos  de  detección  de  nitrato  (R48)

Nota:  Se  pueden  utilizar  empresas  alternativas  cuando  los  productos  son  equivalentes.

C.  Cultivos  de  control
1.  Listeria  monocytogenes  ATCC  19115  2.  Listeria  
innocua  ATCC  33090  3.  Listeria  seeligeri  ATCC  

35967  4.  Listeria  ivanovii  ATCC  19119

5.  Rhodococcus  equi  ATCC  6939  6.  
Staphylococcus  aureus  ATCC  25923  o  ATCC  49444

Las  cepas  de  control  de  proteína  fluorescente  verde  (GFP)  que  emiten  fluorescencia  bajo  la  luz  UVA,  en  
longitudes  de  onda  entre  360  y  400  nm,  han  sido  desarrolladas  por  la  FDA  y  han  sido  autorizadas  por  la  FDA  a  
Microbiologics  para  su  distribución  (https://www.microbiologics.com ;  200  Cooper  Avenue  North  St.  Cloud,  MN  56303,  
1­800­599­2847).  Los  siguientes  cultivos  se  pueden  comprar  en  Microbiologics:

Listeria  monocytogenes  (1/2a) /  FDALS808,  n.º  de  catálogo  01249UV

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D.  Preparación  de  muestras

Las  prácticas  de  transporte  y  almacenamiento  de  muestras  deben  mantener  las  condiciones  de  almacenamiento  recomendadas  
para  el  producto  alimenticio.  El  análisis  de  la  muestra  debe  iniciarse  lo  antes  posible  tras  la  recepción  de  la  muestra.  Si  se  debe  
retrasar  el  análisis  de  la  muestra,  almacene  las  muestras  congeladas  congeladas  (­20  ±  5  °C);  almacene  alimentos  no  
perecederos,  enlatados  o  con  bajo  contenido  de  humedad  a  temperatura  ambiente,  y  almacene  alimentos  perecederos  no  
congelados  y  refrigerados  a  4  ±  2  °C  hasta  que  se  inicie  el  análisis  de  la  muestra.

Las  opciones  analíticas  básicas  incluyen:  1.  Detección  cualitativa  (límite  de  detección  <1  CFU  por  unidad  analítica),  2.  
Determinación  cuantitativa.

1.  Detección  cualitativa  de  alimentos  y  muestras  ambientales:

a.  Análisis  de  submuestras  individuales:  para  sólidos,  semisólidos  o  líquidos,  agregue  25  g
porción  representativa  de  225  ml  de  BLEB  que  contiene  piruvato  sin  aditivos  selectivos  (BLEB  basal)  
(M52)  (10,  26).  Mezcle  bien,  mezcle  o  estome,  continúe  el  enriquecimiento  como  se  describe  en  la  sección  E  o  F.  
Ciertos  alimentos  pueden  requerir  diferentes  procedimientos  de  configuración  de  la  muestra,  como  remojo  y  
enjuague.  Se  debe  reservar  una  porción  de  50  g  de  la  muestra  para  una  posible  enumeración  de  patógenos.  
Guárdelo  a  5°C  si  no  está  congelado  o,  si  está  congelado,  en  un  congelador  que  no  se  descongele.  Consulte  los  
documentos  de  orientación  de  cumplimiento  de  muestreo  aplicables  para  obtener  instrucciones  adicionales.

b.  Análisis  de  muestras  compuestas:  las  muestras  compuestas  se  pueden  usar  para  analizar  múltiples  subunidades
de  una  sola  muestra.  Consulte  los  documentos  de  orientación  de  cumplimiento  de  muestreo  aplicables  para  
conocer  los  procedimientos  compuestos  específicos.  Generalmente,  se  preparan  dos  compuestos  a  partir  de  una  
muestra  que  consta  de  10  submuestras  (líquido,  crema  o  alimento  sólido).  Para  preparar  un  compuesto,  se  
agrupan  porciones  representativas  de  50  g  o  ml  de  cada  una  de  las  5  submuestras  y  se  agregan  250  ml  de  BLEB  
basal  sin  agentes  selectivos  y  luego  se  mezclan  o  se  estoman  (M52) .  Una  porción  de  50  g  de  esta  mezcla  
compuesta  (equivalente  a  25  g  de  alimento  más  25  ml  de  BLEB  basal)  se  combina  con  200  ml  de  BLEB  basal.  
Luego,  el  compuesto  se  incuba  como  se  describe  en  la  Sección  E  o  F.

C.  Muestras  ambientales:  Al  tomar  muestras  de  superficies  secas,  hisopos  (algodón,  poliéster  o
poliuretano)  o  esponjas  (celulosa  o  poliuretano)  deben  humedecerse  previamente  en  10  ml  de  caldo  neutralizante  
Dey/Engley  (D/E).  Los  hisopos  generalmente  se  almacenan  en  contenedores  de  tubos  y  las  esponjas  generalmente  
se  almacenan  en  contenedores  de  bolsas.  Antes  de  tomar  muestras,  presione  los  hisopos  contra  las  paredes  del  
tubo  interior  o  apriete  las  esponjas  en  bolsas  para  eliminar  el  exceso  de  caldo.  Limpie  las  superficies  ambientales  
usando  una  presión  firme  y  uniforme  verticalmente  (aproximadamente  10  veces),  luego  voltee  la  muestra  y  use  el  
otro  lado  para  frotar  horizontalmente  (aproximadamente  10  veces)  y  diagonalmente  (aproximadamente  10  veces).  
Cuando  vuelva  a  colocar  las  muestras  en  el  recipiente,  asegúrese  de  que  estén  sumergidas  en  el  caldo  neutralizante  
D/E.  Al  tomar  muestras  de  superficies  mojadas,  se  deben  usar  hisopos  o  esponjas  secas  y  ponerlas  en  caldo  
neutralizador  D/E  inmediatamente  después  de  la  toma  de  muestras.  Los  hisopos  que  están  hechos  de  algodón  o  
que  tienen  puntas  grandes  parecen  absorber  mejor  el  líquido  que  otros.  para  muestras

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que  no  son  adecuados  para  ser  recolectados  con  hisopos/esponjas  de  tamaño  regular  mencionados  
en  la  sección  A,  consulte  los  documentos  de  orientación  de  cumplimiento  de  muestreo  aplicables  para  
obtener  instrucciones  adicionales.  Después  del  muestreo,  la  torunda/esponja  se  puede  mantener  en  caldo  
neutralizante  D/E  a  4  °C  hasta  48  h  antes  del  análisis.  Luego  se  agrega  una  torunda/esponja  sumergida  en  
caldo  neutralizante  D/E  a  90  ml  (o  más  para  sumergir  completamente  la  torunda  o  la  esponja)  de  BLEB  
basal  (M52).  También  se  puede  agregar  esponja  en  caldo  neutralizante  D/E  a  225  ml  de  BLEB  basal.  
Masajee  a  fondo  o  en  el  estómago  para  expulsar  el  caldo  de  recolección  al  caldo  de  enriquecimiento.  
Continúe  el  enriquecimiento  como  se  describe  en  la  Sección  E  o  F.

d.  Interprete  el  resultado:  la  confirmación  de  uno  o  más  aislamientos  de  L.  monocytogenes  de  un  
enriquecimiento  indica  que  L.  monocytogenes  está  presente  en  ≥  1  CFU  por  tamaño  de  muestra  
analizado  o  presente  en  una  muestra  ambiental  con  hisopo  o  esponja.

2.  Determinación  cuantitativa  a  partir  de  alimentos:

La  enumeración  se  realiza  mediante  una  combinación  de  MPN  y  placas  directas.  Consulte  la  Sección  J  para  obtener  
más  detalles.  Las  muestras  de  vigilancia  generalmente  se  analizan  primero  mediante  detección  cualitativa  y  luego  se  
enumeran  las  porciones  de  reserva  de  las  muestras  positivas.  Para  situaciones  de  respuesta  a  brotes,  todas  las  
muestras  pueden  enumerarse  directamente.  Consulte  la  Sección  J  y  los  documentos  de  orientación  de  cumplimiento  de  
muestreo  aplicables.

E.  Procedimiento  de  enriquecimiento

1.  Incubar  muestras  de  alimentos  o  muestras  ambientales  homogeneizadas  en  BLEB  basal  (M52,  43)  a  30°C,  
durante  4  h.

2.  Añadir  asépticamente  los  tres  agentes  selectivos  esterilizados  por  filtro  (M52)  para  lograr  concentraciones  finales  de  
10  mg/L  de  acriflavina,  50  mg/L  de  cicloheximida  y  40  mg/L  de  ácido  nalidíxico  sódico  en  los  preenriquecimientos  de  
BLEB.

3.  Mezcle  el  enriquecimiento  con  aditivos  y  continúe  la  incubación  a  30  °C  durante  el  resto  del  período  de  enriquecimiento  
de  24  a  48  h.

F.  Metodologías  de  detección  alternativas

Las  siguientes  metodologías  alternativas  de  detección  se  pueden  utilizar  para  detectar  la  presencia  de  Listeria  
en  las  muestras.  Siga  el  prospecto  del  paquete  de  los  fabricantes  asegurándose  de  que  no  se  hayan  desviado  de  
las  versiones  aprobadas  de  los  protocolos  del  Manual  Oficial  de  Métodos  Internacionales  de  la  AOAC  (Sección  
F.1).  Los  kits  solo  están  aprobados  para  las  matrices  alimentarias  y  ambientales  especificadas,  reivindicadas  en  el  
método  OMA,  que  varían  de  un  kit  a  otro.  Para  otras  matrices  que  no  están  validadas,  es  necesaria  una  validación  de  
extensión  de  matriz.  Los  resultados  negativos  obtenidos  con  los  productos  se  consideran  definitivos  y  no  se  requieren  
más  pruebas.  Los  presuntos  resultados  positivos  con  estos  métodos  de  detección  rápida  deben  confirmarse  sembrando  
en  los  agares  selectivos  y  confirmando  los  aislamientos  a  nivel  de  especie  mediante  los  procedimientos  descritos  en  las  
Secciones  GI.

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1.  Métodos  de  detección  rápida  de  Listeria  spp.:

a.  Método  Oficial  AOAC  993.09.  Hibridación  colorimétrica  del  ácido  desoxirribonucleico
(Ensayo  GENE­TRAK  Listeria )  (3,  16).
(Aplicable  a  lácteos,  carnes  y  mariscos)
Estudio  colaborativo:  leche  (2%),  queso  brie,  carne  de  cangrejo  cocida,  salchichas  frankfurt,  rosbif,  carne  de  
cerdo  molida  cruda  Precolaboración:  carne  de  cangrejo,  camarones  crudos,  queso  cheddar,  requesón,  
helado,  leche  con  chocolate,  leche  en  polvo  sin  grasa,  filete  de  pescado,  cerdo  crudo  molido,  salchicha  
fermentada,  pavo  molido  crudo

b.  Método  Oficial  AOAC  994.03.  Método  colorimétrico  monoclonal  de  ensayo  inmunoabsorbente  
ligado  a  enzimas  (Listeria­Tek)  (4,  17,  31).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  mariscos,  carnes)
Estudio  colaborativo:  frankfurts,  rosbif  empacado  al  vacío,  queso  brie,  leche  2%,  camarones  crudos  congelados  
sin  cáscara,  cangrejo  cocido  congelado  Precolaborativo:  carne  de  cangrejo,  helado,  leche,  leche  chocolatada,  
leche  en  polvo  sin  grasa,  pescado  crudo,  cocido  ternera,  rosbif,  jamón  serrano,  chorizo  crudo,  ostra  cruda,  
pollo  crudo,  pavo  crudo

C.  Método  Oficial  AOAC  995.22.  2000.  Método  de  detección  mediante  inmunoensayo  enzimático  policlonal  
colorimétrico  (TECRA™  Listeria  Visual  Immunoassay)  (5,  29).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  mariscos,  aves,  carnes  (no  carne  molida  cruda),  verduras  de  hoja)

Estudio  colaborativo:  filetes  de  pescado,  helado,  lechuga,  pollo,  pavo  molido  Precolaborativo:  
carne  de  cangrejo,  camarones,  queso  suave,  leche  con  chocolate,  leche  en  polvo  sin  grasa,  carne  cruda,  rosbif,  
salchichas  frankfurt,  mortadela,  ostras,  pollo
d.  Método  Oficial  AOAC  2002.09.  Inmunoensayo  visual  TECRA™  Listeria  utilizando
Caldo  de  enriquecimiento  para  Listeria  TECRA  (32,  5,  29).
(Aplicable  a  carnes  crudas  y  procesadas,  productos  lácteos  cultivados  y  no  cultivados)
Nota:  El  método  se  basa  en  995.22  pero  con  enriquecimiento  alterado,  omisión  de  cicloheximida  
y  alimentos  adicionales.
Estudio  colaborativo:  filetes  de  pescado,  pavo,  carne  cruda  molida,  helado,  lechuga  e.  Método  
Oficial  AOAC  996.14.  Método  de  inmunoensayo  de  enzimas  policlonales  Assurance®
(ESTO)  (6,  19).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  carnes  rojas,  cerdo,  productos  avícolas,  frutas,  frutos  secos,  mariscos,  pasta,  
verduras,  queso,  harina  animal,  chocolate  y  huevos,  harina  de  huesos  y  de  superficies  ambientales)

Estudio  colaborativo:  leche  descremada  en  polvo,  helado,  aves  crudas,  camarones  crudos,  rosbif  cocido,  judías  
verdes  Precolaborativo:  carne  de  cangrejo,  queso  blando,  huevo  seco,  huevo  líquido  congelado,  leche,  leche  
chocolatada,  pescado  crudo,  harina  de  huesos,  crudo  carne  de  res,  cerdo  crudo,  vieiras,  chocolate,  nueces,  
pasta,  pollo  crudo,  ensalada  de  col

F.  Método  Oficial  AOAC  997.03.  Ensayo  de  inmunoprecipitado  visible  (VIP)  (7,  20).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  carnes  rojas,  cerdo,  aves  y  productos  avícolas,  mariscos,  frutas,  verduras,  
nueces,  pasta,  chocolate,  huevos  y  harina  de  huesos,  y  superficies  ambientales)

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Estudio  colaborativo:  leche  en  polvo  sin  grasa,  helado,  aves  crudas,  camarones  crudos,  rosbif  cocido,  judías  
verdes,  superficies  ambientales
gramo.  Método  Oficial  AOAC  999.06.  Ensayo  inmunofluorescente  ligado  a  enzimas  (ELFA)
Método  de  detección  del  ensayo  VIDAS®  LIS  (8,  21).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  vegetales,  mariscos,  carnes  y  aves  crudas  y  carnes  y  aves  
procesadas)
Estudio  colaborativo:  helado,  judías  verdes,  pescado,  pavo,  queso,  rosbif  h.  Método  Oficial  
AOAC  2004.06.  Método  de  selección  de  ensayo  VIDAS®  LIS  modificado  (36).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  vegetales,  mariscos,  carnes  y  aves  crudas  y  carnes  y  aves  procesadas)

Estudio  colaborativo:  queso  brie,  helado,  pescado,  judías  verdes,  rosbif  i.  Método  Oficial  
AOAC  2010.02.  Método  de  detección  del  ensayo  VIDAS®  LSX  (35).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  vegetales,  mariscos,  carnes  y  aves  crudas  y  carnes  y  aves  procesadas)

Estudio  colaborativo:  helado  de  vainilla,  queso  cheddar,  carne  de  res  molida  cruda,  judías  verdes  congeladas,  
deli  de  pavo,  camarones  cocidos  j.  Método  Oficial  AOAC  2013.10.  Kit  de  ensayo  VIDAS®  UP  Listeria  (LPT)  
(36).
(Aplicable  a  jamón  fiambre  (25  y  125  g),  pepperoni  (25  g),  perritos  calientes  de  ternera  (25  g),  nuggets  de  
pollo  (25  g),  paté  de  hígado  de  pollo  (25  g),  carne  picada  (125  g),  pavo  fiambre  (125  g),  camarones  cocidos  (25  
g),  salmón  ahumado  (25  g),  melón  cantalupo  entero,  ensalada  mixta  en  bolsa  (25  g),  mantequilla  de  maní  (25  g),  
pimienta  negra  (25  g),  helado  de  vainilla  (25  g),  queso  fresco  (25  y  125  g),  superficies  ambientales  de  acero  
inoxidable,  plástico,  cerámica  y  hormigón)
Estudio  colaborativo:  queso  fresco

Consulte  los  datos  complementarios,  Tablas  2A–D,  para  obtener  resultados  detallados  del  estudio  colaborativo  sobre  J.
Internacional  de  la  AOAC  sitio  web,  http://aoac.publisher.ingentaconnect.com/content/aoac/jaoac.

2.  Métodos  de  detección  rápida  de  Listeria  monocytogenes:  tenga  en  cuenta  que  estos  métodos  no  detectan  Listeria  
spp.  y  por  lo  tanto  puede  no  ser  adecuado  para  situaciones  en  las  que  la  identificación  de  Listeria  spp.  es  deseado.

a.  Método  Oficial  AOAC  2003.12.  Sistema  Automatizado  BAX®  (9).
(Aplicable  a  productos  lácteos,  frutas  y  verduras  [excepto  rábanos],  mariscos,  carnes  crudas  y  procesadas  y  
aves)
Estudio  colaborativo:  salchichas  tipo  frankfurt,  queso  blando,  salmón  ahumado,  carne  picada,  rábanos,  
guisantes
b.  Método  Oficial  AOAC  2004.02.  Ensayo  inmunofluorescente  ligado  a  enzimas  (ELFA)
Método  de  detección  del  ensayo  VIDAS®  LMO2  (33).
(Aplicable  a  L.  monocytogenes  en  productos  lácteos,  vegetales,  mariscos,  carnes  y  aves  crudas,  y  carnes  y  
aves  procesadas)
Estudio  colaborativo:  helado  de  vainilla,  queso  brie,  rosbif  cocido,  judías  verdes  congeladas,  tilapia  congelada  
c.  Método  Oficial  AOAC  2013.11.  Ensayo  VIDAS®  Listeria  monocytogenes  (LMX)  (37).

(Aplicable  a  jamón  fiambre  (25  y  125  g),  salchicha  fermentada  (25  g),  paté  de  hígado  (25  g),

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queso  procesado  (25  g),  helado  de  vainilla  (25  g),  camarones  cocidos  (25  g),  pescado  blanco  ahumado  (25  
g),  espinacas  congeladas  (25  g),  mantequilla  de  maní  (25  g),  pavo  (25  y  125  g),  queso  fresco  (125  g)  y  carne  
picada  (125  g))
Estudio  colaborativo:  queso  fresco

G.  Procedimiento  de  aislamiento

1.  A  las  24  y  48  h,  sembrar  los  enriquecimientos  de  BLEB  en  un  agar  selectivo  basado  en  esculina  y  uno  
cromogénico  de  cada  una  de  las  categorías  enumeradas  en  las  Secciones  G.1.A  y  G.1.B.  Incubar  las  placas  durante  un  
máximo  de  48  h.  Consulta  de  placas  tanto  a  las  24  h  como  a  las  48  h.

A.  Esculin  based  Listeria  selective  agars:  

a.  Agar  Oxford  (OXA)  (18)  (M118):  Después  de  24  h  de  incubación  a  35°C
Las  colonias  típicas  de  especies  de  Listeria  tienen  aproximadamente  1  mm  de  diámetro,  colonias  de  
color  gris  a  negro  rodeadas  por  un  halo  negro.  Después  de  48  h  de  incubación,  las  colonias  típicas  
de  especies  de  Listeria  tienen  aproximadamente  2­3  mm  de  diámetro,  son  negras  con  un  halo  negro  y  
el  centro  hundido.  b.  PALCAM  (50)  (M138a):  Condiciones  de  incubación  y  apariencia.

Las  colonias  de  especies  de  Listeria  son  las  mismas  que  para  el  agar  Oxford  excepto  que  el  
color  de  la  placa  de  fondo  es  rojo.  C.  Agar  Oxford  modificado  (MOX)  (46)  (M103a):  Las  
condiciones  de  incubación  y  la  apariencia  de  las  colonias  de  especies  de  Listeria  son  las  mismas  
que  para  el  agar  Oxford.
d.  L/min  (30)  (M81)  fortificado  con  esculina  y  Fe3+:  Incubar  a  30°C.
La  apariencia  típica  de  las  colonias  de  especies  de  Listeria  es  similar  al  agar  Oxford.

B.  Cromogénico  L.  monocytogenes­L.  agares  de  ivanovii :

a.  R&F®  Listeria  monocytogenes  medio  cromogénico  en  placas  (R&F®  LMCPM)
(39,  25)  (M17a):  Incube  las  placas  a  35  °C,  L.  monocytogenes  y  L.  ivanovii  producen  
una  colonia  de  1­3  mm  de  diámetro,  suave,  convexa,  azul/verde  y  un  pequeño  halo  azul/verde.  
Todas  las  demás  especies  de  Listeria  producen  una  colonia  blanca,  lisa,  convexa  y  sin  halo  de  
1­2  mm.  Las  colonias  típicas  de  L.  monocytogenes  y  L.  ivanovii  se  pueden  distinguir  mediante  
un  medio  de  confirmación  comercial  (laboratorios  R&F)  o  mediante  los  métodos  de  identificación  
descritos  en  la  sección  H.  b.  RAPID'L.mono™  (M131a):  Incube  las  placas  a  37°C,  L.  monocytogenes  
y  L.
ivanovii  produce  una  colonia  de  1­3  mm  de  diámetro,  lisa,  convexa,  azul/verde.  Las  colonias  típicas  
aparecen  de  color  azul  oscuro/verde  en  el  fondo  rojo  del  agar  RAPID'L.mono™  y  aparecen  de  color  
azul/verde  cuando  la  flora  de  fondo  cambia  el  color  de  fondo  del  agar  a  amarillo.  Además,  un  halo  
amarillo  rodeará  las  colonias  de  L.  ivanovii .
Sin  embargo,  el  halo  amarillo  puede  ser  evidente  en  áreas  de  crecimiento  al  menos  moderado.
Un  fuerte  crecimiento  de  L.  ivanovii  podría  volver  amarilla  toda  la  placa.  Además,  se  debe  tener  
precaución  con  L.  monocytogenes­L.  ivanovii  diferenciación  porque  la  flora  de  fondo  en  algunos  
productos  alimenticios  puede  cambiar  el  color  de  ciertas  áreas  de  este  agar  a  amarillo,  y  esto  podría  
hacer  que  L.  monocytogenes  aparezca  como  L.

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ivanovii.  Todas  las  demás  especies  de  Listeria  producen  una  colonia  blanca,  lisa  y  convexa  de  
1­2  mm  con  o  sin  un  halo  amarillo.  C.  Agar  Listeria  según  Ottaviani  y  Agosti  (44,  49)  (M10a),  o  
Oxoid™  cromogénico  Listeria  agar  (OCLA)  (M40b):  Incubar  las  placas  a  37°C,  todas  las  especies  de  
Listeria  aparecen  como  colonias  azul/verde  de  1­3  mm  de  diámetro.

Además,  L.  monocytogenes  y  L.  ivanovii  tienen  un  halo  blanco  opaco  que  rodea  la  colonia.

d.  Listeria  CHROMagar™  (M40a):  Condiciones  de  incubación  y  apariencia.
de  colonias  de  Listeria  son  las  mismas  que  para  Agar  Listeria  según  Ottaviani  y  Agosti  excepto  que  
el  color  de  la  placa  de  fondo  es  azul  claro.

Nota:  El  cromógeno  utilizado  en  los  agares  R&F®  LMCPM  y  RAPID'L.mono™  es  indicativo  de  la  
actividad  de  fosfolipasa  C  específica  de  fosfatidilinositol  (PI­PLC).  En  estos  agares,  las  especies  
de  Listeria  con  actividad  PI­PLC,  L.  monocytogenes  y  L.  ivanovii,  aparecerán  de  color  verde  
azulado  y  todas  las  demás  especies  de  Listeria  no  desarrollarán  el  color  azul  verdoso  y  
permanecerán  de  apariencia  blanca.  En  el  caso  de  Agar  Listeria  según  Ottaviani  y  Agosti  y  
CHROMagar™,  la  presencia  de  una  especie  de  Listeria  se  basa  en  una  actividad  enzimática  de  β­
glucosidasa  específica  detectada  por  el  cromógeno,  por  lo  tanto,  todas  las  especies  de  Listeria  
aparecerán  de  color  verde  azulado  en  estos  agares.  La  actividad  de  fosfolipasa  específica  para  L.  
monocytogenes  y  L.  ivanovii  está  determinada  por  el  halo  blanco  opaco  adicional  que  rodea  la  colonia.

Para  los  métodos  rápidos  aprobados,  utilice  el  agar  de  aislamiento  selectivo  recomendado  por  el  
fabricante  pero  uso  auxiliar  de  L.  monocytogenes­L  cromógeno.  También  se  recomiendan  los  agares  
diferenciales  de  ivanovii .

2.  Seleccione  hasta  5  colonias  típicas  de  cada  agar  basado  en  esculina  y  raye  para  determinar  la  pureza  hasta  TSAye  
(M153)  e  incubar  las  placas  a  30°C  durante  24  a  48  h.  Seleccione  hasta  2  colonias  típicas  para  sembrar  si  usa  L.  
monocytogenes­L.  Agares  cromogénicos  diferenciales  de  ivanovii .  Las  placas  se  pueden  incubar  a  35  °C  si  las  colonias  
no  se  van  a  utilizar  para  observaciones  de  motilidad  en  húmedo.

3.  Si  hay  colonias  aisladas  disponibles,  use  el  crecimiento  restante  de  la  colonia  para  pinchar  un  agar  sangre  de  carnero  
al  5  %  (M135)  lámina.  Incubar  a  35°C  durante  24  a  48  h.

H.  Procedimiento  de  identificación

Identifique  los  aislamientos  purificados  del  crecimiento  en  la  placa  TSAye  mediante  las  siguientes  pruebas  
clásicas  (Sección  H.1.ae).  Alternativamente,  se  pueden  usar  kits  de  pruebas  bioquímicas  rápidas  o  análisis  de  PCR  
para  confirmar  los  aislamientos  a  nivel  de  especie  (Sección  H.2.ac).

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Examine  las  placas  TSAye  en  busca  de  colonias  blancas  convexas  lisas  típicas  de  1­3  mm  de  diámetro.  La  
observación  con  iluminación  transmitida  oblicua  de  Henry  (Figura  1)  (23)  puede  ser  útil  en  esta  etapa,  pero  no  es  
obligatoria.

Figura  1.  Sistema  óptico  Henry  para  el  examen  de  colonias

1.  Clasificación  estándar:

a.  hemólisis:

Inocule  abundantemente  (de  la  colonia  TSAye)  agar  sangre  de  carnero  al  5  %  pinchando  placas  que  se  
hayan  vertido  espesamente  y  secado  bien  (compruebe  la  humedad  antes  de  usar).  Dibuje  una  cuadrícula  
de  20  a  25  espacios  en  el  fondo  del  plato.  Apuñalar  una  cultura  por  espacio  de  cuadrícula.  Apuñalar  
siempre  los  controles  positivos  (L.  ivanovii  y  L.  monocytogenes)  y  el  control  negativo  (L.  innocua).  Incubar  
durante  24  a  48  h  a  35  °C.  Intente  apuñalar  lo  más  cerca  posible  del  fondo  de  la  capa  de  agar,  sin  tocar  el  
fondo  de  la  capa  de  agar  y  posiblemente  fracturar  el  agar.

Examine  las  placas  de  agar  sangre  que  contienen  muestras  de  cultivo  brillantemente  iluminadas  desde  
detrás  de  la  placa.  L.  monocytogenes  y  L.  seeligeri  producen  una  zona  ligeramente  despejada  alrededor  
de  la  punción.  L.  innocua  no  muestra  zona  de  hemólisis,  mientras  que  L.  ivanovii  produce  una  zona  clara  
bien  definida  alrededor  de  la  punzada.  Si  se  observó  cultivo  mixto  en  la  placa  TSAye,  repita  la  prueba  de  
hemólisis  con  una  colonia  aislada.

Prueba  CAMP:  resuelva  reacciones  cuestionables  mediante  la  prueba  Christie­Atkins­Munch­
Peterson  (CAMP)  (15).  Las  cepas  de  prueba  CAMP  están  disponibles  en  colecciones  de  cultivos,  incluida  
la  Colección  Americana  de  Cultivos  Tipo  (ATCC),  Manassas,  VA,  http://www.atcc.org

i.  Coloque  S.  aureus  débilmente  β­hemolítico  (cepa  FDA  ATCC  49444  (CIP  5710;  NCTC  7428)  
o  ATCC  25923)  y  R.  equi  (ATCC  6939;  NCTC  1621)  verticalmente  en  agar  sangre  de  
carnero.

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ii.  Sembrar  por  separado  las  cepas  de  prueba  horizontalmente  entre  S.  aureus  y  R.
equi  vetas  sin  llegar  a  tocarlas.  Incube  la  placa  de  24  a  48  h  a  35  °C.
La  figura  2  muestra  la  disposición  de  las  líneas  de  cultivo  en  una  placa  CAMP.  iii.  
Examine  las  placas  en  busca  de  hemólisis  en  la  zona  de  influencia  de  las  rayas  verticales.
La  hemólisis  de  L.  monocytogenes  y  L.  seeligeri  aumenta  cerca  de  la  línea  de  S.  
aureus ;  La  hemólisis  de  L.  ivanovii  aumenta  cerca  de  la  línea  de  R.  equi .  Otras  especies  no  
son  hemolíticas  y  no  reaccionan  en  esta  prueba  (Tabla  1).
IV. Como  alternativa,  se  puede  usar  un  factor  que  se  prepara  fácilmente  a  partir  de  cultivos  de  
S.  aureus  para  mejorar  la  hemólisis  de  L.  monocytogenes  y  L.  seeligeri  en  placas  de  agar  
con  sangre  de  carnero.  Se  pueden  utilizar  discos  impregnados  con  β­lisina  de  S.  aureus  
(Remel,  Lenexa,  KS).

Tabla  1.  Diferenciación  de  las  especies  de  Listeria

Especies Manitol  Ramnosa  Xilosa  Virulenciaa b Mejora  de   Mejora  de  

hemólisisb la  hemólisis  con la  hemólisis  
Staphylococcus   con
aureus  (S) Rhodococcus  
equi  (R)

l ­ +c ­ + + + ­d
monocitogenes

L.Ivánovich ­ ­ + + + ­ +

L  inofensivo ­ v.f. ­ ­ ­ ­ ­

L.  welshimeri ­ EN + ­ ­ ­ ­

­ ­ + ­ +g + ­
L.  seeligeri

+ ­ ­ ­
L.  grayih EN

a
Prueba  de  ratón
b
Apuñalamiento  con  agar  
C
sangre  de  carnero  Algunas  cepas  del  linaje  III  de  L.  monocytogenes,  que  se  asocian  principalmente  con  la  
listeriosis  animal,  son  ramnosa  negativas.
d
Las  cepas  raras  son  S+  y  R+.  La  reacción  R+  es  menos  pronunciada  que  la  de  L.  ivanovii.  Las  cepas  
fermentadoras  de  ribosa  se  clasifican  como  L.  ivanovii  subsp.  ivanovii  y  ribosa  no  fermentadores  como  L.  ivanovii  
subsp.  londiniensis.
F
V,  biotipos  variables,  más  del  10%  de  cepas  para  esta  característica.  g  
Las  cepas  de  L.  seeligeri  débilmente  hemolíticas  pueden  parecer  no  hemolíticas.
h
Incluye  dos  subespecies  ­  L.  grayi  subsp.  murrayi  reduce  el  nitrato.  L.  grayi  subesp.  Grayi  lo  hace
no  reducir  el  nitrato.

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Figura  2.  Prueba  CAMP  para  Listeria  monocytogenes:  Patrón  de  inoculación  de  la  placa  de  agar  sangre  de  
carnero.  Las  líneas  horizontales  representan  inoculaciones  en  racha  de  5  cepas  de  prueba.  Las  líneas  verticales  
representan  inoculaciones  en  racha  de  Staphylococcus  aureus  (S)  y  Rhodococcus  equi  (R).
Las  líneas  rayadas  indican  (solo  en  forma  de  diagrama)  las  ubicaciones  de  las  regiones  de  mejora  de  la  hemólisis.

b.  Motilidad:  Escoja  una  colonia  típica  de  TSAye  y  examínela  mediante  montaje  húmedo,  utilizando  solución  salina  al  
0,85  %  para  el  medio  de  suspensión  y  el  objetivo  de  inmersión  en  aceite  del  microscopio  de  contraste  de  fase.
Elija  una  colonia  con  suficiente  crecimiento  para  hacer  una  suspensión  bastante  pesada;  emulsionar  bien.  
Listeria  spp.  Son  bastoncillos  delgados  y  cortos  con  una  ligera  motilidad  giratoria  o  giratoria.
Siempre  compare  con  la  cultura  conocida.  Los  cocos,  bastoncillos  grandes  o  bastoncillos  con  motilidad  rápida  
y  nadadora  no  son  Listeria  spp.  Alternativamente,  tubo  punzante  de  MTM  (M103)  de  TSAye.
Incubar  hasta  7  días  a  temperatura  ambiente  (20­25°C).  Observe  diariamente  hasta  que  el  patrón  de  crecimiento  
aislado  sea  obvio.  Listeria  es  móvil,  dando  un  típico  patrón  de  crecimiento  similar  a  un  paraguas.

C.  Catalasa:  Pruebe  colonias  típicas  para  catalasa  colocando  algo  de  crecimiento  de  colonia  en  una  gota  de
Peróxido  de  hidrógeno  al  3%.  Las  especies  de  Listeria  son  catalasa  positivas.

d.  Tinción  de  Gram:  use  crecimiento  de  16  a  24  h  a  partir  de  placas  TSAye.  Todas  las  Listeria  spp.  son  bacilos  
grampositivos  cortos;  sin  embargo,  con  cultivos  más  antiguos,  la  reacción  de  tinción  de  Gram  puede  ser  variable  
y  también  las  células  pueden  aparecer  esferoidales.  Las  células  tienen  tendencia  a  empalizarse  en  frotis  teñidos  
gruesos.  Esto  puede  conducir  a  un  falso  rechazo  como  difteroide.

mi.  Serie  de  fermentación  de  carbohidratos:  Elija  una  colonia  típica  en  un  tubo  de  TSB  para  inocular  la  fermentación  
de  carbohidratos  y  otros  medios  de  prueba.  Incubar  a  35°C  durante  24  h.  Este  cultivo  puede  mantenerse  a  4°C  
varios  días  y  usarse  repetidamente  como  inóculo.

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i.  Del  cultivo  TSBye,  inocule  los  siguientes  carbohidratos  en  soluciones  al  0,5%  en  caldo  de  
carbohidratos  púrpura  con  tubos  Durham:  dextrosa,  esculina,  maltosa,  ramnosa,  manitol  y  
xilosa.  Incubar  7  días  a  35°C.  ii.  Las  reacciones  positivas  estarán  indicadas  por  la  producción  
de  ácido  y  el  medio  se  tornará  de  color  amarillo  sin  producción  de  gas.  Todas  las  Listeria  spp.  debe  
ser  positivo  para  dextrosa,  esculina  y  maltosa.  Todas  las  Listeria  spp.  excepto  L.  grayi  debe  
ser  manitol  negativo.  Si  la  pigmentación  del  aislado  en  OXA,  PALCAM,  MOX  o  LPM  más  
esculina/Fe3+  es  inequívoca,  se  puede  omitir  la  prueba  de  esculina.  Consulte  la  Tabla  1  para  
conocer  las  interpretaciones  de  los  resultados.

F.  Opcional:  Prueba  de  reducción  de  nitrato:  Solo  L.  grayi  subsp.  murrayi  reduce  los  nitratos.  La  prueba  
distingue  L.  grayi  subsp.  murrayi  de  L.  grayi  subesp.  grisi.  i.  Utilice  un  cultivo  TSAye  para  inocular  el  caldo  
de  nitrato  (M108).  Incubar  a  35°C  durante  5
días.
ii.  Añadir  0,2  ml  de  reactivo  A,  seguido  de  0,2  ml  de  reactivo  B  (R48).  Un  color  rojo  violeta
indica  la  presencia  de  nitrito,  es  decir,  se  ha  reducido  el  nitrato.  Si  no  se  desarrolla  
color,  agregue  zinc  en  polvo  y  mantenga  durante  1  h.  Un  color  rojo  violeta  en  desarrollo  indica  
que  el  nitrato  todavía  está  presente  y  no  se  ha  reducido.  iii.  Como  procedimiento  alternativo,  
agregue  0,2  ml  de  reactivo  A  seguido  de  0,2  ml  de  reactivo  C.  Un  color  naranja  indica  reducción  de  
nitrato.  Si  no  se  desarrolla  color,  agregue  zinc  en  polvo  como  se  indicó  anteriormente.  El  
desarrollo  de  un  color  naranja  indica  nitrato  no  reducido.

gramo.  Opcional:  dado  que  todas  las  especies  de  Listeria  dan  negativo  para  la  producción  de  indol,  oxidasa,  
ureasa  y  H2S  a  partir  de  compuestos  orgánicos  de  azufre  (el  H2S  se  produce  a  partir  de  tiosulfato  en  
el  kit  de  prueba  MICRO­ID™)  y  dan  positivo  para  rojo  de  metilo  y  Voges­Proskauer,  estas  pruebas  son  
discrecionales.  Brochothrix,  que  está  estrechamente  relacionado  filogenéticamente  con  Listeria,  se  
distingue  de  Listeria  por  su  incapacidad  para  crecer  a  35°C  y  por  su  falta  de  motilidad.
Las  características  distintivas  de  los  bacilos  grampositivos  no  formadores  de  
esporas,  Erysipelothrix  y  Kurthia,  que  rara  vez  aparecen  en  el  análisis  de  Listeria ,  se  pueden  encontrar  
en  otros  lugares  (11,  43).

H.  Opcional:  Prueba  de  patogenicidad  en  ratones  inmunocomprometidos:  Las  pruebas  clásicas
para  la  patogenicidad  de  Listeria  son  la  prueba  de  conjuntivitis  de  Anton  (conejos),  la  inoculación  de  ratones  
y  la  inoculación  de  huevos  embrionados.  Se  recomienda  la  prueba  en  ratones  inmunocomprometidos,  
mediante  inyección  intraperitoneal,  debido  a  su  sensibilidad  muy  mejorada  (38).
La  confirmación  de  la  patogenicidad  animal  de  L.  monocytogenes  no  es  necesaria  para  los  aislados  clínicos  y  
es  opcional  para  los  aislados  de  alimentos.  Un  aislado  debe  identificarse  como  L.  monocytogenes  si  cumple  
con  todos  los  demás  criterios  descritos  en  este  capítulo.  Ver  enlace  para  protocolo  detallado.

Los  datos  bioquímicos  y  de  patogenicidad  se  resumen  en  la  Tabla  1.  Toda  la  recopilación  de  datos  debe  
completarse  antes  de  que  se  determinen  las  identidades  de  las  especies  y  se  realicen  los  subtipos  posteriores.
Existen  cepas  atípicas  de  Listeria  que  podrían  confundir  la  identificación.  Por  ejemplo,  existen  referencias  no  
documentadas  (46)  a  aislados  hemolíticos  de  L.  innocua .  Algunas  L.  monocytogenes  y  L.

dieciséis
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los  aislamientos  de  welshimeri  son  ramnosa  negativos.  Algunos  aislados  de  L.  seeligeri  tienen  una  reacción  hemolítica  
muy  débil  y  pueden  confundirse  con  especies  no  hemolíticas.  A  veces,  se  aíslan  cepas  aberrantes  de  Listeria  que  son  
extremadamente  difíciles  de  especificar  (26)  (consulte  la  Guía  para  usuarios  de  BAM  sobre  la  identificación  de  aislados  
hemolíticos  atípicos  de  Listeria ).  Si  se  obtiene  un  aislado  de  Listeria  tan  aberrante ,  comuníquese  con  Karen  Jinneman.

2.  Identificación  rápida  alternativa:

Los  aislamientos  purificados  pueden  identificarse  rápidamente  mediante  el  uso  de  kits  comerciales  o  PCR  en  tiempo  
real.  Siga  las  instrucciones  del  fabricante  para  la  inoculación  y  la  interpretación.

a.  API®  Listeria  (bioMerieux,  Durham,  NC)  que  requiere  una  prueba  adicional  de  β­hemólisis  para  la  
identificación  final  del  aislado  (12).  La  prueba  CAMP  es  opcional.  b.  Sistema  de  identificación  de  Listeria  
MICRO­ID™  (Remel,  Lenexa,  KS)  que  requiere  un
prueba  CAMP  adicional  y  prueba  de  β­hemólisis.  (2,  22).  C.  
Tarjeta  Gram  positiva  automática  VITEK®  2  (bioMerieux,  Hazelwood,  MO),  que  requiere  una  prueba  CAMP  
adicional  y  una  prueba  de  β­hemólisis  (38).
d.  PCR  en  tiempo  real,  que  requiere  una  prueba  adicional  de  β­hemólisis.  La  prueba  CAMP  es  opcional.
•  Protocolo:  Confirmación  simultánea  de  especies  de  Listeria  y  L.
monocytogenes  aislados  por  PCR  en  tiempo  real.
•  Anexo  1:  Validación  de  un  solo  laboratorio  (SLV):  valores  de  Ct  individuales  para  cada  aislado  por  cada  
mezcla  de  enzimas.  (pdf,  58Kb)  •  Anexo  2:  Validación  multilaboratorio  (MLV)  ­  Valores  individuales  de  Ct  
para  cada  aislado
por  laboratorio.  (pdf,  60Kb)
•  La  identificación  de  especies  de  Listeria  incluye  L.  monocytogenes,  L.  innocua,  L.
ivanovii,  L.  seeligeri  y  L.  welshimeri.  La  identificación  de  L.  grayi  no  se  ha  verificado  con  este  
ensayo.  Los  aislamientos  que  se  identifican  como  especies  de  Listeria  pero  no  de  L.  monocytogenes  
pueden  especificarse  por  completo  como  se  describe  en  la  Sección  H.1.ae  o  H.2.ac.

Se  pueden  utilizar  métodos  alternativos  rápidos  OMA  de  la  AOAC  para  la  detección  de  L.  monocytogenes  enumerados  
en  la  sección  F.2  para  confirmar  el  cultivo  puro.  Dependiendo  del  kit,  los  aislamientos  pueden  identificarse  en  cultivo  puro  
o  de  OXA  u  otros  agares  de  aislamiento  selectivo.  Los  aislamientos  purificados  identificados  como  Listeria  monocytogenes  
mediante  estas  pruebas  deben  conservarse  como  referencia  reglamentaria.

Para  muestras  ambientales,  consulte  los  documentos  de  orientación  de  cumplimiento  de  muestreo  aplicables  para  
determinar  si  la  identificación  a  nivel  de  género  es  suficiente  y  si  es  necesaria  una  mayor  diferenciación  entre  L.  
monocytogenes  y  otras  especies  de  Listeria .

I.  Subtipificación  de  aislamientos  de  L.  monocytogenes  (obligatorio)

Los  aislamientos  confirmados  de  L.  monocytogenes  deben  tipificarse  serológica  y  genéticamente.

1.  Tipificación  serológica:  la  serología  es  útil  cuando  se  abordan  consideraciones  epidemiológicas.
La  mayoría  de  los  aislamientos  de  L.  monocytogenes  obtenidos  de  pacientes,  alimentos  y  el  medio  ambiente  son  del  tipo  1  
o  4.  Más  del  90  %  de  los  aislamientos  de  L.  monocytogenes  se  pueden  serotipificar  con  sueros  disponibles  comercialmente.  
Sin  embargo,  todas  las  especies  de  Listeria  no  patógenas ,  excepto  L.  welshimeri,  comparten  uno  o  más

17
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antígenos  somáticos  con  L.  monocytogenes  (43).  Por  lo  tanto,  la  serotipificación  por  sí  sola  sin  una  caracterización  
completa  del  aislado  no  es  adecuada  para  la  identificación  de  L.  monocytogenes.

Utilice  sueros  comerciales  (Difco™  Tipo  1  catálogo  n.°  223031  y  Tipo  4  catálogo  n.°  223041)  para  caracterizar  
los  aislamientos  como  tipo  1,  tipo  4  o  no  tipo  1  o  4  (tipos  3,  5,  6,  etc.)  como  mínimo.  Utilice  un  cultivo  TSBye  para  inocular  
caldo  de  triptosa.  Incubar  durante  24  h  a  35  °C,  temperatura  a  la  que  se  reduce  la  expresión  del  antígeno  flagelo  (H).  
Transferir  a  inclinaciones  de  agar  triptosa  e  incubar  durante  24  ha  35  °C.  Lave  ambas  inclinaciones  en  un  total  de  3  ml  de  
tampón  de  anticuerpo  fluorescente  (FA)  Difco™  y  transfiéralas  a  un  tubo  estéril  con  tapón  de  rosca  de  16  ×  125  mm.  
Calentar  en  baño  maría  a  80°C  durante  1  h.  Células  de  sedimento  por  centrifugación  a  1600  g  durante  30  min.  Retire  
2,2­2,3  ml  de  líquido  sobrenadante  y  vuelva  a  suspender  el  sedimento  en  el  resto  del  tampón.  Siga  las  recomendaciones  
del  fabricante  para  la  dilución  y  aglutinación  de  sueros.

También  se  puede  realizar  una  caracterización  serológica  completa  (Denka  Seiken™  catálogo  n.°  294616).  Los  cultivos  
puros  de  aislados  de  L.  monocytogenes  deben  cultivarse  durante  24  horas  a  35  °C  en  agar  no  selectivo  como  el  agar  BHI.  
Luego  se  resuspende  el  crecimiento  de  colonias,  se  inactiva  con  calor  y  se  prueba  la  aglutinación  según  lo  recomendado  
por  el  fabricante  de  antisueros.

2.  Subtipificación  genética:  la  secuenciación  del  genoma  completo  de  aislados  alimentarios  y  ambientales  debe  enviarse  
a  GenomeTrakr.  Conserve  todos  los  aislamientos,  ya  que  también  se  pueden  solicitar  técnicas  de  subtipificación  
adicionales.

J.  Enumeración  (requerido)
Si  una  muestra  de  alimento  da  positivo  para  L.  monocytogenes,  use  una  porción  de  muestra  de  reserva  para  la  
enumeración.  La  enumeración  se  realiza  mediante  una  combinación  de  MPN  y  placas  directas.

1.  Procedimiento  MPN:  
a.  Preparar  un  homogeneizado  de  una  cantidad  de  50  g  de  muestra  de  alimento  de  reserva  en  450  ml  pre
BLEB  basal  calentado  con  agentes  selectivos.
b.  Prepare  una  MPN  de  3  tubos  y  4  diluciones  usando  diluciones  que  proporcionen  el  equivalente  a  10,  1,
0,1  y  0,01  g  de  muestra  por  alícuota  en  cada  dilución  respectiva.
C.  Incube  las  doce  alícuotas  como  se  describe  en  la  Sección  E.  d.  A  las  
48  h,  sembrar  cada  alícuota  como  se  describe  en  la  Sección  G,  seguido  de  aislamiento  y
confirmación  según  apartados  GH.  Como  alternativa,  cada  uno  de  los  enriquecimientos  se  puede  examinar  
rápidamente  mediante  uno  de  los  métodos  aprobados  que  se  describen  en  la  Sección  F  con  la  confirmación  
de  todos  los  presuntos  positivos  mediante  los  pasos  de  aislamiento  y  confirmación  que  se  describen  en  las  
Secciones  GH.

mi.  Interprete  los  resultados  en  función  del  número  de  tubos  con  L.  monocytogenes  positivo  
confirmado  utilizando  las  tablas  del  Apéndice  2  de  BAM  (14).  F.  Si  todos  los  tubos  MPN  son  
positivos  para  Listeria ,  consulte  el  enchapado  directo  para  la  enumeración.
resultados.

En  situaciones  que  requerirían  límites  de  confianza  más  estrechos,  se  podría  aumentar  el  número  de  
tubos  repetidos  para  ciertas  diluciones.  Un  ml  de  homogeneizado  de  completo

18
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El  BLEB  y  la  muestra  se  pueden  agregar  y  diluir  con  una  pipeta  multicanal  o  robóticamente,  en  placas  de  96  pocillos.

2.  Procedimiento  de  recubrimiento  directo:

a.  Para  alimentos  sólidos,  prepare  un  homogeneizado  de  una  cantidad  de  25  g  de  muestra  de  alimento  de  reserva  en  225  ml  de  

BLEB  basal  sin  agentes  selectivos.  Realice  otra  dilución  de  10  veces  si  es  necesario.  Ciertos  alimentos  pueden  requerir  

diferentes  procedimientos  de  configuración  y  dilución  de  muestras,  consulte  los  documentos  de  asignación  de  cumplimiento  

aplicables.  b.  Dirija  1  ml  de  alimento  líquido  o  1  ml  de  homogeneizado  de  alimento  sólido  preparado  en  el  paso  a  en  3  a  5  

placas  de  uno  de  los  agares  cromogénicos  diferenciales  de  L.  monocytogenes  como  se  describe  en  la  sección  G.

C.  Si  las  colonias  en  las  placas  son  demasiado  numerosas  para  contarlas,  use  una  muestra  de  reserva,  realice

diluciones  en  serie  adicionales  de  10  veces  y  proceder  con  la  siembra  directa.  d.  Confirme  5  

colonias  representativas  por  placa.  mi.  Alternativamente,  el  método  de  metalizado  en  espiral  descrito  

en  el  Capítulo  3  se  puede  utilizar  para

enchapado.

Notas:  Directrices  para  usuarios  de  BAM  sobre  la  identificación  de  aislados  hemolíticos  atípicos  de  Listeria

19
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Referencias

1.  Anónimo.  2001.  Certificado  de  validación  del  método  alternativo  según  la  norma
ENISO  
16140:2003.  http://www.chromagar.com/fichiers/1450365640CHR_21_01_12_01_en_V  2013.pdf

2.  Método  Oficial  AOAC  992.18.  2000.  MICRO­ID  Listeria.  Capítulo  17.10.02,  pp.  141­  144  En:  
Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL.  17ª  edición.  w
Horwitz  (ed.).  Volumen  1.  Productos  químicos  agrícolas,  contaminantes  y  medicamentos.  
AOAC  INTERNACIONAL,  Gaithersburg,  MD.
3.  Método  Oficial  AOAC  993.09.  2000.  Listeria  en  productos  lácteos,  mariscos  y  carnes.
Método  colorimétrico  de  hibridación  del  ácido  desoxirribonucleico  (ensayo  GENE­TRAK  Listeria ).
Capítulo  17.10.04,  pp.  147­150  En:  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  
INTERNACIONAL.  17ª  edición.  W.  Horwitz  (ed.).  Volumen  1.  Productos  químicos  agrícolas,  
contaminantes  y  medicamentos.  AOAC  INTERNACIONAL,  Gaithersburg,  MD.
4.  Método  Oficial  AOAC  994.03.  2000.  Listeria  monocytogenes  en  productos  lácteos,
mariscos  y  carnes.  Método  de  ensayo  inmunoabsorbente  ligado  a  enzimas  monoclonal  
colorimétrico  (Listeria­Tek).  Capítulo  17.10.05,  pp.  150­152  En:  Métodos  Oficiales  de  Análisis  
de  AOAC  INTERNACIONAL.  17ª  edición.  W.  Horwitz  (ed.).  Volumen  1.  Productos  químicos  
agrícolas,  contaminantes  y  medicamentos.  AOAC  INTERNACIONAL,  Gaithersburg,  MD.
5.  Método  Oficial  AOAC  995.22.  2000.  Listeria  en  los  alimentos.  Método  colorimétrico  de  detección  
mediante  inmunoensayo  enzimático  policlonal  (TECRA  Listeria  Visual  Immunoassay  [TLVIA]).
Capítulo  17.10.06,  pp.  152­155  En:  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  
INTERNACIONAL.  17ª  edición.  W.  Horwitz  (ed.).  Volumen  1.  Productos  químicos  agrícolas,  
contaminantes  y  medicamentos.  AOAC  INTERNACIONAL,  Gaithersburg,  MD.
6.  Método  Oficial  AOAC  996.14.  2000.  Método  de  inmunoensayo  de  enzimas  policlonales  de  
garantía.  Capítulo  17.10.07,  pp.  155­158  En:  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  
INTERNACIONAL.  17ª  edición.  W.  Horwitz  (ed.).  Volumen  1.  Productos  químicos  agrícolas,  
contaminantes  y  medicamentos.  AOAC  INTERNACIONAL,  Gaithersburg,  MD.
7.  Método  Oficial  AOAC  997.03.  2000.  Ensayo  de  inmunoprecipitado  visual  (VIP).  Capítulo  17.10.08,  
pp.  158­160  En:  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL.  17ª  edición.  W.  
Horwitz  (ed.).  Volumen  1.  Productos  químicos  agrícolas,  contaminantes  y  medicamentos.  AOAC  
INTERNACIONAL,  Gaithersburg,  MD.
8.  Método  Oficial  AOAC  999.06.  2000.  Ensayo  inmunofluorescente  ligado  a  enzimas  (ELFA)  
Método  de  detección  del  ensayo  VIDAS  LIS.  Capítulo  17.10.09,  pp.  160­163.  En:  Métodos  
Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL.  17ª  edición.  W.  Horwitz  (ed.).  Volumen  1.  
Productos  químicos  agrícolas,  contaminantes  y  medicamentos.  AOAC  INTERNACIONAL,  
Gaithersburg,  MD.
9.  Método  Oficial  AOAC  2003.12.  2005.  Evaluación  del  Sistema  Automatizado  BAX®  para  la  
Detección  de  Listeria  monocytogenes  en  Alimentos.  Capítulo  17.10.10,  págs.  222­225.  En:  
Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL.  18ª  edición.  W.  Horwitz  (ed.).  AOAC  
INTERNACIONAL,  Gaithersburg,  MD.

20
Machine Translated by Google

10.  Asperger,  H.,  H.  Heistinger,  M.  Wagner,  A.  Lehner  y  E.  Brandl.  1999.  Una  contribución  de  la  metodología  de  
enriquecimiento  de  Listeria :  crecimiento  de  Listeria  monocytogenes  en  condiciones  variables  relacionadas  con  
la  composición  del  caldo  de  enriquecimiento,  las  matrices  de  queso  y  la  microflora  competidora.  Microbiología  
16:419­431.
11.  Bille,  J.,  J.  Rocourt  y  B.  Swaminathan.  1999.  Listeriae,  Erysipelothrix  y  Kurthia,  págs.  295­314.  En:  Manual  de  
Microbiología  Clínica.  7ª  Edición.  PR  Murray  (ed.).
Sociedad  Americana  de  Microbiología,  Washington,  DC.  12.  Borrador  
de  2008.  Bille,  JB  Catimel,  E.  Bannerman,  C.  Jacquet,  MN  Yersin,  I.  Camiaux,  D.
Monget  y  J.  Rocourt.  1992.  API  Listeria,  un  nuevo  y  prometedor  sistema  de  un  día  para  identificar  aislados  
de  Listeria .  aplicación  Reinar.  Microbiol.  58(6):1857­1860.
13.  Boerlin  et  al.  1992.  L.  ivanovii  subesp.  Londres  subesp.  Sé  En  t.  Sistema  J.
Bacteriol.  42:69­73.

14.  Blodgett,  R.  2006.  Apéndice  2.  Número  más  probable  de  diluciones  en  serie.  En  nosotros
Manual  de  análisis  bacteriológico  en  línea  de  la  Administración  de  Alimentos  y  Medicamentos.
15.  Christie,  R.,  NE  Atkins  y  E.  Munch­Petersen.  1944.  Una  nota  sobre  el  fenómeno  lítico  mostrado  por  los  estreptococos  
del  grupo  B.  agosto  Exp.  J.  Biol.  Medicina.  ciencia  22:  197­200.
16.  Curiale,  MS,  T.  Sons,  L.  Fanning,  W.  Lepper  y  D.  McIver.  1994.  Método  de  hibridación  del  ácido  
desoxirribonucleico  para  la  detección  de  Listeria  en  productos  lácteos,  mariscos  y  carnes:  estudio  colaborativo.  
J.  AOAC  INTERNACIONAL  77:602­617.
17.  Curiale,  MS,  W.  Lepper  y  B.  Robison.  1994.  Inmunoensayo  ligado  a  enzimas  para
detección  de  Listeria  monocytogenes  en  productos  lácteos,  mariscos  y  carnes:  estudio  colaborativo.  J.  AOAC  
INTERNACIONAL  77:1472­1489.
18.  Curtis,  GDW,  RG  Mitchell,  AF  King  y  J.  Emma.  1989.  Un  medio  diferencial  selectivo  para  el  aislamiento  de  Listeria  
monocytogenes.  Letón.  aplicación  Microbiol.  8:95­98.
19.  Feldsine,  PT,  AH  Lienau,  RL  Forgey  y  RD  Calhoon.  1997.  Garantía
Inmunoensayo  enzimático  policlonal  (EIA)  para  la  detección  de  Listeria  monocytogenes  y  especies  
relacionadas  de  Listeria  en  alimentos  seleccionados:  estudio  colaborativo.  J.  AOAC  INTERNACIONAL  
80:775­790.

20.  Feldsine,  PT,  AH  Lienau,  RL  Forgey  y  RG  Calhoon.  1997.  Visual
ensayo  de  inmunoprecipitado  (VIP)  para  Listeria  monocytogenes  y  detección  de  especies  de  Listeria  
relacionadas  en  alimentos  seleccionados:  estudio  colaborativo.  J.  AOAC  INTERNACIONAL  80:791­805.
[ Artículo  gratuito  de  PMC ]  [ PubMed ]  21.  Gangar,  V.,  Curiale  MS,  D'Onorio  A,  Schultz,  RL  Johnson  y  V  Attache.  2000.
Ensayo  inmunofluorescente  ligado  a  enzimas  VIDAS®  para  la  detección  de  Listeria  en  alimentos:  estudio  
colaborativo.  J.  AOAC  INTERNACIONAL  83:903­918.
22.  Higgins,  DL  y  BJ  Robison.  1993.  Comparación  del  método  MICRO­ID  Listeria  con  métodos  bioquímicos  
convencionales  para  la  identificación  de  Listeria  aislada  de  alimentos  y  muestras  ambientales:  estudio  colaborativo.  

J.  AOAC  INTERNACIONAL  76:831­838.
23.  Hitchins,  AD  1998.  Listeria  monocytogenes.  Capítulo  10.  En:  GJ  Jackson
(Coordinador)  Manual  Analítico  Bacteriológico.  8ª  Edición.  Revisión  A.  AOAC  INTERNACIONAL,  
Gaithersburg,  MD.
24.  Hitchins,  AD  y  RE  Duvall.  2000.  Viabilidad  de  un  método  de  desafío  de  microflora  definido  para  evaluar  la  
eficacia  de  los  enriquecimientos  selectivos  de  Listeria  monocytogenes  transmitidos  por  los  alimentos .  J.  
Protección  de  alimentos.  63:1064­1070.

21
Machine Translated by Google

25.  Jinneman,  K.,  JM  Hunt,  CA  Eklund,  JS  Wernberg,  PN  Sado,  JM  Johnson,  RS
Richter,  ST  Torres,  E.  Ayotte,  SJ  Eliasberg,  P.  Istafanos,  D.  Bass,  N.  Kexel  Calabresa,  W.  Lin  y  
CN  Barton.  2003.  Evaluación  y  validación  entre  laboratorios  de  un  agar  selectivo  para  la  actividad  de  
fosfolipasa  C  específica  de  fosfatidilinositol  utilizando  sustrato  cromogénico  para  detectar  Listeria  
monocytogenes  de  los  alimentos.  J.  Protección  de  alimentos.  66:441­445.

26.  Johnson,  JM,  K.  Jinneman,  G.  Stelma,  BG  Smith,  D.  Lye,  J.  Messer,  J.  Ulaszek,  L.
Evsen ,  S  Gendel ,  RW  Bennett ,  B  Swaminathan ,  J  Pruckler ,  A  Steigerwalt ,  S .
Kathariou,  S.  Yildirim,  D.  Volokhov,  A.  Rasooly,  V.  Chizhikov,  M.  Wiedmann,  et.
Fortes,  RE  Duvall  y  AD  Hitchins.  2004.  Cepas  atípicas  naturales  de  Listeria  innocua  con  genes  de  la  isla  1  
de  patogenicidad  de  Listeria  monocytogenes .  aplicación  Reinar.
Microbiol.  70:4256­4266.
27.  Jones,  D.  y  HPR  Seeliger.  1986.  Comité  internacional  de  bacteriología  sistemática.
Subcomité  de  taxonomía  de  Listeria.  En  t.  Sistema  J.  Bacteriol.  36:117­118.
28.  Jones,  D.  1992.  Clasificación  actual  del  género  Listeria.  En:  Listeria  1992.  Resúmenes
de  ISOPOL  XI,  Copenhague,  Dinamarca).  pag.  7­8
29.  Knight,  MT,  MC  Newman,  M.  Joseph­Benziger  Jr.,  JR  Agin,  M.  Ash,  P.  Sims  y  D.  Hughes.  1996.  TECRA  
Listeria  Visual  Immunoassay  [TLVIA]  para  la  detección  de  Listeria  en  alimentos:  estudio  colaborativo.  J.  
AOAC  INTERNACIONAL  79:1083­1094.
30.  Lee,  WH  y  D.  McClain.  1986.  Agar  selectivo  mejorado  de  L.  monocytogenes .  aplicación
Reinar.  Microbiol.  52:1215­1217.
31.  Mattingly,  JA,  BT  Butman,  MC  Plank  y  RJ  Durham.  1988.  Un  rápido
ELISA  basado  en  anticuerpos  monoclonales  para  la  detección  de  Listeria  en  productos  alimenticios.  j
AOAC  INTERNACIONAL  71:669­673.
32.  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL  AOAC  INTERNACIONAL,
Gaithersburg,  MD,  EE.  UU.  Método  oficial  2002.09
33.  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL  AOAC  INTERNACIONAL,
Gaithersburg,  MD,  EE.  UU.  Método  oficial  2004.02
34.  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL  AOAC  INTERNACIONAL,
Gaithersburg,  MD,  EE.  UU.  Método  oficial  2004.06
35.  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL  AOAC  INTERNACIONAL,
Gaithersburg,  MD,  EE.  UU.  Método  oficial  2010.02
36.  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNATIONAL  AOAC  INTERNATIONAL,
Gaithersburg,  MD,  EE.  UU.  Método  oficial  2012.02
37.  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL  AOAC  INTERNACIONAL,
Gaithersburg,  MD,  EE.  UU.  Método  oficial  2013.10
38.  Métodos  Oficiales  de  Análisis  de  AOAC  INTERNACIONAL  AOAC  INTERNACIONAL,
Gaithersburg,  MD,  EE.  UU.  Método  oficial  2013.11
39.  Restaino,  L.,  EW  Frampton,  RM  Irbe,  G.  Schabert  y  H.  Spitz.  1999.  Aislamiento  y  detección  de  Listeria  
monocytogenes  usando  sustratos  fluorogénicos  y  cromogénicos  para  fosfolipasa  específica  de  
fosfatidilinositol  C.  J.  Food  Protect.  62:244­251.

22
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40.  Rocourt,  J.,  P.  Boerlin,  F.  Grimont,  C.  Jacquet  y  JC.  Piffaretti.  1992.  Asignación
de  Listeria  grayi  y  Listeria  murrayi  a  una  sola  especie,  Listeria  grayi,  con  una  descripción  revisada  de  
Listeria  grayi.  En  t.  Sistema  J.  Bacteriol.  42:171­174.
41.  Rocourt,  J.  1999.  El  género  Listeria  y  Listeria  monocytogenes:  posición  filogenética,  taxonomía  e  
identificación.  En:  Listeria,  Listeriosis  y  Seguridad  Alimentaria.  ET  Ryser  y  E.
H.  Martha  (eds).  2ª  edición,  págs.  100­1  1­2  Marcel  Dekker,  Inc.,  Nueva  York,  NY.
42.  Ryser,  ET  y  EH  Marth.  1999.  Listeria,  listeriosis  y  seguridad  alimentaria.  2ª  edición.
Marcel  Dekker,  Inc.,  Nueva  York,  NY.
43.  Seeliger,  HPR  y  D.  Jones.  1986.  Listeria.  págs.  1235­1245.  En:  Manual  de  Bergey  de
Bacteriología  sistemática,  vol.  2,  9ª  ed.  PHA  Sneath,  NS  Mair,  ME  Sharpe  y  JG
Holt  (Ed.).  Williams  &  Wilkins  Co.,  Baltimore,  MD.
44.  Shaw  S.,  Nundy  D.  y  Blais  B.:  Desempeño  del  medio  ALOA  en  la  detección  de  especies  de  Listeria  
hemolítica  en  alimentos  y  muestras  ambientales.  División  de  Servicios  de  Laboratorio,  Agencia  Canadiense  
de  Inspección  de  Alimentos,  Ottawa,  Ontario,  Canadá  K1A  0C6.
45.  Stelma,  GN,  Jr.,  AL  Reyes,  JT  Peeler,  DW  Francis,  JM  Hunt,  P  L.  Spaulding,  CH  Johnson  y  J.  Lovett.  
1987.  Pruebas  de  patogenicidad  para  L.  monocytogenes  utilizando  ratones  inmunocomprometidos.  J.  
Clin.  Microbiol.  25:2085­2089.
46.  USDA/FSIS.  1999.  Aislamiento  e  identificación  de  Listeria  monocytogenes  a  partir  de  carnes  rojas,  aves,  
huevos  y  muestras  ambientales.  cap.  8.  Guía  del  Laboratorio  de  Microbiología.  3ra  Edición,  Revisión  2.

47.  FDA/CFSAN  de  EE.  UU.  2008.  Guía  para  la  industria:  Control  de  Listeria  monocytogenes  en  alimentos  
listos  para  comer  refrigerados  o  congelados  (Guía  preliminar).  (consultado  el  14/04/2011).
48.  DHHS/FDA/CFSAN  de  EE.  UU.  y  USDA/FSIS.  2003.  Evaluación  de  riesgos  de  Listeria  
monocytogenes :  Evaluación  cuantitativa  del  riesgo  relativo  para  la  salud  pública  de  Listeria  
monocytogenes  transmitida  por  los  alimentos  entre  categorías  seleccionadas  de  alimentos  listos  para  el  
consumo.  (consultado  el  14/04/2011).
49.  Vlaemynck  G.,  Lafarge  V.,  Scotter  S.  (2000):  Mejora  de  la  detección  de  Listeria  monocytogenes  mediante  
la  aplicación  de  ALOA,  un  medio  de  aislamiento  cromogénico  de  diagnóstico.  Revista  de  Microbiología  
Aplicada,  88 :  430­441.
50.  VanNetten  et  al.  1989.  Medios  diferenciales  selectivos  líquidos  y  sólidos  para  la  detección  y  enumeración  de  
Listeria  monocytogenes.  En  t.  J.  Food  Microbiol.  8:299­316.
51.  Wang,  SY.  y  AD  Hitchins.  1994.  Cinética  de  enriquecimiento  diferencial  de  fracciones  de  células  de  
Listeria  monocytogenes  lesionadas  grave  y  moderadamente  de  poblaciones  lesionadas  por  calor.  j
Seguridad  Alimentaria  14:259­27.

23