Capítulo 4

Materias primas utilizadas

en fermentación

Criterios utilizados en la formulación del medio

Los medios utilizados en las fermentaciones industriales deben contener to-

dos los elementos necesarios para la síntesis del material celular y para la for-
mación de producto; además, deben satisfacer los objetivos técnicos del proce-
so ofreciendo un medio ambiente favorable para el crecimiento y/o formación
de producto y al mismo tiempo ser económicamente rentables. Muchos proce-
sos de fermentación se desarrollan en diversas etapas (desarrollo a pequeña es-
cala y crecimiento del inóculo, crecimiento microbiano y formación de produc-
to en el fermentador de producción) de forma que cada etapa tiene unos objeti-
vos técnicos y unas necesidades particulares en cuanto a medios. Usualmente,
en las etapas de desarrollo y de aumento de escala del inóculo, el objetivo es
conseguir velocidades de crecimiento altas para disponer de niveles elevados de
biomasa viable y en una forma fisiológica adecuada para ser utilizada como
inóculo en la siguiente etapa_ Cuando el producto final deseado sea la biomasa
viable o proteínas de organismos unicelulares, el diseño del medio y de las con-
diciones de fermentación deben permitir velocidades de crecimiento elevadas y
altos rendimientos de biomasa de células viables o de células con una composi-
ción adecuada para ser utilizadas como proteínas de organismos uniCelulares.
Cuando el producto final sea un producto celular, por ejemplo un enzima (u
otra proteína) o un metabolito, la situación es más compleja . Sí el producto está

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74 1l10TECNOLOGIA DE LA FERMEN'IAt'ION MA11 klA ~ I' IIIMAS U Illl l ADAS EN FERMENTACION

",oci odo al crecimiento, el medio debe satisfacer simultáneamenle las necesida- En el Cnpflulo 2 ya se ha discutido la influencia de condiciones mcdioanl
des para el crecimiento celular y para la formación de producto de forma ópti- bientales relacionadas con el medio como el pH, la concentración de subslrato,
mO . 'uando el grueso de formación de producto se obtiene después del creci- etc., en la velocidad de crecintiento.
miento celular, el medio debe ser tal que inicialmente las células que tengan pro-
piedades fisiológicas adecuadas se produzcan eficazmente durante la fase expo-
nencial después de la cual las condiciones deben favorecer la sintesis de produc- FORMACION DE PRODUCTO
to a una velocidad óptima haciendo que los rendimientos de producto final sean
máximos. En muchos productos industriales obtenidos predominantemente des- Cuando la formación de producto depende de inductores, debe. incorporar-
pués de la fase de crecimiento exponencial, por ejemplo enzimas y antibióticos, se al medio el inductor específico o un análogo estructural y a veces mantenerse
se observa con frecuencia la existencia de una velocidad óptima lineal de for- en él a lo largo del proceso mediante adiciones continuas o discontinuas. De
mación de producto durante la fase post-exponencial, por lo que el objetivo clave la ntisma forma, si la formación de producto está sujeta a la represión por el
consistirá en controlar el medio y las condiciones medioan1 bien tales de forma catabolito por substratos como glucosa y otros carbohidratos, es necesario uti-
que esta fase de producción lineal sea lo más larga posible. lizar un mutante sin esta regulación o suministrar el carbohidrato en forma con-
tinua o discontinua pero de modo que sus niveles permanezcan por debajo de
la concentración crítica necesaria para la represión. Muchos procesos de pro-
INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL CRECIMIENTO CELULAR ducción de enzimas están sujetos a inducción y/o represión por el catabolito.
En las fermentaciones para obtener metabolitos secundarios la baja productivi-
Los microorganismos necesitan carbono, nitrógeno, minerales, a veces facto- dad está asociada frecuentemente con la presencia en' el medio de concentracio-
res de crecimiento, agua y (si son aerobios) oxigeno para formar su biomasa nes elevadas de fuentes de carbono rápidamente metabolizables.
y como fuente de energía para la biosíntesis y mantenimiento celular. La com- Una fuente de nitrógeno utilizable rápidamente inhibe la producción de al-
posición elemental de la mayoría de los microorganismos es muy similar, y en gunos antibióticos. En los bongos, el ión amonio impide la absorción de ami-
consecuencia puede utilizarse como punto de partida para diseñar un medio de noácidos por acción de las aminoácido permeasas tanto generales como especí-
fermentación óptimo. Los valores típicos para el C, H, 0, N Y S, en tanto por ficas; también impide la asimilación de nitrato en muchos microorganismos,
ciento en peso de células secas, son 45, 7, 33, 10 Y 2,5, respectivamente. También de forma que el nitrato únicamente se utiliza COmo fuente alternativa de nitró-
pueden ser necesarios elementos traza como Cu, Mn, Co, Mo, B y posiblemen- geno cuando se ha agotado el amonio.
te otros metales, dependiendo de la fuente de agua utilizada. Algunos microor- La concentración de ciertos minerales es crítica en algunas fermentaciones.
ganismos crecen en un medio que no contiene factores de crecimiento, mientras Muchas fermentaciones para la producción de metabolitos secundarios necesi-
que otros necesitan medios complejos que contienen nutrientes especlficos co- tan que la concentración de fosfato inorgánico sea baja durante la fase de pro-
mo aminoácidos, vitaminas o nucIeótidos. Sin embargo, los organismos que no ducción, interviniendo a veces el calcio en la precipitación del exceso de fosfato.
necesitan estos suplementos tienen frecuentemente velocidades de crecimiento Las concentraciones de elementos traza como hierro y/o zinc tienen unos efec-
substancialmente más elevada, en medios complejos. Los factores de crecimiento tos críticos en la producción de penicilina, actinomicina, c1oranfenicol, neomi-
específicos pueden añadirse al medio en forma de compuestos químicos puros, cina, griseofulvina y riboflavina. La concentración de manganeso es importan-
por ejemplo, biotína en las fermentaciones para obtener ácido glutámico, o más te en la producción de bacitracina y ácido cítrico. Algunos de los efectos de es-
usualmente como componentes de fuentes de nitrógeno más ordinarias, por ejem- tos metales se explican en función de su activación o inhibición de determina-
plo extractos de maíz. Prácticamente en todas las fermentaciones industriales das actividades enzimáticas.
el carbono suministra la energía para el crecimiento, asr como los átomos de En algunas fermentaciones, por ejemplo en la producción de algunos anti -
carbono para la biosíntesis. La cantidad de carbono necesaria en condiciones bióticos, vitaminas y aminoácidos, se añaden precursores al medio que se in-
aerobias puede determinarse a partir del coeficiente de rendimiento de biomasa corporan directamente al producto. Por ejemplo, el ácido fenilacético es el prin -
cipal precursor utilizado en la producción de bencilpenicilina por fermentación.
Biomasa producida (g) La optimización de la producción de algunos metabolitos requiere la incor-
"fe =
Substrato de carbono utilizado (g) poración de inhibidores específicos al medio, bien para minimizar la formación
 76 010'1 ~ NOI OlA DE LA FERMI N IAtlrl N
MAI. ,RI AS PRIMAS UTILI ZADAS EN FERM EN1l\ ION 77
de Olros inlermedios metabólicos O bien para prevenir el mClnbol1, lll<) po,lerior
elel produclO deseado. En la producción de tetracic1ina mediame Slrep/()myce;~
el iÓI) bro muro impide la formación de c!orotetraciclina yen la producción de I
glicerol mediante Saccharomyces cerevisiae, el bisulfito sódico impide la reduc- I
ci,ln del acetaldehído, de forma que la reoxidación del NADH + H + implica I
I
lu conversión de dihidroxiacetona fosfato en glicerol-3-fosfato, que a su vez se I
Ira nsforma en glicerol. I
I
I
I
OXIGENO I
I
I
I
La mayoría de los procesos de fermentación son aerobios, por lo que requie- I
ren el suministro de oxígeno como materia prima. La oxidación completa de I
I ccri t
la glucosa, representada por la ecuación I
I
C, Hj , O. + 60, =6H,O +6CO,
Concentrac ión de 02 disuel to

Fig. 4.1. Efecto de la concent~aci6n de .oxígeno sobre la velocidad de absorción especí-

necesita 192 g de oxigeno paJ;a oxidar 180 g de glucosa. Suponiendo que los fica de oxigeno (Q02) de un mlcroorgamsmo.
únicos productos extracelulares que se forman son el CO, y el H,O, se necesitan
aproximadamente 0,4 g de oxígeno para producir 1 g de peso seco bacteriano
a partir de glucosa. dos. La observación de que el rendimiento de biomasa de leva?ura a partir de
Además de esta demanda global de oxígeno, los procesos metabólicos se ven azúcar es superior y el de alcohol es inferior en presencia de oXigeno, compara-
inOuenciados por la concentración de oxígeno disuelto en el medio. La relación dos con los 0btenidos en condiciones anaerobias, se conoce como efecto Pas-
entre la concentración de oxigeno disuelto y la velocidad de absorciÓn específi- teur. Sin embargo, a concentraciones de glucosa superiores a los 250-300 mg
ca de oxigeno (Q\», romoles de O, consumidos por g de peso seco de células 1- t incluso en condiciones aerobias, los enzimas oxidantes del CIclo de los ác~­
por hora) sigue la ecuación tipica de Michaelis-Menten (Fig. 4.1), por lo que do; tricarboxl1icos y de los sistemas citocromo son reprimidos por los cata~oll­
para mantener la producción de biomasa al máximo, el nivel de oxigeno disuel- tos y el rend.imiento de biomasa baja al convertirse la mayor parte del azucar
to debe estar por encima de la concentración crítica (C,nt). Los niveles de oxi- en alcohol. En este caso, el menor rendimiento de b.iomasa se debe a la repre-
geno disuelto para que la velocidad de formación de producto sea óptima pue- sión por el catabolito. En las fermentaciones industriales destin~das a I~ pro-
den ser totalmente distintos a los de las Cont. En general, para mantener la pro- ducción de metabolitos primarios y secundarios, la sobreproduccIón de blOma-
ducción de metabolitos resultantes del ciclo de los ácidos tricarboxl1icos pare- sa reduce el rendimiento del producto. En la producción de metabohtos pnma-
cen ser necesarias concentraciones de oxígeno disuelto superiores a la C erito rios, si la proporción de substrato convertido en bio~asa es demasiado grande,
mientras que para la producción de metabolitos no provenientes del ciclo de los el rendimiento del metabolito es menor. La prodUCCIón de a1gun~s metabolltos
ácidos tricarboxílicos, a partir del fosfoenolpiruvato y piruvato, parecen necesi- parece necesitar una fisiologia celular atrofiada . La sobreproducción de bloma-
tarse concent.raciones de oxígeno disuelto inferiores a ]a C erito sa impide el comienzo de la producción de metabolltos secu~danos. Las con-
centraciones elevadas de biomasa fúngica pueden ser perjudICiales para los pro-
cesos de formación de producto que requieran oxígeno, al limitar la velOCIdad
EFECTOS CO MBINADOS de transferencia de este elemento.

Los efectos de los constituyentes del medio y del oxígeno en el crecimiento FISIO LOGIA y MORFOLOGIA
y formación de producto son complejos y están frecuentemente interrelaciona-
Los constituyentes del medio pueden influir profundamente en la fisiología
de los microorganismos y con frecuencia la optimización del proceso de forma-
78 BIOTECNOLOOIA DE LA FERMENTACION M"I 'I" '" i'KIMI\S IIIIII/AJ)¡\S I<N I'ERMENTA I N

1.,(\" dc producto va asociada con formas fisiológicas particulares. En las fer- Tabla 4.1. lllcclO cJcllllUnHuncso en la composición de la pared celular de A.
IIICll laciones optimizadas para la producción de ácido cítrico con Aspergil!L/s niger (calculados ~c8ú n los cJatos de Kisser el al., 1980)
I/f~l'r. el micelio se encuenlra en forma de pequeños gránulos micelianos duros
)' lus hifas son anormalmente cortas y achaparradas. Pam la producción de áci- Composición de la pared Deficiencia Suplemento de mangal/eso
do ilacónico con A. lerreus también es preferible el crecimiento en forma de celular (%; de manganeso
¡·,dllulos. A partir de Rhizopus arrhi"l,lIs se obtiene un mayor rendimiento de
ácido fumárico si el crecimiento tiene lugar en forma filamentosa; también en a-Glucano 66.4 59.0
la producción de penicilina con Prmicil!ium chrysogenum se prefiere en general /l-Glucano 7.0 18.~
Quitina 20.0 6.8
que el crecimiento sea en esta forma. Las velocidades de crecimiento miceliano
Protelna 2.4 2.9
y de asimilación de nutrientes son en general significativamente mayores cuan- Galactomanano }
do el crecimiento se produce en forma de filamentos en vez de en forma de grá- 3.7 12.6
Galactosamina
nu los. Por tanto. para la producción de biomasa se prefieren las condiciones Upidos 0.5 0.5
del medio que induzcan el crecimiento en forma filamentosa.
En las cepas de Slreplomyces grisells destinadas a la producción de estrep-
tomicina, la fragmentación miceliana y la pérdida de la formación de conidios,
)' un cambio progresivo hacia morfologías de tipo nocardial, están asociados gia. Se ha demostrado que la composición de la pared celular de A. niger se
con la degeneración del cultivo y con la capacidad de producir antibióticos. ve significativamente innuenciada por el manganeso (Thbla 4.1).
Entre las condiciones relacionadas con el medio que han demostrado tener Thmbién se ha demostrado que la presencia de cationes influye en la flocu -
innuencia en la morfología se encuentmn la viscosidad, el pH, los cationes di- lación de las levaduras, y que los componentes celulares de las levaduras están
valentes, los agentes quelantes, los polímeros aniónicos, los agentes tensioacti- implicados en su entrecruzamiento. El fenómeno de la floculación de las leva-
vos y la presencia de sólidos. Por ejemplo las hifas del P. chrysogenum se vuel- duras es importante en su sedimentación y eliminación en la producción de be-
ven más cortas y gruesas a medida que el pH es más alcalino, y en consecuencia bidas alcohólicas no destiladas. El empleo de cepas de levaduras que floculan
form an gránulos; las substancias poliméricas añadidas al medio tienden a cau- y sedimentan rápidamente en los procesos de fermentación con tinua para la pro-
sar un crecimiento filamentoso disperso. El carbopol, un pollmero del carboxi- ducción de alcohol, mediante ferm entadores verticales de flujo ascendente, per-
polimetileno, el ácido alginico y la carboximetilcelulosa inducen el crecimiento mite que las levadurns sedimenten y se separen de la cerveza incrementando la
Filamentoso en especies como P. chrysogenurn, A. niger y R. ArrhizL/s. Los ca- densid ad celular en el fermentador sin el empleo de centrifugas.
tiones divalentes inducen frecuentemente al crecimiento en forma de gránu los, La obtención de algunos productos microbianos está asociada con la for-
y sus efectos pueden contrarrestarse con la adición simultá nea de agentes que- mación de esporas, mientras que la síntesis de otros resulta inhibida por este
lantes o cambiadores iónicos, como por ejemplo polímeros aniónicos. Muchas mismo fenómeno. La esporulación puede regularse modificando el medio de
o bservaciones sugieren que los cationes divalentes pueden contribuir a la for- cultivo. En general los niveles bajos de nitrógeno en forma compleja inducen
mación de gránulos al interaccionar con grupos aniónicos de las superficies ce- la formación de espoms, en tanto que las concentraciones elevadas de aminoá-
lulares, uniendo paredes de células adyacentes mediante puentes salinos o ven- cidos la inhiben .
ciendo las fuerzas repulsivas de las superficies cargadas negativamente, facili- El medio de cultivo puede manipularse de forma que se vea afectada la per-
landa asi la formación de gránulos. A veces se producen interacciones célula- meabilidad de la célula. En las fermentaciones para obtener ácido glutámico
célula entre distintas esporas en una etapa previa a su germinación y que con- la limitación de la cantidad de biotina inhibe la biosíntesis completa del ácido
ducen a la formación de gránulos, mientras que en otros casos es necesaria la oleico por las bacterias productoras y modifica la permeabilidad de la célula
presencia de hifas micelianas. Sin duda estas interacciones dependientes de la de forma que el ácido glutámico puede ser excretado al medio. Los antibióticos,
carga se ven inlluidas directamente por los constituyentes iónicos del medio. Tam- por ejemplo la penicilina, que inhiben la formación de peptidoglicanos entre-
bién es de espemr que las condiciones medioambientales, incluyendo el medio, cruzados, dan lugar a la formación de células hinchadas que también excretan
que alteren la composición de la superficie de la célula, influyan en su morfolo- ácido glutámico al medio. Se ha demostrado que algunos agentes tensoactivos
aumentan la velocidad de secreción de los enzimas microbianos extracelulares.
 GIOlI<CNOLOOIA DO I A l' EMMI'NIAt'ltlN MAIII!I" 1'IIIM,,-, I '" l/AliA S 1'. 1'1 FI' RM~NTAC ION HI
M/ll l l1 l!1l. Pl UMAS UTILlZ/lDAS PARA EL CONTROL DEL PROCESO C~l .Proccdiltllellhl\ dc: CIJ \llyO y ('n O I , Muchos antiespumnntes tienen baja f';olll
blhdad y !ll"C"I"" un ,opone, como un a ceite orgánico o mineral.
b,tlc las materias primas utilizadas d.irectamente para el control del proce- La call1idod de anlie\pulTlante debe ser mínima, puesto que puede afeelar
\(, se cncuentranlos..talllP-ºEes, ácido~y--ªl<;~!!p_a:a el control deLpH,Jos:an- la velocidad de transferencia de oxigeno hasta un 50 %. Además, CSIOS produc-
\icspumantes para impedir la f~mación de..espumas y los nUlnenteS que evItan tos no debe~ .ser tóx.icos ni peligrosos, deben ser esterilizables por el calor y ba-
problemas tales como la represión por el cataba lito. - ratos. Tam bIen pueden utilizarse rompedores mecánicos de espumas como al-
ternativa a los agentes antiespurnantes.
Con/rol del pH
Con frecuencia se añade fosfato inorgánico en exceso a los procesos de fer- IMPLICACIONES EN EL PROCESADO POSTERIOR
mentación debido a su buena capacidad tamponante en la región de pH com-
prendida entre 6,0 y 7,5. Los ácidos orgánicos se pueden utilizar también como El diseñ? del medio de fermentación tiene fuertes implicaciones en el proce-
agentes tamponames para valores de pH inferiores. El medio también puede sado postenoL El uso de materiales de fermentación brutos puede representar
ser tamponado eficazmente frente a la producción de ácido mediante el empleo un aho:ro en el costo de los nutrientes, pero da lugar a un proceso de recupera-
de carbonato cálcico. El pH puede controlarse también con la adición de hidro- c.lón mas caro y compleJO. El empleo de una elevada proporción de agentes an-
xisales, amoniaco líquido o gaseoso y ácidos sulfúrico y clorhídrico. uespumantes hace que dichos agemes se recuperen con los sólidos durante la
El pH del medio se controla con frecuencia de forma indirecta media nte un pnmera etapa de separación sólido-lfquido, lo que puede dar problemas en el
balance equitativo entre las fuentes de carbohidralo y nitrógeno. Los carbohi- procesado de productos asociados con las células. Por tanto, a la hora de selec-
dratos contribuyen frecuentemente a reducir el pH debido a la formación de cionar las materi,as primas a utilizar en el proceso de fermentación hay que te-
ácidos orgánicos, y las sales de amonio producen usualmente condiciones áci- ner en cuenta su Impacto económico en la productividad, en la purificación del
das debido a la liberación del ácido libre durante la asimilación del ión amonio. producto y en el tratamiento de desechos. En general, en los procesos en los
ÚI asimilación del nitrato puede dar lugar a alcalinidad, aunque cuando se añade que el costo de fermentación es alto, el costo del medio puede representar una
en forma de nitrato amónico se asimila preferencialmente el ión amonio. ÚlS proporción ~ubstancial de los costos totales de manufactura, y por tanto es es-
fuentes orgánicas de nitrógeno, como las proteínas hidrolizadas, el extracto de peclal~ente necesario utilizar materias primas baratas. En los procesos de fer-
maíz y los solubles de destilería pueden hacer que el pH evolucione hacia la memaclón en los que la recuperación del producto es muy costosa se tiende a
alcalinidad. Al manipular el pH del medio de esta manera hay que tener en cuenta utilizar materias primas más puras para minimizar los problemas de recuperación.
los posibles efectos represivos de los constituyentes utilizados sobre la forma-
ción de producto.

Espuma Medios de fermenlación microbiana

La espuma se produce frecuentemente en las fermentaciones debido a la des-
naturalización de las proteínas en la interfase gas-líquido. Si no se controla, la
espuma puede ir ascendiendo hasta ocupar totalmente la cabeía del fermenta- ..Los compuestos petroquimicos, como hidrocarburos, alcoholes y ácidos, se
dor y eventualmente puede dar lugar a la evacuación de gran parte del conteni- utlh,,:,ron como medios de fermentación cuando el petróleo em barato, aunque
do del aparato a través de la salida de aire utilizado; además también puede práctIcamente no se han usado en una extensión significativa. En la actualidad
causar la eliminación de células del medio. las fuentes de carbono y energía más importantes en los procesos de fermenta:
Los anliespumantes son agentes tensoactivos que actúan reduciendo la ten- ción SOn ~aterias primas r.enovables que contienen azúcar y almidón y en me-
sión superficial de las espumas hasta dispersarlas. Estos compuestos varían en nOr extenSIón grasas y acelles. Hoy en día compiten con la producción de ali-
su eficacia con las condiciones de fermentación (composición del medio, cepas mentos ~r el almidón y los productos basados en este hidrato de carbono, puesto
microbianas, etapa del crecimiento, configuración de las vías de aireación y del que el deficlt anual actual en los paises en vías de desarrollo es de unas lO' 1m
fermentador) y la selección del tipo de antiespumante se basa frecuentemente de atimemos. La lignocelulosa representa aproximadamente el 50 % de la pro-
ducción anual mundial de biomasa, que alcanza las 10" Tm. Por el contrario
la producción anual de almidón y azúcar es muy inferior, de unas 10' y lO' T~
82 1310'1 KNOLOGIA LJe LA IERMI 'N IMltlN M¡\IIIII,'~ I'"IM~~ 1IIIIIIAllAS I.N FE RM ENTA ' ION NI
respectivamente. Por tanto, a mcdio y largo plazo, lo> productos de hldl ólbis 111 (1\ lU"IO~U. ell forma cristalina o de jarabe para la elaboracl n
cosa rclinuuiI ,
de la lignocelulosa deberán ser las materias primas más importantes en los pro- de produclos de lI1ayor valor.
cesos de fermentación. En los procesos de fermentación se pueden utilizar aceites vcgela l.s como
el aceite de aja, palma y semillas de algodón como suplemento de los ca rbohi-
dratos. El metanol, uno de los substratos de fermentación más baratos, se ulili-
CARBOH ID RATOS za para la producción de proteínas de organismos unicelulares, aunque como
pueden utilizarlo sólo unas pocas cepas de levaduras y bacterias, su aplicación
El almidón es el carbohidrato más importante utilizado actualmente en los en los procesos de fermentación está limitada. El etanol, que puede ser metabo-
procesos de fermentación. Puede emplearse en forma de granos o raíces, ente- lizado por muchos microorganismos como una única fuente de carbono, puede
ros o molidos, de plantas como el maíz, el arroz, el trigo, las patatas y la man- ser un material de partida potencial para la producción de otros productos de
dioca como almidón purificado, como almidón modíficado o como dextrinas. fermentación en el fUlurO. Por ejemplo, el ácido acético se produce usualmente
Durante el calentamiento o esterilización de los gránulos el almidón gelifica, por oxidación microbiana del etanol.
volviéndose extremadamente viscoso, por lo que usualmente se incluye en el pro-
ceso una etapa de hidrólisis enzimática que Iicúe o aclare el almidón, lo que
puede llevarse a cabo bajo la acción de amilasas provenientes de fuentes micro- NITROGENO
bianas o de cereales malteados. La extensión de dicha hidrólisis varía con el pro-
ceso de fermentación y depende de factores tales como si la cepa microbiana Las fuentes más importantes de nitrógeno para la fermentación son el amo-
a utilizar produce o no amilasas y de si la síntesis del producto está sujeta a niaco, los nitratos, la urea y el nitrógeno presente en los cereales y raíces y sus
represión por el cata bolito. subproductos. Los aminoácidos purificados se utilizan únicamente en casos muy
La celulosa presen te en la madera está usualmente combinada con la hemi- especiales en los procesos de fermentación, usualmente como precursores. Los
celulosa y la Iignina en forma de lignocelulosa. La Iignina hace a la celulosa substratos complejos también suministran con frecuencia vitaminas, faclores de
resistente al ataque microbiano, y hasta ahora, los métodos químicos yenzimá- • crecimiento y minerales, de importancia clave en los procesos de fermentación.
ticos que convierten la Iignocelulosa en azúcares fermentables no son económi-
camente renlables. Sin embargo, la Iignocelulosa se utiliza de forma limilada
en las fermentaciones para obtener champiñones y la celulosa refmada se em- SUBSTRATOS COMPLEJOS
plea como substrato para la producción de enzimas celulolíticas_
La sacarosa se utiliza en los procesos de fermentación bien en forma crista- Los substratos complejos brutos son una fuente barata de carbono, nitróge-
lina o en forma bruta como zumos O melazas, subproducto de la manufactura no y otros nutrientes para los procesos de fermentación, e incluyen por ejemplo
de azúcares. Aunque el azúcar contenido en las melazas es obviamente más ba- tejidos de plantas enteras y una serie de subproductos vegetales, animales y mi-
rato, la composición de este subproducto varía notoriamente con la fuente (ca- crobianos. En la Tabla 42 se encuentran algunos de los principales substratos
ila de azúcar o remolacha), la calidad del cultivo y la naturaleza del proceso complejos utilizados en los procesos de fermentación.
de refinado del azúcar, causando problemas en la reproducibilidad de la
fermentación .
La lactosa se encuentra en el suero de leche a una concentración del 4 al
5 "lo, por lo que en algunos procesos de producción de alcohol se emplea suero Medios de cultivo de células animales
entero o desproteinizado como fuenle barata de hidratos de carbono. La baja
concentración de carbohidratos en el suero hace que su transporte sea prohibi-
tivo y en consecuencia las fermentaciones que utilizan este producto se llevan Históricamente se incorpora suero fetal de ternera al medio basal de cultivo
a cabo usualmente en lugares próximos a la factoría de quesos proveedora. de células de mamífero como una fuenle esencial de factores de crecimiento.
La glucosa se obtiene usualmente en los medios de fermentación a partir Sin embargo, sus existencias son limitadas y su precio elevado. Otros sueros uti-
de la conversión enzimática directa del almidón. En algunos casos se utiliza glu- lizados ampliamente son los de ternera, ternera recién nacida y caballo. Aun-
 84 910TI!CNOI..OO I/\ DI! 1. /\ ¡'¡' KMI ,N lA( ION
MAlt KIA ~ I' IUM '" 111 IIAOAS bt-l FFRMENTACION
,.:,
""e que el suero retal dc tCrl1ctU e, lu mayol la de las veces aplicable univeT'uhnelllc,
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,;; .n o or. ce c\ volumen potencial de Ploducción de los demás sueros es mucho mayor. Mel
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=--ie-;.....:;: .....: ....: dundo suero fetal con otros suerOS alternativos o suplementando niveles bajo,
O de suero fetal con medios ricos en factores de crecimiento se han conseguido
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g.
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'-: men del medio de cultivo, aunque si el medio basal ha sido optimizado para
un tipo de célula en particular, puede reducirse hasta un 1-2 "lo. El suero contie-
'c" ne diversos factores esenciales para el metabolismo Y proliferación celular, in-
:o'O" ~

I>'!
duyendo factores de iniciación, proteínas Iigadoras, factores de unión y com-
~
u ~
O\l"'):;:)"::l o puestos de peso molecular bajo. En la Tabla 4.3 se indican las principales fun-
·se ....: ,....: :d"': ci
ciones del suero en los medlos de cultivo celular.
-O
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~
e
Ie
S
V
En la Tabla 4.4 se muestra la composición de un medio basal, el conocido
como BME (medlo basal de Eagle), ampliamente utilizado en el cultivo de célu-
las de mamíferos. Los medios basales como el BME, tienen concentraciones re-
E
"E
~
~
lativamente elevadas de los nutrientes más comunes Y son ideales para estimu-
J! ¡¡ lar la proliferación. Los medios más oomplejos, por ejemplo el de HAM FlO/ F12,
-o" lienen un mayor número de nutrientes, aunque las concentraciones de algunos
"e ----:-O ..... C'IOC:O c: =:~~~~ 1..- 00-
~ .nO"i-t=:-ic...)O ..--i .:onstituyentes se han reducido para mantener el balance osmótico. Prácticamente
~
o ~~g:;~~~ ~ I o~
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1.0 ú"": ......) ~ L.'": C'I
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e todos los ingredientes del BME están presentes en los medlos más enriquecidos.
En la Tabla 4.5 se muestran algunos de los componentes suplementarios pre-
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.9 sentes en algunos medios más enriquecidos. Las células de los principales ma-
..
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...,::::: a;
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mlferos, por ejemplo, de las especies humana, bovina, equina y de algunos pri-
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g~~::! ~ mates , proliferan mejor en medios de cultivo basales y su crecimiento puede in-
hibirse mediante el empleo de medios mucho más enriquecidos. Para el creci-
:l
u miento de células de mamíferos secundarios y de líneas celulares inmortales se
l: utilizan generalmente medios suplementados con nutrientes intermedios. Los
e medios muy enriquecidos se utilizan normalmente con células que proliferan
o
u
rápidamente. A veces se necesitan medios más complejos que permitan la ex-
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Tabla 4_3. Funciones atribuidas al suero en los medios de cultivo

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.. • Proporciona hormonas y factores de crecimienLO necesarios para la función celular
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•• Suministra los factores necesarios para la unión al soporte
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• Se une e inactiva o .secuestra compuestos tóxicos
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• Contiene proteínas ligadoras que estabilizan y/ o transportan nutrientes y hormonas
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. :l • Contiene inhibidores de proteasas
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• Contiene elementos traza (por ejemplo, selenio)

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86 BIOTECNOLOGIA DE LA FERMENTACION MAII 'HIAS PRIMA!> UTII IZADAS EN I'ERMENTACION 87
presión completa de una función diferenciada. La diferenciación implica usuul-
mente el cese de la proliferación.
El empleo de medios químicamente definidos, o medios sin suero, permite
~~=:~C:~~~~ Ce a 105 científicos investigar los procesos en cultivos celulares con el mínimo posi-
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o ble de influencias extrañas y facilita el aislamiento y purificación de productos
provenientes del cultivo de células de mamíferos. Los medios libres de suero de-
ben tener los componentes del suero necesarios para el cultivo, y satisfacer las
principales funciones mostradas en la Tabla 4.3. Adaptando las células desde
medios de crecimiento mínimos a medios complejos formulados puede substi-
tuirse la contribución nutricional del suero. La combinación de factores de cre-
cimiento necesarios para el cultivo de células de mamíferos tiende a ser especí-
fica de cada célu la. En la Thbla 4.6 se da una lista general de factores de creci-
miento que pueden ser probados a la hóra de ccnfeccionar el medio libre de suero.

Medios de cultivo para el crecimiento de células vegetales

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r..:C"i=--i~;,ci<.Óoir..:t.Ó-:...,.:::CM La mayoría de los medios de cultivo de células vegetales tienen una compo-
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'" sición química definida, consistente en una fuente de carbono orgánico, una
fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y reguladores del crecimiento. La fuente

Tabl a 4.6. Factores de crecimiento seleccionados para posible uso en medios

libres de suero

• Factor estimulante de la formación de • Factor de crecimiento derivado de las

colonias (CSF) plaquetas (PDGF)
• Estradiol • Prolactina
• Factor de crecimiento epidérmico (EGF) • Prostaglandinas
• Factor de crecimiento de los fibroblas- • Acido retinoico
tos (FGF) • Selenio
• Fibronectina • Albúmina sérica
• Hormona de crecimiento • Somatomedina
• Hemina • Factor de crecimiento de las células T
• Hidroconisona • Factor de crecimiento transforman te
• Insulina (TOF)
• Factor de crecimiento ner vioso (NGF) • lfansferrina
• FosfoHpidos • Triyodotironina
88 1l10TECNOLOOIA D~ LA FFRMrNMlllIN

de carbono más utilizada es la sacarosa aunque lambién pueden c",ple",," <1t"'s

mono- y disacáridos, por ejemplo glucosa, fructosa, malLosa y lactosa. I.a fuente
más importante de nitrógeno en el medio son los nitratos, aunque a veces resul-
la beneficiosa la suplementación con sales amónicas. Algunas especies de célu-
la, necesitan nitrógeno orgánico en forma de aminoácidos, y la inclusión de rn-
Capítulo 5
Irógcno orgánico tiene frecuentemente un impacto positivo en las primeras eta-
pas de iniciación del cultivo. En la mayoría de los cultivos de célu las vegetales
son necesarias hormonas vegetales, las auxinas, que inducen la división celular,
y las citoquininas, que actúan como factores de regulación del crecimiento en
las plantas, y que se utilizan frecuentemente combinadas para promover la divi-
sión celular del cultivo. Procesado de la corriente
de salida
Mantenimiento del medio de cnltivo

El medio para almacenamiento y subcultivo de cepas industriales clave debe

ser diseñado de forma que se conserven las características necesarias que per-
mitan el mantenimiento de un alto grado de viabilidad del cultivo y minimicen Introducció n
la variación genética. Por encima de todo, es esencial que el medio conserve
la capacidad de producción particular por la cual la cepa se utiliza en fermenta-
ciones industriales. En general, en el medio de mantenimiento se debe minimi- Este capítulo relativo al procesado posterior a la fermentación trata de la
zar la producción de metabolitos tóxicos por el organismo, que pueden tener recuperación y purificación del producto deseado obtenido en el proceso de fer-
efectos desestabilizan tes para la cepa. Las cepas que tiendan a ser inestables con mentación . El objetivo de los procesos de fermentación industrial es recuperar
respecto a las propiedades de producción requeridas deberían ser mantenidas, y refinar el producto hasta que alcance unas especificaciones dadas, consiguiendo
cuando esto sea posible, en medios selectivos para esa particular capacidad. Pa- un rendimiento de producto máximo con unos costos de recuperación mínimos.
ra muchos cultivos celulares existen medios de mantenimiento concretos para La naturaleza del proceso de recuperación está innuenciada por el tipo de fer-
cada cepa, que sirven como buen punto de partida para el diseño del medio mentación, las propiedades físicas y químicas del producto y los subproductos
de conservación. Los catálogos de American 1j1pe Culture Collee/ion son una o conlaminantes no deseados, la concentración del producto, su localización
excelente fuente de recetas para los medios de cultivo de mantenimiento. (intra o extracelular), la escala de operación, el tratamiento de los desechos, la
estabilidad del producto y las especificaciones deseadas.
Las operaciones de fermentación y recuperación forman parte del proceso
global, de forma que la naruraleza del proceso de fermentación puede innuir
de forma significativa en el proceso de recuperación. Por ejemplo, además del
ahorro en los costos de fermentación o en la mejora del rendimiento consegui-
dos con el empleo de medios más complejos hay que tener en cuenta las posi-
bles implicaciones en el procesado a la salida del fermenlador. En los productos
difíciles de separar de las células o de los materiales contaminantes del medio
las actividades especificas (actividad del producto por unidad de peso de mate-
rial biológico) pueden Ser más importantes que los rendimientos absolutos del

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