ASIGNATURA : INMUNOLOGIA
CICLO : IV
SEMESTRE ACADEMICO : 2022-II
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
“Dr. Wilfredo Erwin Gardini Tuesta”
ACREDITADA POR SINEACE
RE ACREDITADA INTERNACIONALMENTE POR RIEV
Practica N° 3
IDENTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS
UTILIZANDO ELECTROFORESIS
DOCENTES RESPONSABLES DE LA ASIGNATURA
FILIAL CHINCHA : MG EDGAR ANDRES VALENCIA ROJAS
La prueba de electroforesis de proteínas séricas (SPEP) mide
proteinas específicas en la sangre para ayudar a identificar algunas
enfermedades. Las proteínas son sustancias formadas por componentes
básicos más pequeños llamados aminoacidos. Las proteínas tienen una carga
eléctrica positiva o negativa, y se mueven en un líquido cuando se colocan en
un campo eléctrico. La electroforesis de proteínas séricas usa un campo
eléctrico para separar las proteínas en el suero sanguíneo en grupos de
tamaño, forma y carga similares.
El suero sanguíneo contiene dos grupos principales de proteínas: albúmina y
globulina. Tanto la albúmina como la globulina transportan sustancias por el
torrente sanguíneo.
La electroforesis de proteínas séricas suele hacerse para ayudar a diagnosticar y
controlar una amplia gama de afecciones. Estas incluyen:
•Algunas formas de cáncer.
•Problemas renales o hepáticos.
•Problemas del sistema inmunitario.
•Afecciones que conducen a una mala nutrición.
La carga de las proteínas, por su naturaleza anfolítica, depende del pH del medio:
o Cuando en un campo eléctrico el pH del medio es igual al punto isoeléctrico
(PI) de la proteína, no hay migración.
o Para valores de pH por debajo del PI, predominan las cargas positivas y las
proteínas migran hacia el cátodo (-).
o Para valores de pH superiores al PI, las proteínas están cargadas
negativamente y migra hacia el ánodo (+).
TIPOS DE ELECTROFORESIS:
1. Electroforesis de frente móvil o libre
2. Electroforesis de zona: (convencional)
o En papel
o En acetato de celulosa
o En gel (agarosa, poliacrilamida y almidón)
3. Electroforesis capilar
1. Electroforesis de frente móvil o libre :
El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones. Históricamente,
es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos. Actualmente
está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla.
Las diferentes proteínas se desplazan a
velocidades diferentes según sus cargas y
coeficientes de fricción respectivos,
formándose nubes que se van desplazando
en la disolución tampón y que puede
seguirse con diversos sistemas ópticos,
poniéndose de manifiesto las sustancias que
se van separando tiene poco poder de
resolución.
2. Electroforesis de zona:
La muestra se desplaza sobre un soporte sólido.
▪Fuente de alimentación: Proporciona el
campo eléctrico mediante los dos
electrodos, estableciendo una diferencia
de potencial.
▪Cubeta: Recipiente en cuyos extremos se
sitúan los electrodos.
▪Soporte electroforético: Es el elemento
fundamental. Debe ser inerte. La pequeña
cantidad necesaria de muestra permite que
las moléculas migren en discretas zonas o
bandas.
Detección y cuantificación de las fracciones separadas :
o Para revelar las proteínas separadas por electroforesis, el soporte se trata con
colorantes.
o Las bandas de proteínas adsorben el colorante mas intensamente que el
soporte, de forma que se puede eluir el exceso de colorante del soporte mientras
que las proteínas quedan teñidas con el colorante.
o Se mide densitométricamente, integrando las áreas correspondientes a cada
fracción proteíca y calculando el porcentaje de cada fracción sobre el total de
proteínas.
La sensibilidad analítica alcanzada
varia en función del colorante
empleado. De mayor a menor
sensibilidad: violeta acido, azul
comassie, negro amido.
TIPOS DE SOPORTES:
a. Papel : En desuso
b. Acetato de celulosa: Ventajas: presenta poca adsorción, necesita
cantidades pequeñas de muestra, porosidad uniforme, transparente, sin
contaminantes y resultados precisos. Inconvenientes: débil resolución
y electroosmosis. Se ha quedado obsoleta.
c. Gel de agarosa: Es un polisacarido, cuyas disoluciones poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50º C y formar un gel,
semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de
medio líquido. El tamaño de poro no opone impedimento al paso de las
moléculas (soporte no restrictivo tipo I). Se usa usualmente para separar
moléculas grandes. Ventajas: No presenta fenómenos de adsorción,
pequeña cantidad de muestra, mejor visualización y resolución.
Inconvenientes: electroosmosis.
d. Gel de poliacrilamida (PAGE):
a. Es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis, ya que es
con el que mejor se logra separaciones electroforéticas.
o Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rápida y reproducible.
o Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en
agua, relativamente no iónicos y que permite buena visualización de
las bandas durante tiempo prolongado.
o Tiene la ventaja que variando la concentración de polímeros, se
puede modificar de manera controlada el tamaño del poro.
o El tamaño de poro opone resistencia al paso de las moléculas (soportes
restrictivos tipo II), ya que el tamaño del poro es similar al de las
proteínas, de tal modo que existe un efecto de tamizado molecular y
la separación electroforética depende de la densidad de carga de las
moléculas y de su tamaño.
o Inconvenientes: Neurotoxicidad
e. SDS-PAGE:
o Se fundamenta en eliminar las cargas de las proteínas por tratamiento con
SDS (sodiododecilsulfato) que las desnaturaliza y se fijan a el, tomando
carga neta negativa.
o La migración de los derivados proteína-SDS hacia el ánodo es
inversamente proporcional al logaritmo de su PM. La relación carga/masa
es aproximadamente igual para todas las proteínas de la muestra, por lo
que el tamaño de esta es un factor determinante de la separación.
o
La electroforesis con SDS es un excelente método para identificar y
monitorizar las proteínas durante un proceso de purificación y para la
determinación del PM de las diferentes subunidades proteícas.
La electroforesis convencional ha sido y continua siendo de gran utilidad; sin
embargo este tipo de separación electroforética es lenta, laboriosa , poca
reproducibilidad, difícil de automatizar, y además no proporciona resultados
cuantitativos precisos.
3. Electroforesis capilar:
• Constituye una alternativa electroforética de creciente implantación en los
laboratorios clínicos.
• Ventajas:
• Técnica automatizada, ofreciendo resultados reproducibles y
precisos.
• Separa cualquier tipo de tamaño: moléculas de alto y bajo PM (al
contrario que la convencional, que solo separa moléculas grandes).
• Utiliza volúmenes muy pequeños de muestra (0.1-10 nL), mientras
que la convencional, utiliza del orden de µL.
• No requiere el uso de colorantes, ya que las proteínas se detectan
directamente por espectrofotometría.
• Resolución muy elevada
• La velocidad de separación es mucho mayor que en la convencional.
Teoría de la electroforesis capilar (EC):
Dos son los factores que causan la movilidad de los solutos:
1. Movilidad electroforética:
• Específica para cada analito Dependiente
• de la relación carga/tamaño
• Los cationes migran hacia el cátodo, los aniones al ánodo y los compuestos
neutros no se ven afectados por el campo eléctrico.
2. Flujo electroendosmótico (FEO):
• Mueve el disolvente desde el polo positivo al negativo actuando como una
bomba.
• Su causa es la doble capa eléctrica que se produce en el interfaz entre sílice
y disolución.
• El capilar esta cargado negativamenteen su superficie, atrayendo a los
iones positivos del disolvente.
•La EC se realiza en capilares hechos de
sílice fundido.
•Los grupos silanol (SiO-) cargados
negativamente presentes en este material dan
origen a una carga negativa en la superficie del
capilar y es responsable del FEO.
•Esta carga negativa atrae las especies
catiónicas del tampón y la capa iónica que se va
formando tiene una densidad de carga positiva
que va decreciendo al aumentar la distancia a la
pared del capilar.
•La aplicación de un campo eléctrico produce un
potencial zeta que tiene como resultado el
movimiento de estos cationes unidos mas
debilmente hacia el cátodo, y como están
hidratados se llevan el agua tras de sí.
o La existencia de este flujo electroendosmótico actúa como un
mecanismo bomba que impulsa todas las moléculas (catiónicas,
neutras y aniónicas) hacia el detector con una separación que
depende finalmente de las diferencias de migración electroforética de
los analitos.
o Suponiendo que el FEO sea adecuado y no excesivo, las respectivas
movilidades electroforéticas de los analitos llevan a la formción de
zonas discretas en el momento que pasan por delante del detector.
o Si el FEO es demasiado lento, el fenómeno de difusión se encarga de
que las zonas de los analitos se ensanchen y de que algunos analitos
no alcancen el detector en un intervalo de tiempo razonable (pH
bajos).
o Si el FEO es muy rápido, la separación sera inadecuada (pH altos)
Modalidades de EC :
1. Electroforesis capilar de zona (CZE)
2. Cromatografía capilar micelar electrocinética (MEKC)
3. Isoelectroenfoque capilar
4. Electroforesis capilar en gel (CGE)
5. Isotacoforesis capilar (CITP)
o Electroforesis capilar de zona (CZE)
•Es una de las técnicas mas importantes y
mas utilizada debido probablemente a su
simplicidad y elevado poder de separación.
•Esta basada en la separación de los analitos
según su relación carga/tamaño.
•Los componentes básicos incluyen:
•Fuente de alimentación(alto voltaje)
•Capilar recubierto de poliimida
(10-50 cm)
•2 recipientes para el tampon donde se
acopla el capilar
•Los dos electrodos conectados a la
fuente
•Detector (espectrofotómetro)
Parámetros de la separación en ECZ :
1. Polaridad de los electrodos: La polaridad normal de la EC es del ánodo
al cátodo, de esta manera el FEO va hacia el cátodo.
2. Voltaje aplicado: Un incremento en el voltaje provoca varios efectos:
aumenta la migración de la muestra, el FEO, acorta el tiempo de
análisis, produce picos mas agudos y mejora la resolución.
3. Temperatura del capilar: Cuando se aumenta la temperatura usando el
mismo voltaje, la η del tampón disminuye y esto lleva a un aumento de
la µ y a tiempos de separación mas cortos.
4. Longitud del capilar: Interesa que sean cortos (10-50 cm) para obtener
tiempos breves de análisis, pero la longitud se puede aumentar para
mejorar la resolución.
5. Soluciones Tampón: La elección del tampón es de gran importancia
para obtener éxito en la separación de los analitos.
Desarrollo de la practica
MATERIAL DIDÁCTICO:
• Dos láminas finas de agarosa en cámara húmeda Plantilla
• Fuente de poder
• 100 ml de agarosa al 2% en tampón Tris-Tricine pH 8,6 mantenido en baño de
agua a 60 °C 4 L de tampón Tris-Tricine
• Tres pipetas de vidrio estériles de 1 ml
• 100 ml de azul brillante de Coomassie G 2,5 %
• Solución decolorante 1L
• solución de lavado 1L
• Dos tubos de antígeno soluble 1 tubo de antisueros Kimwipes
• Toalla de papel
• Guantes
Procedimiento
1. Los geles polimerizados previamente preparados, deberán ser sumergidos en
el tanque de electroforesis junto con el buffer de electroforesis
2. Depositar cada uno de los sueros en los pocillos evitando la contaminación del
pocillo contiguo,
3. Conectar los electrodos al tanque, el positivo al color rojo y el negativo al color
negro,
4. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje
correspondiente,
5. Acompañar la electroforesis hasta la finalización de la misma, esto se
evidencia cuando la línea azul del colorante se encuentre en el límite inferior
del gel,
6. Una vez finalizada la corrida es necesario realizar la coloración del mismo para
observar las bandas, esto se realiza sumergiendo el gel en azul brillante de
Coomasie por un espacio de 20-30 minutos,
7. Después de la coloración es necesario retirar el exceso del mismo del gel,
para esto sumergimos el gel en una solución de decoloración rápida por un
espacio de 30 minutos. Después de este periodo las proteínas son
observables como bandas azules.
Video
https://www.youtube.com/watch?v=aQ00nH0kPSk&ab_channel=BrandonOrtizCasas
https://www.youtube.com/watch?v=_8xftsCIwYo&t=466s&ab_channel=CanalDivulgaci%C3%B3n
GRACIAS
