FACULTAD DE MEDICINA

Identificación y caracterización de mohos

aislados en diversos tipos de pan.

TRABAJO DE FIN DE GRADO

Nutrición Humana y Dietética

PRESENTADO POR: Noelia García Román

TUTELADO POR: Irma Caro Canales

Departamento de Pediatría e Inmunología, Obstetricia y Ginecología, Nutrición

y Bromatología, Psiquiatría e Historia de la Ciencia

Valladolid, 2020-2021
 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Resumen
El pan es uno de los alimentos por excelencia de la Dieta Mediterránea, su consumo per cápita en
España es 37,8 kg. Algunas condiciones ambientales tanto en las industrias como en los hogares,
como las altas temperaturas o la humedad pueden propiciar el crecimiento de microorganismos en
el pan, como los mohos. Estos pueden ser peligrosos por la formación de metabolitos tóxicos,
llamados micotoxinas, que pueden causan graves daños en la salud. En este estudio, la identificación
y caracterización de diversos mohos y levaduras aisladas del pan fueron llevadas a cabo. Se utilizaron
tres métodos de extracción de proteínas: la extracción con agua-ácido fórmico, extracción con perlas
de zirconio y la extracción con etanol-agua. Las muestras fueron procesadas a través de MALDI-TOF
MS. Se identificaron en total 15 de 21 cepas aisladas de mohos de diversos tipos de pan: barra, barra
integral, pan candeal y pan de molde. Las cepas fueron encontradas tanto en la corteza como en la
miga. Los principales géneros de mohos y levaduras identificadas en el pan fueron Penicillium spp.,
Aspergillus spp. y Candida spp.

Palabras clave
Pan, mohos, levaduras, micotoxinas, MALDI-TOF.

Abstract
Bread is one of the main foods in Mediterranean Diet, its consumption per capita in Spain is 37,8 kg.
Some environmental conditions in both industries and homes, such as high temperature or humidity
can lead to microbial growth in bread, such as moulds. These could be dangerous because of the
formation of toxic metabolites, called mycotoxins, which could cause several health damages. In this
study, the identification and characterization of several moulds and yeasts isolated from bread were
carried out. Three protein extraction methods were used i.e. extraction with a water-formic acid
solution, extraction with zirconia-silica beads and extraction with ethanol-water solutions. Samples
were then processed by MALDI-TOF MS. A total of 15 out of 21 mould strains isolated were
identified by MALDI-TOF MS from several types of bread: loaf, wholemeal bread, candeal bread and
sliced bread. The strains were found in both crust and crumb. The main genera of moulds and yeasts
identified in bread were Penicillium spp., Aspergillus spp. and Candida spp.

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Key words
Bread, moulds, yeasts, mycotoxins, MALDI-TOF.

Tabla de abreviaturas
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass
Spectrometry

aw Actividad de agua

OMS Organización Mundial de la Salud

GCPSR Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition

DON Deoxinivalenol

OTA Ocratoxina

DG18 Dicloran-glicerol-cloranfenicol

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación

Tabla 1. Tabla de abreviaturas.

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

ÍNDICE:
Justificación. 5
Introducción. 5
Importancia del pan en la nutrición humana y en España. 5
Estabilidad del pan. 6
Definición y estructura de los mohos y levaduras. 8
Técnicas de identificación de mohos. 10
Definición de micotoxinas, tipos y cantidades. 11
Objetivos. 12
Materiales y métodos. 13
Preparación de las muestras. 13
Preparación de los medios de cultivo. 14
Identificación de mohos a través de MALDI TOF. 14
Análisis de resultados 16
Resultados y discusión. 16
Conclusiones. 23
Bibliografía 25

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Justificación.
La Dieta Mediterránea es conocida por la siguiente trilogía: trigo, olivo y vid. Dentro de la pirámide
de la alimentación, en la base nos encontraremos el grupo de los farináceos, el más recurrente en
nuestra dieta. En este grupo, el cereal es básico, pues es una fuente principal de hidratos de carbono
y energía. El cereal con más presencia en nuestra dieta es el trigo. La forma más común del consumo
de cereales son el pan o la pasta, sin embargo, el pan puede acompañar todas las comidas que se
realizan a lo largo del día.

A pesar de que el pan es considerado un alimento estable, por su baja actividad de agua y sus
valores de pH bajos, permite el crecimiento de ciertos microorganismos, entre ellos los mohos. Más
aún, si la conservación de los productos a base de cereal no es adecuada, por ejemplo, si existe una
humedad alta relativa pueden crecer especies de microorganismos como mohos y levaduras y
producir sustancias tóxicas. Los mohos al crecer en alimentos con alto contenido de hidratos de
carbono, la mayoría de ellos, producen sustancias tóxicas llamadas micotoxinas. Debido a esto, el
conocimiento de los tipos mohos que pueden encontrarse en el pan nos permitirá conocer su
posible implicación en la producción de micotoxinas y su repercusión en la calidad higiénica del pan.

Hasta hace pocos años, la caracterización e identificación de mohos se lleva a cabo por técnicas
morfológicas. Sin embargo, actualmente se usan técnicas genéticas y técnicas basadas en el estudio
de las proteínas ribosómicas, por ejemplo el análisis por MALDI-TOF.

Introducción.

Importancia del pan en la nutrición humana y en España.

El pan “es el producto resultante de la cocción de una masa obtenida por la mezcla de harina y agua,
con o sin adición de sal, fermentada con la ayuda de levadura de panificación o masa madre”, según
el Real Decreto 308/2019 (1). El pan es un producto valorado en los hogares por ser producido y
consumido en el mismo día. Esta característica es importante, pues cada vez con más frecuencia nos
encontramos productos precocinados en las despensas de nuestras casas, y el pan aporta esa idea
de comida casera tradicional. Su bajo precio hace que sea un producto asequible para cualquier
familia, pudiéndose comprar diariamente. Así mismo, aporta una gran cantidad de hidratos de

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

carbono complejos ayudando a disminuir los niveles sanguíneos de insulina, además es una fuente
importante de fibra, que es un componente esencial en la Dieta Mediterránea por sus beneficios en
la prevención de enfermedades cardiovasculares. Debido a su gran consumo diario, nos permite
sustituir otros alimentos insalubres por uno con bajo aporte lipídico. En un contexto de una dieta
sana y equilibrada, mejora el perfil lipídico con bajos niveles colesterol LDL y más altos del colesterol
HDL.

El consumo de pan en España en el año 2020 fue de 32.78 Kg/ persona año, el pan fresco normal,
pan integral, pan sin sal fueron los que se consumieron en mayor medida (79.4%), seguido del pan
fresco industrial (14,4%) (2). El pan industria congelado es uno de los productos que usa la industria
alimentaria para la elaboración del pan fresco, este producto requiere un control de calidad más
riguroso debido a que existen microorganismos como los mohos que pueden permanecer en estado
latente a bajas temperaturas e incluso germinar y formar colonias a temperaturas de 4 ºC (3).

Estabilidad del pan.

Aunque el pan es un producto que se consume diariamente, algunas veces en los hogares puede
congelarse o almacenarse en lugares a temperatura ambiente y un ambiente húmedo. Además, la
industria alimentaria produce pan congelado que se somete a un proceso de horneado en el mismo
día de su consumo. La vida útil del pan se ve limitada por cambios físicos y microbiológicos que
suceden durante el almacenamiento entre los que cabe mencionar el endurecimiento de la corteza o
la absorción del agua cuando éste se almacena en lugares húmedos. Los principales parámetros
intrínsecos que determinan la estabilidad del pan como de muchos alimentos son el pH y la actividad
de agua. Existen muy pocos estudios sobre cómo afecta en esos parámetros en la estabilidad del
pan, y en especial de los panes españoles. Un reciente estudio de Portales (2020) (4) recoge los
valores de agua (aw) y el pH de diferentes tipos de panes elaborados en Castilla y León.

En este estudio se comparó la aw y el pH de la corteza y de la miga de distintas muestras de panes:

barra de pan blanco, barra de pan integral, pan candeal y pan de molde. Los valores más altos de aw
correspondieron a la miga del pan blanco y del pan de barra integral (0,978 -0,979), seguidos del pan
candeal que presentó un valor (0,967 ± 0,007). La corteza mostró los valores más bajos, siendo la
corteza del pan de molde la que mostró una actividad de agua mayor (0,926 ± 0,017). Las cortezas
de los otros tipos de panes mostraron valores de actividad de agua por debajo de 0.85, excepto la
corteza de la barra integral que mostró valores de 0,890 ± 0,037. Así mismo, otros autores (5) (6) han
realizado estudios de la actividad de agua sobre el pan de molde, encontrando valores superiores a

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

0,85. Respecto al pH, los valores de los diversos tipos de pan oscilaron entre 5.5- 6.05 siendo las
migas del pan de molde y la de la barra artesanal las que mostraron el pH más bajo y el más alto,
respectivamente (4). Por su parte, Jay (2008) (7) encuentra valores de pH entre 5.4 y 7.5 en diversos
tipos de pan. Teniendo en cuenta los bajos valores de aw y pH encontrados en los panes españoles,
los microorganismos que con mayor probabilidad podrían causar una alteración microbiológica en
este tipo de producto son los de mohos y levaduras, debido a que esta condiciones por un lado
permite su crecimiento y por otro lado evitan el crecimiento de bacterias que podrían competir con
estos microorganismos.

El crecimiento de los mohos y levaduras como otros microorganismos se ve influenciado

principalmente por el contenido de agua y el pH. El óptimo de crecimiento de las levaduras se sitúa
en el rango de 4.0 a 6.0 de pH aunque algunas especie de S. cerevisiae, pueden crecer en un rango
de pH más bajo entre 2.5-8.5 (8). Levaduras son capaces de alterar los vegetales, causando pérdidas
económicas y un alto riesgo para la salud del consumidor, además algunas levaduras han sido
consideradas patógenos oportunistas debido a que podrían causar infecciones en varios órganos (9),
siendo C. albicans una de las especies de levadura considerada como patógeno oportunista en
individuos inmunocomprometidos (10).

Respecto a los mohos, estos pueden crecer por debajo de 0.85 de actividad de agua, son aerobios,
aunque algunas especies pueden ser anaerobias facultativas, crecen a temperaturas de 4ºC y en un
rango de pH entre 3,5-6,5 (11) (12). De acuerdo con Rico-Munoz et al. (2017) (13) los mohos
xerófilos son aquellos que pueden crecer por debajo de 0,85 de aw, siendo estos mohos los que
causan mayor alteración en los alimentos. En los productos horneados los géneros de mohos que
pueden causar alteración son: Penicillum, Aspergillus, Monilia, Mucor, Endomyces, Cladosporium,
Fusarium y Rhizopus (5) (14).

Existen dos principales tipos de alteraciones en el pan, uno tipo de alteración conocida como “bread
staling” que es un fenómeno complejo originado por múltiples cambios químicos como la
retrogradación de amilo-pectina, pérdida y redistribución del agua, oxidación de las grasas,
interacción gluten-almidón y la trasformación del gluten (15), así como la alteración microbiológica
que es una asociación entre levaduras, mohos y algunas bacterias (16).

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Definición y estructura de los mohos y levaduras.

Los mohos son organismos que pertenecen al reino Fungi. Su disposición celular es eucariota, pues
presenta un núcleo que alberga su material genético y está delimitado por una membrana celular.
Poseen una pared celular rígida y, a diferencia de las células vegetales, el componente celular es la
quitina y no la celulosa. Su forma de alimentación tampoco es como la de los vegetales, sino que son
organismos heterótrofos por alimentarse a base de materia orgánica. Gran parte de las especies
crecen en forma de filamentos pluricelulares denominados hifas, y al conjunto de estas se le
denomina micelio. Sin embargo, algunas especies de mohos también son unicelulares (3).

El papel de los hongos y mohos es fundamental en la naturaleza, pues participan en el

mantenimiento del ecosistema descomponiendo la materia orgánica, son fuente de alimentación
para los seres humanos (trufas y setas), intervienen en la transformación de alimentos por
fermentación como en el caso del vino, la cerveza o el queso, y además colaboran en la obtención de
antibióticos y enzimas importantes en la industria farmacéutica y alimentaria (3).

Taxonómicamente, los mohos se divide principalmente en dos fila: Zigomicetos y Ascomicetos. Sin
embargo, existe controversia por la descripción de una tercera fila llamada Deuteromicetos, aquellos
mohos que no se conoce su fase sexual. Los mohos Zigomicetos son aquellos que producen esporas
por reproducción sexual. Estas esporas se producen en unas estructuras denominadas
zigoesporangios. Pueden reproducirse de forma asexual, las estructuras que recogen las esporas
asexuales se llaman esporangios (figura 1). Este fila no tiene especial relevancia desde el punto
inocuidad alimentaria, es decir, en la formación de micotoxinas (3).

Figura 1: Estructura productora de esporangios.

Fuente: tomada de Morales (3).

Los mohos Ascomicetos representan el mayor fila del reino Fungi. La reproducción sexual se lleva a
cabo a partir de las esporas sexuales llamadas ascosporas, por las estructuras que las contienen

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

denominadas ascas. En este fila también se produce la reproducción asexual mediante las llamadas
conidiosporas (figura 2), que se desarrollan en estructuras denominadas conidios. Dentro de los
Ascomicetos se encuentran las especies de mohos productoras de las micotoxinas más relevantes,
pertenecientes a los géneros de Aspergillus, Fusarium, Penicillium y Alternaria (3).

Figura 2.Estructura productora de conidiosporas.

Fuente: tomada de Morales (3).

Los mohos Deuteromicetos son un grupo disperso y heterogéneo que comparten la única
característica de que no se conoce su fase sexual, probablemente perdida en su evolución. Un
ejemplo sería Aspergillus niger, por no conocer su teleomorfo (estadio reproductivo sexual) (3).

Las levaduras son organismos unicelulares que crecen en colonias viscosas en forma de círculos o
elipses (17). La mayoría de las levaduras son usualmente conocidas en la utilizan en la industria
alimentaria por su función en la fermentación para la producción de alimentos tan comunes como el
pan, la cerveza, el vino, la sidra entre otros, pero también pueden ser una de las principales causas
de alteración de los alimentos (10).

Las levaduras son organismos eucariotas, pero sin sistema fotosintético. Su pared celular está
compuesta de dos polisacáridos, el glucano y el manano. Pocas levaduras presentan hifas, sus células
se denominan conidios (18).

Figura 3: estructura de Candida. Fuente: tomada de Carrillo (17).

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Técnicas de identificación de mohos.

La identificación de mohos tradicionalmente se ha llevado a cabo por técnicas morfológicas. Una de
las técnicas más comunes en microbiología para la identificación de hongos es el examen de sus
características morfológicas, la estructura de la colonia, el color de su superficie o la textura. De esta
manera resulta sencillo diferenciar los hongos filamentosos de las levaduras, ya que los primeros
producen colonias aterciopeladas, en forma de algodón o bien pulverulentas, mientras que las
levaduras son húmedas, viscosas e incluso cremosas. Sin embargo, esta técnica de identificación es
inespecífica, no siempre es suficiente, especialmente cuando se requiere diferenciar entre especies
(19).

Además de este examen macroscópico, podemos hablar del análisis de sus características
microscópicas, ya que la morfología a estos niveles es constante y con pocas variaciones. Esta
técnica se basa tanto en la forma, como en la producción y ordenamiento de las esporas, siendo
necesario saber la disposición y tamaño de las hifas. Además, existen otras técnicas moleculares
distintas basadas en la concordancia genealógica llamadas Genealogical Concordance Phylogenetic
Species Recognition (GCPSR). Se conocen como las técnicas gold standard por la identificación de
una gran variedad de especies de mohos, sin embargo, son más laboriosas y requieren de
conocimientos técnicos especializados en comparación con otras técnicas utilizadas en la práctica
clínica diaria que recientemente se han utilizado en algunos estudios (20).

Una de las técnicas recientemente utilizadas es el espectrómetro de masas ’’Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry’’. Se denomina MALDI por sus siglas en
inglés, traducidas a ‘’desorción/ionización mediante láser asistida por matriz’’, mientras que TOF
sería ‘’Time of Flight’’ (tiempo de vuelo) y MS ‘’Mass Spectrometry’’ (espectrometría de masas).
MALDI-TOF es una técnica de ionización suave que permite la identificación de biomoléculas, en
este caso se trata de proteínas ribosomales de los hongos. El uso de MALDI-TOF para la
identificación de mohos está aumentando, debido a que las técnicas de identificación morfológicas
no son suficientes en mohos sin esporulación. Este incremento del uso de MALDI-TOF provoca que
se publiquen con mayor frecuencia estudios de los métodos de extracción de proteínas ribosomales,
necesarios en los ensayos de identificación de mohos. Estos procedimientos se basan principalmente
en etapas inactivación, lavado, para prevenir la contaminación potencial de los laboratorios y la
extracción secuencial de proteínas con distintos solventes (21). Así mismo, recientemente esta

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

técnica ha suscitado un creciente interés en la identificación de mohos de origen clínico (21) (22)
(23).

De acuerdo a la bibliografía consultada, se han propuesto tres formas de extracción de proteínas

ribosomales para la identificación de mohos por MALDI-TOF:
- Extracción con agua-ácido fórmico (20).
- Extracción con perlas de zirconio: este método se basa en la fricción de las perlas de zirconio
con la pared celular del hongo para poder llegar a las proteínas ribosomales (21).
- Extracción con caldo Sabouraud-etanol-acetonitrilo-ácido fórmico, denominada extracción
larga: la diferencia con los otros dos procedimientos es la incubación del micelio en caldo a
37ºC y agitación. Además de esta agitación, es conveniente agitar de forma manual y efusiva
los tubos, pues las esporas tienden a precipitar y esto no les permite reproducirse
adecuadamente (20).

El método de extracción así como el tiempo de incubación podrían ser los principales aspectos a
tener en cuenta que determinen el éxito de la identificación. Estos aspectos permitirán obtener un
espectro adecuado, necesario para la comparación con la base de datos que determinará el género y
la especie (20).

Definición de micotoxinas, tipos y cantidades.

Desde un punto de vista sanitario, el principal problema que puede ocurrir en la alteración del pan
debido al crecimiento de los mohos, es la producción de micotoxinas. Según la Organización Mundial
de la Salud (OMS), las micotoxinas son ‘’compuestos tóxicos producidos de forma natural por
algunos tipos de mohos’’. Existen multitud de esos compuestos en alimentos de consumo frecuente
como los cereales, frutas, frutos secos, especias… Sin embargo, las micotoxinas que causan en mayor
medida problemas de salud son: aflatoxinas, ocratoxina A (OTA), patulina, fumonisinas ,
zearalenona, nivalenol y deoxinivalenol (DON) (24).

Las micotoxinas en su gran mayoría son químicamente estables y permanecen en los procesos de
almacenamiento y procesado de los alimentos, incluso cuando son expuestos a altas temperaturas
por ejemplo el horneado. Por ello, es necesario aumentar la vigilancia durante el almacenamiento y
transporte para prevenir el crecimiento y desarrollo de mohos y por lo tanto la formación de las
micotoxinas (25).

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Las aflatoxinas son producidas por mohos llamados Aspergillus parasiticus y Aspergillus flavus. Entre
todas las micotoxinas, las aflatoxinas son las más tóxicas. Los alimentos más afectados son los
cereales, las semillas oleaginosas, especias y frutos secos. La intoxicación aguda, provocada por el
consumo de grandes dosis de aflatoxinas, se denomina aflatoxicosis. Esta puede ser mortal, afecta
principalmente al hígado, llegando a producir cáncer hepático. Además, se ha demostrado que
existen daños genéticos por esta intoxicación que derivan en otros tipos de cáncer (24).

La Ocratoxina A: varias especies de Aspergillus y Penicillium son las productoras de esta micotoxina.
Es muy común en cereales y sus productos derivados. Se forma en el proceso de almacenamientos
de los cereales. El órgano más afectado es el renal, aunque en humanos no se ha logrado llegar a esa
asociación, sí que existen indicios de daños renales demostrados. Puede tener efectos nocivos
también en el desarrollo fetal y en el sistema inmune (24).

Deoxinivalenol: la micotoxina DON proviene de la familia tricotecenos, producidas principalmente

por hongos del género Fusarium. Se encuentran en diferentes cereales, el DON específicamente se
asocia a menudo con el trigo (24).

Tras múltiples estudio de los datos disponibles tanto en la bibliografía como en las plataformas
científicas, el Comité Mixto FAO/OMS evaluó los riesgos para la salud para una ingesta máxima
tolerable de micotoxinas, estableciendo que los niveles máximos de estos compuestos son muy
bajos ya que poseen una gran toxicidad. Ese organismo estableció concentraciones máximas
permitidas en los productos de panadería a base trigo:
- Aflatoxinas un rango de 0,5-15 µg/kg (24).
- Ocratoxina, niveles de ingesta semanales tolerables de 120 ng/kg de peso corporal, según el
reglamento 1881/2006 (26).
- Deoxinivalenol, ingesta diaria tolerable de 1 µg/kg de peso corporal, según el reglamento
1881/2006 (26).

Objetivos.
Objetivo general:
Estudiar los diversos mohos aislados de distintos tipos de pan mediante técnicas de espectrometría
de masas.
Objetivos específicos:

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

- Comparar los distintos procedimientos de extracción de proteínas ribosomales para la

identificación de mohos a través de MALDI-TOF.
- Identificación de los distintos tipos de mohos mediante MALDI-TOF.

Materiales y métodos.

Preparación de las muestras.

La preparación de las muestras se llevó acabo siguiendo las indicaciones de Portales (2020) (4) y a
continuación se describe brevemente, se recogieron 4 tipos de pan de distintos establecimientos, el
pan fue recubierto con una película de papel, las muestras se procesaron antes de 4 horas desde su
recogida. En primer lugar se separó la corteza y la miga con ayuda de un cuchillo previamente
esterilizado a la flama. A partir de la corteza o de la miga con la ayuda del cuchillo, se cortó cada
parte en cubos de aproximadamente 1cmx1cm. A continuación, se pesaron 25 g tanto de corteza
como de miga, y cada uno se introdujo a una bolsa estéril con un filtro dentro. A esa bolsa se le
añadieron 225 ml de agua de peptona. Después se procede a la homogeneización de las muestras de
pan con el agua de peptona durante 3 minutos.

Figura 4: Proceso de separación de corteza y miga en panes. A: Corte longitudinal. B: Disminución de tamaño. C: división
de corteza y miga. D: reducción y homogeneización del tamaño de la miga. E: reducción y homogeneización del tamaño de
la corteza. Fuente: tomada de Portales (4).

Se sembraron 100 µl de las diluciones seriadas apropiadas en una placa Petri que contienen medio
de Dicloran-glicerol-cloranfenicol DG18 (Oxoid). Las placas se incubaron en oscuridad todas las

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

placas a temperatura de 20ºC durante 3-7 días. Los recuentos se realizaron en placas Petri que
contenían entre 30 y 300 colonias.

Preparación de los medios de cultivo.

Agua de peptona:
Se pesaron 0.1 g de peptona bacteriológica (VWR, BDH chemicals) que se diluyeron en 1000 ml de
agua destilada. Una vez disuelta la peptona esta se depositó en frascos de 250 ml. Finalmente, los
frascos que contenían el agua se esterilizaron en un autoclave (Selecta) a 125ºC durante 30 min.

Dicloran-glicerol-cloranfenicol (DG18):
Se pesaron 110 g de glicerol (Scharlau), que se depositaron en un matraz aforado de 500 ml,
posteriormente, se agregaron 15,75 g de DG18 (OXOID). Seguidamente, se enrasó con agua
destilada hasta alcanzar los 500 ml y disolvió con ayuda de un imán hasta que la mezcla se
homogeneizó. A continuación, se puso a un frasco de medio de cultivo, se introdujo en el
microondas hasta que hierva y se esterilizó en una autoclave (P SELECTA) a 125ºC durante 30 min.
Finalmente, el cultivo se lleva a una temperatura de 55ºC y de adiciona cloranfenicol (0,025 g
liofilizados restituidos con 6 ml de agua destilada estéril), se mezcló adecuadamente y se introdujo el
frasco con el medio de cultivo en un baño de agua caliente (P SELECTA) y vertió en placas Petri.

Identificación de mohos a través de MALDI TOF.

Para la identificación con MALDI-TOF, se hicieron crecer los mohos y las levaduras en DG 18,
durante 4-5 días, como criterio se estableció que el tamaño de la colonia fuera al menos 5 mm para
su correcta extracción proteica. Se utilizaron tres métodos de extracción de proteínas ribosomales:
- Extracción agua-ácido fórmico: Para llevar a cabo esta extracción se realizó una suspensión
del moho en 2 ml de agua Elix, previamente esterilizada, hasta alcanzar una turbidez de 4 en
la escala Mc Farland (Biomerieux). Los tubos se agitaron con ayuda de un agitador orbital
(Raypa) durante 15 minutos. Posteriormente, se colocó en cada pocillo de la placa de
ensayo2 µl de cada muestra. Las muestras se dejaron secar al aire a temperatura del
laboratorio, a continuación se agregó 1 l de ácido fórmico al 70%, se dejó secar al aire,
finalmente se adicionó 1l de matriz alfa-ciano-4-hidroxi-ácido cinámico (HCCA: Sigma) y
llevo al MALDI-TOF para su identificación.
- Extracción con perlas de zirconio: se pesaron 0,05g de perlas de zirconio de 0,1 mm
(BioSpec) de diámetro en un Eppendorf de 1,5 ml. Se añadió 500 l de etanol al 70%. A

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

continuación se recogió el micelio de una colonia de moho con ayuda de un asa de siembra,
se mezcló bien con el etanol y se agitó con un palillo de madera estéril. Seguidamente, se
agitó durante 5 minutos aproximadamente con ayuda de un vortéx y se centrifugó con
ayuda de una centrífuga (Eppendorf) durante 3 minutos a una velocidad de 13000 rpm. Una
vez centrifugado, se retiró el sobrenadante y se introdujeron las muestras en un
termobloque (P Selecta) a 37ºC para secarlas. Una vez secas, se agregó 50 l de ácido
fórmico al 70% y se agitaron durante 15 minutos. Por último, se adicionaron 50 l de
Acetonitrilo (Sigma), se agitó nuevamente y se centrifugó durante 3 minutos a 13000 rpm. 1
l del sobrenadante se colocó en los pocillos de la placa de ensayo. Por último, se agregó 1
l de la misma matriz señalada en el método anterior.
- Extracción con caldo Sabouraud-etanol-acetonitrilo-ácido fórmico (extracción larga): Se
recogió con ayuda de un asa de siembra el micelio de una colonia que tenía un tamaño de 5
mm de diámetro aproximadamente, crecida en DG18 y se inoculó en 5 ml de caldo
Sabouraud (VWR Chemicals). Los tubos del caldo se incubaron durante 48 h o 72 h (hay
algunas colonias que necesitan más tiempo de incubación para crecer correctamente) en
agitación 120 rpm a 37ºC. Pasado el tiempo de incubación, se recogió 1 ml del medio con
suficiente micelio y se depositó en un tubo de centrífuga (Eppendorf). Seguidamente se
centrifugó a 13500 rpm durante 3 minutos y se retiró el sobrenadante. Posteriormente se
agregó 1 ml de agua Elix previamente esterilizada. Se agitó en un vórtex durante un minuto
cada después se centrifugó a 13500 rpm durante 3 minutos y se retiró el sobrenadante. Para
llevar a cabo la precipitación de las proteínas se agregaron 300 l de agua Elix y 900 l de
etanol absoluto (99%, Sigma). A continuación, se agitó con ayuda de un agitador durante un
minuto y se centrifugó a 13500 rpm durante 3 minutos y se retiró el sobrenadante. Este paso
lo consideramos como un punto crítico, ya que se necesita retirar todo el excedente de
etanol para la correcta extracción. Si hay un exceso de etanol, se realiza un centrifugado a
mayores y se quita el sobrenadante con pipetas de menor calibre para lograr una mayor
exactitud. Se secaron las muestras con ayuda de un termobloque (P Selecta) a 37ºC durante
aproximadamente 45 minutos o una hora. Una vez secas, se añadió entre 15-20 l de ácido
fórmico (70%), dependiendo del tamaño del pellet. Finalmente, se agitó con ayuda de un
agitador durante un minuto y se añadió la misma cantidad de acetonitrilo en cada
Eppendorf. Por último, se centrifugó bajo las mismas condiciones mencionadas
anteriormente. Se recogió 1 l sobrenadante de cada muestra para colocarlo en los pocillos
de la placa de ensayo.

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

El programa utilizado en la medición de los espectros de masas fue Flex Control (versión 3.1; Bruker
Daltonik). Se realizó una calibración previa a la obtención del espectro de masas con un estándar
preparado a partir de proteínas ribosomales de Escherichia coli DH5. Posteriormente, se comprobó
si los picos del espectro generado en esta calibración coincidían con el integrado en la biblioteca del
programa MALDI Biotyper (versión 3.1). Seguidamente, se seleccionó y se guardó el método con el
que el programa MALDI Biotyper usó de referencia en el análisis de las muestras. La identificación de
las muestras depositadas en los pocillos de la placa de ensayo se realizó de forma automática tras
haber seguido los pasos iniciales.

Los espectros obtenidos en cada muestra analizada se compararon con los espectros de la base de
datos de la biblioteca del programa MALDI Biotyper. A partir de estos espectros se obtuvo una
puntuación o score, según lo indicado por el proveedor (Bruker Daltonik), que clasifica con un
semáforo de colores el género y la especie en función del valor obtenido (Tabla 2).

SCORE PROBABILIDAD
0.000-1.699 Identificación no fiable.
1.700-1.999 Probable identificación de género.
2.000-2.299 Identificación de género segura, identificación probable de especie.
2.300-3.000 Alta probabilidad de identificación de especie.
Tabla 2. Interpretación del score generado por el programa MALDI Biotyper (Bruker Daltonik). Elaboración propia

Todos los análisis de las muestras se han realizado por duplicado.

Análisis de resultados
La comparación de la identificación de mohos se llevó a cabo con el programa Excel (Ofrece, 2019) y
el análisis de la comparación de medias se llevó a cabo por el análisis de varianza de una vía con
ayuda del programa SPSS Statistics Versión 24.

Resultados y discusión.
En la Tabla 3, se puede observar el recuento de mohos de diversos tipos de pan obtenidos de
obradores artesanales y de industrias. Los valores medio de mohos presentes en el pan industrial se
situaron entre 0,50 y 1.39 Log ufc/g, mientras el pan artesanal mostro unos valores de 0,42 ± 1,851

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Log ufc/g. Además no se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre la corteza y la miga, ni
entre los tipos de panes. El recuento de mohos fue mayor en las cortezas que en las migas de todos
los panes excepto en la barra integral que fue superior en la miga que en la corteza. La corteza del
pan candeal elaborado fue el que presentó mayor recuento de mohos 1,85 Log ufc/g. La presencia
de mohos en el pan, en la circunstancia que se almacene a 4ºC puede permitir el crecimiento de
algunas especies de mohos clasificados como moderadamente xerófilos, mohos cuya actividad de
agua crecen por debajo de 0,85 aw como indica Rico-Munoz et al 2017 (13). De acuerdo a Portales
(2020) (4), el pan candeal artesano tiene en promedio 0,836 de aw valores que puede permitir el
crecimiento de los mencionados mohos.

Mohos Mohos
Tipo de pan Localización Tipo de pan Localización
Log10 UFC/g Log10 UFC/g

Artesanal Industrial

Barra Corteza 1,01 ± 1,16 a Barra Corteza 1,39 ± 0,95 a

Miga 0,91 ± 1,05 a Miga 0,92 ± 1,07 a

Barra integral Corteza 1,20 ± 1,38 a Barra integral Corteza 1,02 ± 1,18 a

Miga 1,12 ± 1,32 a Miga 1,39 ± 0,96 a

Pan candeal Corteza 1,85 ± 0,21 a Pan candeal Corteza 0,50 ± 1,00 a

Miga 0,85± 1,20 a Miga 0,51 ± 1,02 a

Pan de molde Corteza 0,85 ± 0,98 a Pan de molde Corteza 1,27 ± 0,85 a

Miga 0,42 ± 0,85 a Miga 0,92 ± 1,07 a

a-e
Columnas con distintas letras indica diferencias significativas (p < 0,05).
Tabla 3. Recuento de mohos aislados de diversos tipos de pan separando miga y corteza. Elaboración propia.

En la Figura 5, se recogen los resultados de la identificación de 21 cepas de mohos aislados de pan a

través de MALDI-TOF, utilizando tres métodos de extracción de proteínas ribosomales (extracción
larga, extracción de perlas de zirconio y extracción agua-ácido fórmico). El nombre de las especies de
mohos que se encuentran en la figura son aquellas que presentaron la puntuación más alta
independientemente del método de extracción utilizado. Las cepas CE, CNE, CB, MV, MB no se
identificaron con la extracción de agua-ácido fórmico, sino que se identificaron únicamente con el
método de extracción de perlas de zirconio y el método de extracción larga. La puntuación de
identificación establecida por Bruker (27) que determina el límite de detección a nivel de género es
1,7. Teniendo en cuenta este criterio podemos observar que 6 de las 21 cepas no lograron ser
identificadas con ningún método de extracción. Este hecho pudo deberse a dos posibles situaciones:
i) que el tipo de moho no se encuentre recogida en la base de datos utilizada durante la
identificación y ii) que la cantidad de proteínas extraídas no haya sido suficiente. Las puntuaciones
más altas se obtuvieron con el método de extracción larga; este hecho permitió identificar el mayor

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

número de cepas de mohos a partir del método mencionado. La extracción con perlas zirconio fue el
segundo método que mostró mejores resultados. Incluso identificó alguna cepa que no se logró
identificar con la extracción larga, como por ejemplo las cepas CB y MB. Finalmente, la extracción
con agua y ácido fórmico fue el método con menor número de cepas identificadas. Este tipo de
extracción sólo pudo identificar la cepa 2b como Candida solani. En este trabajo de investigación y
tomando como criterio la puntuación 1,7 los métodos de extracción larga y con perlas de zirconio
fueron coincidentes un 100% en la identificación a nivel de especie. Esta observación no coincide con
Visagie et al. (2014) (23), quienes indican que la identificación a través de MALDI-TOF puede tener
ciertas variaciones en las especies de un mismo género e incluso en los duplicados de la misma
especie. Las diferencias encontradas en este estudio y lo indicado por Visagie et al. (2014) (23)
pueden explicarse por el tipo de método de extracción utilizado en la identificación por MALDI-TOF.
Entre los tres métodos utilizados en este trabajo, las principales diferencias se observaron entre los
resultados obtenidos con la extracción agua-ácido fórmico y las otras dos extracciones. A través de la
extracción con agua y ácido fórmico se identificaron especies que no coincidían con los resultados
encontrados en las otras dos extracciones, como la cepa 1ra identificada como Filifactor villosus, la
cepa 15ra identificada como Arthrobacter ramosus y la cepa 27ra identificada como Pichia
occidentalis, que finalmente, las tres, resultaron ser identificadas como Penicillium chrysogenum.

Figura 5. Identificación de mohos aislados de pan en DG18 por MALDI-TOF utilizando diversos métodos de extracción.

Extracción larga: extracción proteica con agua, etanol, ácido fórmico y acetonitrilo. Perlas de zirconio: extracción de

proteínas con etanol, perlas de zirconio, ácido fórmico y acetonitrilo. Agua-ácido fórmico: extracción proteica con agua

y ácido fórmico. - - - Límite de detección para determinar género 1,7. Elaboración propia.

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

En la Figura 6, se recogen los porcentajes de identificación a nivel de especie por MALDI-TOF a partir
de los métodos de extracción con más fiabilidad y mejores resultados, la extracción larga y la
extracción con perlas de zirconio. La especie que se aisló con mayor frecuencia fue Penicillium
chrysogenum alcanzando un porcentaje de 33,3%. Las otras dos especies que se aislaron en mayor
número fueron identificadas como Aspergillus niger y Penicillium camemberti con un porcentaje de
14,3%, en ambos casos. En menores porcentajes se identificaron Filifactor villosus y Candida solani,
ambos con un 4,8%. En este estudio, los dos géneros mejor identificados fueron Aspergillus spp y
Penicillium spp. Estos resultados coinciden con lo descrito por Morales (3), quien indica que estos
dos géneros junto al género Fusarium spp son los más comunes en la naturaleza e importantes,
desde el punto de vista inocuidad, debido a su carácter tóxico en la formación de micotoxinas. Sin
embargo, Morales (3) indica que la especie micotoxigénica por excelencia es Aspergillus flavus
debido a la formación de aflatoxinas y Penicillium verrucosum que produce OTA.

Figura 6. Principales especies de mohos identificados por MALDI-TOF usando dos métodos de extracción: extracción larga y
perlas de zirconio. Elaboración propia.

La mayoría de las especies de mohos identificadas en este trabajo de investigación, ver Figura 6, no
se han relacionado con la producción micotoxinas. Reiβ et al. (1982) (28) mencionan que Penicillium
chrysogenum puede producir micotoxinas en el pan, como la citrina, tanto en la corteza como en la
miga ya que puede crecer tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Cabe destacar que Penicillum
spp, Aspergillus spp son los géneros responsable de la alteración de los productos horneados como
el pan. (5) (14)

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Respecto al porcentaje de cepas aisladas no identificada, cabe resaltar que en este estudio no se
pudo identificar el 28,6% de las cepas de mohos aisladas de pan. Comparando los dos métodos con
mayor número de cepas identificadas, el método la extracción larga fue el método que presentó un
mayor porcentaje de cepas no identificadas, 42,8%, en comparación con el método de extracción
con perlas de zirconio que no identificó un 62%. Este porcentaje fue superior al obtenido por Luethy
et al. (2018) (21), quienes obtuvieron un porcentaje de 12,26% de cepas que no superaron el límite
de identificación de género impuesto por Bruker (27). Luethy et al., (2018) (21) también encuentran
un mayor porcentaje de cepas sin identificar en comparación con el estudio de Lau et al., (2013) (22)
realizado en el mismo laboratorio, esos autores mencionan que la diferencia observada entre sus
resultados puede deberse a la inexperiencia en el manejo de los métodos de extracción.

En la Figura 7, se observan las diferencias morfológicas entre las fases de crecimiento de las cinco
principales especies de mohos identificadas mediante MALDI-TOF. Pasado un tiempo de 3 días de
incubación las colonias aisladas de las distintas cepas presentan un micelio generalmente blanco, a
excepción de Filifactor villosus que desde el inicio tiene color verde. Después de 7 días de incubación
se puede distinguir, ligeras diferencias, de cada cepa por sus características macroscópicas. Filifactor
villosus se presenta en colonias verdes oscuras con la disposición de su micelio más compacto en
comparación a otras especies de mohos. Aspergillus niger se caracteriza por el color negro de su
micelio y su base blanca, además cabe destacar su facilidad de expansión en el medio de cultivo y de
dispersión de esporas por el aire, que le permite ser un moho con gran capacidad invasora (29). El
proceso de extracción para su correcta identificación se caracterizó por el momento de la recogida
de muestra, pues especialmente Aspergillus niger solo se logró identificar con un tiempo de
incubación inferior a 4 días. Esto se debe al engrosamiento de la pared celular de los mohos, que se
caracterizan por ser más rígidas que otras células vegetales, y esta cualidad se confirma a medida
que aumenta el tiempo de incubación de la cepa. Este hecho dificultó la extracción proteica para la
identificación de esta especie. En el proyecto de Prieto (2018) (30), donde se recogen los mismos
protocolos de extracción que los utilizados en este estudio, se indica con claridad que el tiempo de
incubación es un factor muy relevante para una identificación correcta. Candida solani se distingue
del resto por su textura húmeda y pastosa, ya que es una levadura unicelular. Esta cepa se logró
identificar con MALDI-TOF con los tres métodos de extracción utilizados en este estudio en el 100%
de las ocasiones que fue introducida para su análisis. Según Bader (2017) (31), las levaduras poseen
unas paredes celulares menos rígidas que las de los mohos. Por ello, la técnica de identificación a
través de MALDI-TOF podría ser utilizada adecuadamente para las levaduras, ya que el paso de
extracción en el que se rompen sus paredes es más sencillo. En otros estudios en los que se
comparan técnicas de identificación con reactivos colorimétricos y la técnica de MALDI-TOF, como el

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

de Idelevich (2014) (32), se obtuvieron resultados favorables de identificación alcanzando un 72,7%

de cepas identificadas de Candida spp. y utilizando la técnica de sensibilidad colorimétrica frente a la
identificación con MALDI-TOF (62,5% de especies identificadas). El porcentaje de identificación de
Candida spp. en este estudio fue superior al obtenido en el estudio de Idelevich (2014) (32).
Penicillium chrysogenum se caracteriza por un color azul verdoso y una gran extensión por todo el
medio de cultivo. Como indica Visagie (2014) (23) en su estudio, la identificación a nivel especie de
Penicillium chrysogenum se basaba en la morfología de los mohos. Sin embargo, esta forma de
identificación puede inducir a error, ya que la morfología puede variar en función del medio de
cultivo, humedad del ambiente, temperatura o incluso de la luminosidad del lugar donde se cultiven.
Por ello, este hecho refleja la necesidad de la utilización de técnicas de identificación más complejas
como MALDI-TOF. La única especie de mohos identificada en este estudio que sus colonias
presentan unas características morfológicas distintas a las aceptadas regularmente es Penicillium
camemberti que debería presenta colonias de color blanco pero en este estudio a medida que creció
ese moho presento colonias de color azul-verdoso con colores blancos en los límites de las colonias.
Es posible que la técnica de MALDI-TOF no sea lo suficientemente específica para la identificación de
esta especie, otra posibilidad es que el medio de cultivo utilizado en este estudio (DG18), cambie las
características de las colonias como lo indica Visagie et al. (2014) (23), quien muestra que la
morfología de las colonias de especie del género Penicillium por ejemplo Penicillium crystallinum,
muestra coloraciones distintas dependiendo del medio de cultivo utilizado.

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Figura 7. Características morfológicas de las colonias crecidas a 3 y 7 días de incubación en DG18 de las principales especies
de mohos identificadas por MALDI-TOF. Elaboración propia.

En la Figura 8 se pueden muestran los espectros de masas obtenidos por la identificación a través de
MALDI-TOF de las siguientes especies: Candida solani (A), Penicillium chrysogenum (B), Aspergillus
niger (C) y Penicillium camemberti (D).

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

Figura 8. Espectros de masas obtenidos en la identificación de las principales cepas a través de MALDI-TOF. A. Candida
solani. B. Penicillium chrysogenum. C. Aspergillus niger. D. Penicillium camemberti. Eje de abscisas (m.z): Carga de masas.
Eje de ordenadas (a.i): Intensidad aparente. Elaboración propia.

Conclusiones.
Gracias al recuento de mohos de este estudio se evidencia la presencia de estos organismos en los
diversos tipos de pan, artesanales e industriales. El recuento de mohos era superior en las cortezas
que en las migas de todos los tipos de pan excepto en la barra integral.

El porcentaje de cepas identificadas fue dependiente del método de extracción utilizado, siendo el
método de extracción de agua-ácido fórmico la que menor porcentaje de mohos identificó y el
método de extracción larga fue el que permitió identificar un mayor número de cepas. Por ello, se
sugiere como primera opción el método de extracción larga o una combinación de este método de
extracción y el método de extracción con perlas de zirconio.

Las principales especies de las cepas de mohos aisladas de diversos tipos de pan, tanto de su corteza
como de su miga, fueron: Penicillium chrysogenum (33,3%), Penicillium camemberti (14,8%),
Aspergillus niger (14,8%), Candida solani (4,8%) y Filifactor villosus (4,8%). El tiempo de incubación

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

para la extracción de proteínas fue fundamental, el tercer día de incubación fue el tiempo idóneo
para una extracción adecuada de las proteínas ribosomales.

Las técnicas de identificación utilizadas en el pasado se presentan hoy en día como métodos
inespecíficos y que requieren de una gran experiencia en el laboratorio para realizar una
identificación adecuada. Los resultados de este estudio demuestran la utilidad de la técnica de
MALDI-TOF MS para la identificación de microorganismos como los mohos, de una forma rápida y
eficaz.

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 Identificación y caracterización de mohos aislados en diversos tipos de pan.

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